Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada por uma deficiência na enzima a- L-iduronidase (IDUA), que está envolvida na metabolização de heparan e dermatan sulfato. Existem três fenótipos clínicos, que vão desde a forma grave, Hurler, caracterizada por anormalidades esqueléticas, hepatosplenomegalia e retardo mental grave. O fenótipo intermediário é caracterizado por um envolvimento somático progressivo, incluindo disostose múltipla, com pouco ou nenhum comprometimento neurológico. Já no fenótipo leve, ou Scheie, está presente doença cardíaca valvular, opacificação da córnea, limitadas anormalidades esqueléticas, mas ausência de retardo mental. Neste estudo, investigamos um grupo de 25 pacientes, diagnosticados com a MPS I, que foram inicialmente analisados para 6 mutações recorrentes, (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P e Q70X). Os pacientes não genotipados, após a análise das mutações conhecidas, foram analisados por SSCP e, aqueles com um padrão de migração de SSCP anormal foram seqüenciados. A análise mutacional confirmou uma elevada prevalência de W402X e P533R (28% e 18%). Os seqüenciamentos resultaram na identificação de cinco mutações previamente conhecidas e cinco mutações novas. O genótipo foi completamente definido em 60% (15/25) dos pacientes brasileiros e 76% dos alelos foram determinados. Assim, o nosso estudo mostrou que apesar da prevalência de W402X e P533R na população brasileira com MPS I, há ainda um grande número de mutações únicas para cada pacientes MPS I, ressaltando as dificuldades rastreio de mutações para esta desordem em populações mistas. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency of the enzyme a- L-iduronidase (IDUA), which is involved in the breakdown of dermatan and heparan sulphates. There are three clinical phenotypes, ranging from the severe Hurler form characterized by skeletal abnormalities, hepatosplenomegaly and severe mental retardation, to the milder Scheie phenotype in which there is cardiac valve disease, corneal clouding, limited skeletal problems, but no mental retardation. The intermediate form of MPS I (Hurler/Scheie) is characterized by progressive somatic involvement, including dysostosis multiplex, with little or no intellectual dysfunction. In this study, we have investigated a group of 25 patients, diagnosed with the MPS I that were screened for 6 known mutations (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P and Q70X). Patients not genotyped, after the analysis of known mutations, were analyzed by SSCP and those with an abnormal SSCP migration pattern were sequenced. Mutational analysis confirmed a high prevalence of W402X and P533R (28% and 18%). Sequecing resulted in the identification of five known mutations and five previously unknown sequence changes. The genotype was fully defined in 60% (15/25) of Brazilian patients and 76% of alleles was determined. In addition, our study has show that, despite the prevalence of W402X and P533R in the Brazilian MPS I population, there is still a large number of mutations unique to individual MPS I patients, highlighting the difficulties of mutation screening for this disorder in mixed populations.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossomal. A enzima envolvida com essa doença é a a-L-iduronidase (IDUA), e suas alterações levam a depósitos dos glicosaminoglicanos heparan e dermatan sulfato. As características fenotípicas da doença compreendem entre outras características malformações ósseas, hepatoesplenomegalia, problemas cardíacos, opacidade da córnea e retardo mental. O tratamento de MPS I atualmente se baseia em reposição enzimática e transplante de medula óssea. Levando em conta que esses tratamentos ainda não levam a uma correção dos danos ao sistema nervoso central (SNC), há necessidade do desenvolvimento de novos tratamentos para MPS I. Ainda outro problema da MPS I é a falta de estudos sobre os danos fisiológicos resultantes, principalmente no SNC. Visando contribuir com estes pontos, nosso trabalho teve como objetivo (a) o desenvolvimento de três vetores virais para posteriores ensaios pré-clínicos de terapia gênica e (b) o detalhamento da caracterização fisiopatológica de camundongos representando um modelo para MPS I, enfocando alguns aspectos do SNC. Foram produzidos três vetores virais com o cDNA da IDUA humana. O vetor baseado no vírus da imunodeficiência humana (HIV), apesar de baixos títulos virais, foi capaz de aumentar em até 60 vezes a atividade da IDUA nas células transduzidas. Um segundo vetor, baseado no vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) foi capaz de transduzir células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea do modelo murino de MPS I, sendo assim ótima ferramenta para terapia gênica ex vivo. O terceiro vetor, baseado no vírus da imunodeficiência felina (FIV) mostrou funcionalidade inferior quando comparado aos outros sistemas virais, e deve ser aperfeiçoado para utilização terapêutica. A caracterização do modelo foi feita através do estudo da fosforilação de proteínas de neurofilamentos em diferentes estruturas do cérebro de camundongos MPS I. Os resultados mostraram, além de alterações na fosforilação direta das proteínas analisadas, uma hiperfosforilação na ERK1/2 de córtex e hipocampo. Depósitos de gangliosídeos foram investigados de forma individual no cerebelo, córtex, hipocampo e hipotálamo, sendo detectadas diferenças específicas para cada estrutura. Ainda foram realizados estudos da neurotransmissão glutamatérgica e com isso foi identificada uma diminuição na captação de glutamato em hipocampo e córtex nos camundongos MPS I, além de uma diminuição no binding para glutamato no hipocampo. Como conclusão desses estudos, foram desenvolvidos vetores eficientes para transferência do gene terapêutico e, adicionalmente, os danos fisiológicos causados pela doença no SNC foram melhor elucidados no modelo murino de MPS I. As informações obtidas aqui serão de grande importância principalmente quando associadas a ensaios de terapia gênica, pois as características encontradas no SNC podem ser usadas para acompanhamentos de ensaios préclínicos usando os vetores desenvolvidos no trabalho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a monogenic disease resulting from a defect in the gene that encodes the lysosomal hydrolase a-L-iduronidase (IDUA) and characterized by accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) heparan and dermatan sulfate. Phenotypic characteristics involve bone malformations, hepatosplenomegaly, heart problems, corneal opacity and mental retardation. Treatment of MPS I is currently based on enzymatic replacement and bone marrow transplantation. Since these treatments are not capable of correcting central nervous system (CNS) effects of the disease, new therapeutic approaches are needed. One of the problems in the investigation of MPS I is the paucity of studies about resulting physiological consequences, particularly those related to the CNS. Aiming to contribute to these aspects of MPS I, this study proposes (a) the development of three viral vectors to be used in gene therapy preclinical studies, and (b) the further investigation of physiopathological alterations in the CNS of a murine model of MPS I (MPS I mice). Three viral vectors, carrying the human IDUA gene, were produced. The vector based on the human immunodeficiency virus (HIV) was produced in low titers, but induced a 60-fold increase in the baseline activity of IDUA in transduced cells. A second vector, based on the Moloney murine leukemia virus (MoMLV), was capable to transduce mesenchymal stem cells isolated from the bone marrow of MPS I mice, representing an interesting tools for ex vivo gene therapy protocols. The third vector, was based on the feline immunodeficiency virus (FIV), was functionally inferior to the other two systems and needs optimization to be therapeutically useful. The model was characterized by the investigation of phosphorylation patterns of neurofilament proteins in different regions of the brain of MPS I mice. The results showed that, besides alterations in the direct phosphorylation profile of the proteins analyzed, ERK1/2 was hyperphosphorylated in the cortex and hippocampus. Ganglioside storage was individually investigated in the cortex, cerebellum, hippocampus and hypothalamus, and specific differences were observed for each structure. An analysis of glutamatergic neurotransmission was also performed. MPS I animals showed a decrease in the glutamate uptake in the cortex and hippocampus. In addition, glutamate binding was decreased in the hippocampus. In conclusion, the present work resulted in the development of efficient viral vectors for the transfer of the therapeutic gene, and CNS physiological damages due to the disease were characterized in the murine model of MPS I. These results will be of great importance particularly when associated to gene therapy trials, since the CNS characteristics described in this work may be used for the follow-up of preclinical assays with the viral vectors developed.

Mucopolissacaridose do tipo I (MPS I) é uma doença de acúmulo lisossomal que leva a neurodegeneração e déficits neurológicos, entre outras conseqüências patológicas e clínicas. A ausência de estudos sobre parâmetros neurocomportamentais do modelo murino de MPS I capazes de avaliar sua função cognitiva motivou a realização deste trabalho. O primeiro nosso objetivo foi analisar parâmetros cognitivos que possam ser utilizados na avaliação de diferentes terapias e seus efeitos sobre o SNC. Durante a exploração do campo aberto, camundongos MPS I (Idua-/-) adultos mostraram locomoção e ansiedade normais, mas reduzido número de rearings. Camundongos Idua-/- tiveram uma performance normal no reconhecimento de objeto novo e mostraram memória de curta duração de esquiva inibitória normal. Entretanto a memória de longa duração de esquiva inibitória estava prejudicada. O déficit observado na esquiva inibitória não pode ser atribuído a redução na reatividade ao choque. Os resultados indicam que camundongos Idua-/- apresentam um déficit na memória de longa duração para treinamento aversivo e comportamento exploratório. O segundo objetivo foi avaliar biomarcadores de estresse oxidativo neste modelo animal. Nós avaliamos atividade enzimática antioxidante, dano a proteínas e peroxidação lipídica no telencéfalo, cerebelo, coração, pulmão, diafragma, fígado, rim, e baço. De oito órgãos analisados, sete tiveram alteração em no mínimo um parâmetro. Os resultados indicam que camundongos Idua-/- podem estar sofrendo estresse oxidativo. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a lysosomal storage disease that leads to neurodegeneration and neurological deficits, among other pathological and clinical consequences. The absence of behavioral parameters from the MPS I mouse model motivated the accomplishment of this work. Our first objective was to analyze behavioral parameters that might be used to essay the effect of different therapies on the CNS. During exploration of an open field, adult MPS I (Idua-/-) mice showed normal locomotion and anxiety, but reduced number of rearings. Idua-/- mice performed normally in a novel object recognition memory task and showed normal short-term retention of inhibitory avoidance training. By contrast, long-term retention of inhibitory avoidance was impaired. The deficit in inhibitory avoidance memory could not be attributed to reduced footshock reactivity. The results indicate that Idua-/- mice present deficits in long-term memory for aversive training and reduced exploratory behavior. The second aim was to evaluate oxidative biomarkers on this mice model. We evaluated antioxidant enzymatic activity, protein damage and lipid peroxidation on forebrain, cerebellum, heart, lung, diaphragm, liver, kidney and spleen. From eight analyzed organs, seven had alteration on at least one parameter. The results indicate that Idua-/- mice can be under oxidative stress.

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Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada por uma deficiência na enzima a- L-iduronidase (IDUA), que está envolvida na metabolização de heparan e dermatan sulfato. Existem três fenótipos clínicos, que vão desde a forma grave, Hurler, caracterizada por anormalidades esqueléticas, hepatosplenomegalia e retardo mental grave. O fenótipo intermediário é caracterizado por um envolvimento somático progressivo, incluindo disostose múltipla, com pouco ou nenhum comprometimento neurológico. Já no fenótipo leve, ou Scheie, está presente doença cardíaca valvular, opacificação da córnea, limitadas anormalidades esqueléticas, mas ausência de retardo mental. Neste estudo, investigamos um grupo de 25 pacientes, diagnosticados com a MPS I, que foram inicialmente analisados para 6 mutações recorrentes, (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P e Q70X). Os pacientes não genotipados, após a análise das mutações conhecidas, foram analisados por SSCP e, aqueles com um padrão de migração de SSCP anormal foram seqüenciados. A análise mutacional confirmou uma elevada prevalência de W402X e P533R (28% e 18%). Os seqüenciamentos resultaram na identificação de cinco mutações previamente conhecidas e cinco mutações novas. O genótipo foi completamente definido em 60% (15/25) dos pacientes brasileiros e 76% dos alelos foram determinados. Assim, o nosso estudo mostrou que apesar da prevalência de W402X e P533R na população brasileira com MPS I, há ainda um grande número de mutações únicas para cada pacientes MPS I, ressaltando as dificuldades rastreio de mutações para esta desordem em populações mistas. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency of the enzyme a- L-iduronidase (IDUA), which is involved in the breakdown of dermatan and heparan sulphates. There are three clinical phenotypes, ranging from the severe Hurler form characterized by skeletal abnormalities, hepatosplenomegaly and severe mental retardation, to the milder Scheie phenotype in which there is cardiac valve disease, corneal clouding, limited skeletal problems, but no mental retardation. The intermediate form of MPS I (Hurler/Scheie) is characterized by progressive somatic involvement, including dysostosis multiplex, with little or no intellectual dysfunction. In this study, we have investigated a group of 25 patients, diagnosed with the MPS I that were screened for 6 known mutations (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P and Q70X). Patients not genotyped, after the analysis of known mutations, were analyzed by SSCP and those with an abnormal SSCP migration pattern were sequenced. Mutational analysis confirmed a high prevalence of W402X and P533R (28% and 18%). Sequecing resulted in the identification of five known mutations and five previously unknown sequence changes. The genotype was fully defined in 60% (15/25) of Brazilian patients and 76% of alleles was determined. In addition, our study has show that, despite the prevalence of W402X and P533R in the Brazilian MPS I population, there is still a large number of mutations unique to individual MPS I patients, highlighting the difficulties of mutation screening for this disorder in mixed populations.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossomal. A enzima envolvida com essa doença é a a-L-iduronidase (IDUA), e suas alterações levam a depósitos dos glicosaminoglicanos heparan e dermatan sulfato. As características fenotípicas da doença compreendem entre outras características malformações ósseas, hepatoesplenomegalia, problemas cardíacos, opacidade da córnea e retardo mental. O tratamento de MPS I atualmente se baseia em reposição enzimática e transplante de medula óssea. Levando em conta que esses tratamentos ainda não levam a uma correção dos danos ao sistema nervoso central (SNC), há necessidade do desenvolvimento de novos tratamentos para MPS I. Ainda outro problema da MPS I é a falta de estudos sobre os danos fisiológicos resultantes, principalmente no SNC. Visando contribuir com estes pontos, nosso trabalho teve como objetivo (a) o desenvolvimento de três vetores virais para posteriores ensaios pré-clínicos de terapia gênica e (b) o detalhamento da caracterização fisiopatológica de camundongos representando um modelo para MPS I, enfocando alguns aspectos do SNC. Foram produzidos três vetores virais com o cDNA da IDUA humana. O vetor baseado no vírus da imunodeficiência humana (HIV), apesar de baixos títulos virais, foi capaz de aumentar em até 60 vezes a atividade da IDUA nas células transduzidas. Um segundo vetor, baseado no vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) foi capaz de transduzir células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea do modelo murino de MPS I, sendo assim ótima ferramenta para terapia gênica ex vivo. O terceiro vetor, baseado no vírus da imunodeficiência felina (FIV) mostrou funcionalidade inferior quando comparado aos outros sistemas virais, e deve ser aperfeiçoado para utilização terapêutica. A caracterização do modelo foi feita através do estudo da fosforilação de proteínas de neurofilamentos em diferentes estruturas do cérebro de camundongos MPS I. Os resultados mostraram, além de alterações na fosforilação direta das proteínas analisadas, uma hiperfosforilação na ERK1/2 de córtex e hipocampo. Depósitos de gangliosídeos foram investigados de forma individual no cerebelo, córtex, hipocampo e hipotálamo, sendo detectadas diferenças específicas para cada estrutura. Ainda foram realizados estudos da neurotransmissão glutamatérgica e com isso foi identificada uma diminuição na captação de glutamato em hipocampo e córtex nos camundongos MPS I, além de uma diminuição no binding para glutamato no hipocampo. Como conclusão desses estudos, foram desenvolvidos vetores eficientes para transferência do gene terapêutico e, adicionalmente, os danos fisiológicos causados pela doença no SNC foram melhor elucidados no modelo murino de MPS I. As informações obtidas aqui serão de grande importância principalmente quando associadas a ensaios de terapia gênica, pois as características encontradas no SNC podem ser usadas para acompanhamentos de ensaios préclínicos usando os vetores desenvolvidos no trabalho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a monogenic disease resulting from a defect in the gene that encodes the lysosomal hydrolase a-L-iduronidase (IDUA) and characterized by accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) heparan and dermatan sulfate. Phenotypic characteristics involve bone malformations, hepatosplenomegaly, heart problems, corneal opacity and mental retardation. Treatment of MPS I is currently based on enzymatic replacement and bone marrow transplantation. Since these treatments are not capable of correcting central nervous system (CNS) effects of the disease, new therapeutic approaches are needed. One of the problems in the investigation of MPS I is the paucity of studies about resulting physiological consequences, particularly those related to the CNS. Aiming to contribute to these aspects of MPS I, this study proposes (a) the development of three viral vectors to be used in gene therapy preclinical studies, and (b) the further investigation of physiopathological alterations in the CNS of a murine model of MPS I (MPS I mice). Three viral vectors, carrying the human IDUA gene, were produced. The vector based on the human immunodeficiency virus (HIV) was produced in low titers, but induced a 60-fold increase in the baseline activity of IDUA in transduced cells. A second vector, based on the Moloney murine leukemia virus (MoMLV), was capable to transduce mesenchymal stem cells isolated from the bone marrow of MPS I mice, representing an interesting tools for ex vivo gene therapy protocols. The third vector, was based on the feline immunodeficiency virus (FIV), was functionally inferior to the other two systems and needs optimization to be therapeutically useful. The model was characterized by the investigation of phosphorylation patterns of neurofilament proteins in different regions of the brain of MPS I mice. The results showed that, besides alterations in the direct phosphorylation profile of the proteins analyzed, ERK1/2 was hyperphosphorylated in the cortex and hippocampus. Ganglioside storage was individually investigated in the cortex, cerebellum, hippocampus and hypothalamus, and specific differences were observed for each structure. An analysis of glutamatergic neurotransmission was also performed. MPS I animals showed a decrease in the glutamate uptake in the cortex and hippocampus. In addition, glutamate binding was decreased in the hippocampus. In conclusion, the present work resulted in the development of efficient viral vectors for the transfer of the therapeutic gene, and CNS physiological damages due to the disease were characterized in the murine model of MPS I. These results will be of great importance particularly when associated to gene therapy trials, since the CNS characteristics described in this work may be used for the follow-up of preclinical assays with the viral vectors developed.

Mucopolissacaridose do tipo I (MPS I) é uma doença de acúmulo lisossomal que leva a neurodegeneração e déficits neurológicos, entre outras conseqüências patológicas e clínicas. A ausência de estudos sobre parâmetros neurocomportamentais do modelo murino de MPS I capazes de avaliar sua função cognitiva motivou a realização deste trabalho. O primeiro nosso objetivo foi analisar parâmetros cognitivos que possam ser utilizados na avaliação de diferentes terapias e seus efeitos sobre o SNC. Durante a exploração do campo aberto, camundongos MPS I (Idua-/-) adultos mostraram locomoção e ansiedade normais, mas reduzido número de rearings. Camundongos Idua-/- tiveram uma performance normal no reconhecimento de objeto novo e mostraram memória de curta duração de esquiva inibitória normal. Entretanto a memória de longa duração de esquiva inibitória estava prejudicada. O déficit observado na esquiva inibitória não pode ser atribuído a redução na reatividade ao choque. Os resultados indicam que camundongos Idua-/- apresentam um déficit na memória de longa duração para treinamento aversivo e comportamento exploratório. O segundo objetivo foi avaliar biomarcadores de estresse oxidativo neste modelo animal. Nós avaliamos atividade enzimática antioxidante, dano a proteínas e peroxidação lipídica no telencéfalo, cerebelo, coração, pulmão, diafragma, fígado, rim, e baço. De oito órgãos analisados, sete tiveram alteração em no mínimo um parâmetro. Os resultados indicam que camundongos Idua-/- podem estar sofrendo estresse oxidativo. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a lysosomal storage disease that leads to neurodegeneration and neurological deficits, among other pathological and clinical consequences. The absence of behavioral parameters from the MPS I mouse model motivated the accomplishment of this work. Our first objective was to analyze behavioral parameters that might be used to essay the effect of different therapies on the CNS. During exploration of an open field, adult MPS I (Idua-/-) mice showed normal locomotion and anxiety, but reduced number of rearings. Idua-/- mice performed normally in a novel object recognition memory task and showed normal short-term retention of inhibitory avoidance training. By contrast, long-term retention of inhibitory avoidance was impaired. The deficit in inhibitory avoidance memory could not be attributed to reduced footshock reactivity. The results indicate that Idua-/- mice present deficits in long-term memory for aversive training and reduced exploratory behavior. The second aim was to evaluate oxidative biomarkers on this mice model. We evaluated antioxidant enzymatic activity, protein damage and lipid peroxidation on forebrain, cerebellum, heart, lung, diaphragm, liver, kidney and spleen. From eight analyzed organs, seven had alteration on at least one parameter. The results indicate that Idua-/- mice can be under oxidative stress.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:37:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8177_1.pdf: 1211932 bytes, checksum: 3f95a468dc304085f30f296c9e0670a0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / O dicionário é uma obra de consulta que circula na sociedade, entre alunos e consulentes. É o acervo léxico-cultural de uma comunidade que possui um fim didático, auxiliando nos processos de leitura e escrita e análise lingüística. Nesta pesquisa, observamos como o minidicionário de língua portuguesa está utilizado nas salas de aula do Ensino Fundamental I, em escolas particulares e públicas, bem como nos livros didáticos utilizados nessas escolas. Foi observado que o dicionário é usado, em sala de aula, apenas como uma obra de consulta para as freqüentes dúvidas dos alunos sobre o significado e a ortografia das palavras. Excetuando-se o dicionário de língua portuguesa, quase não é usado outro tipo de dicionário; por vezes, são usados o de folclore ou um ilustrado. Após a doação dos dicionários pelo MEC às escolas públicas, os alunos puderam tirar suas dúvidas no momento em que surgissem e se sentiram mais motivados a pesquisar sobre as palavras, pois as obras lhes pertenciam. Através da escolha do professor, as maiores porcentagens dos exercícios mais recorrentes no livro didático e em sala de aula correspondem àqueles sobre a busca de significado de palavras inseridas num texto ou numa frase, e aos exercícios que fornecem ao aluno regras de utilização do dicionário. Ainda no livro didático, a estratégia discursiva com maior recorrência refere-se aos exercícios sobre o significado de palavras, a segunda maior corresponde àqueles que ensinam, através do dicionário, a ordem alfabética. Portanto, como vimos, o dicionário é considerado em sala de aula, por alunos, professores e livros didáticos, apenas como uma obra de consulta do significado e da ortografia das palavras

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Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El virus HTLV-I (Virus Linfotrópico humano Tipo I) es el agente etiológico de dos patologías principales, la Mielopatía asociada al HTLV-I/Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP), una axonopatía neurodegenerativa, donde existe falla en el transporte axonal y la Leucemia de células T del adulto (ATL). No se ha detectado infección por HTLV-I en neuronas, desconociéndose el mecanismo por medio del cual se produce la neurodegeneración en HAM/TSP. Puesto que el reservorio principal del virus son los linfocitos T CD4+, algunos productos virales secretados por estos linfocitos infectados infiltrados en el sistema nervioso central, podrían afectar vías de transducción de señales relacionadas con la reorganización de citoesqueletos y transporte axonal, produciendo el daño axonal de distal a proximal observado en pacientes HAM/TSP. Los productos secretados por células MT2 (linfocitos infectados con HTLV-I) provocan retracción en células de neuroblastoma SH-SY5Y diferenciadas y disminuyen la velocidad de crecimiento neurítico en células PC12 durante su diferenciación a tipo neuronal. Entre las proteínas virales secretadas, se encuentra Tax, la disminución de la velocidad de crecimiento neurítico en células PC12, podría estar mediada por esta proteína viral a través de la vía transduccional que involucra a semaforinas y sus receptores Plexinas. Como un ejemplo, en el caso de Sema3A-Plexin A, un aumento de la actividad de Cdk5 causa hiperfosforilación de Tau y CRMP-2. El fallo en el transporte axoplásmico, podría explicarse por una desregulación de la fosforilación de las subunidades de los motores moleculares kinesina KIF5 y dineína citoplasmática Dync en este escenario. En este trabajo, se propuso estudiar el efecto de los productos secretados desde linfocitos infectados que incluyen Tax sobre el proceso de diferenciación neuronal. Para esto, se utilizó la línea celular de feocromocitoma de rata, células PC12 diferenciables a tipo neuronal por acción de NGF. La Hipótesis planteada es la siguiente: “La exposición a productos secretados de linfocitos infectados por HTLV-I provoca un aumento en el estado de fosforilación de proteínas motoras en modelo neuronal de células PC12” El primer objetivo desarrollado, fue determinar si Tax es uno de los productos virales secretados desde medio de cultivo de células MT-2 responsable del efecto de retardo de crecimiento neurítico de PC12. La adición al cultivo celular de anticuerpos monoclonales anti-Tax mostró que se bloqueó este efecto de retardo de crecimiento, lo que apunta a que este efecto se debe a la acción de Tax presente en el medio de secreción de las células MT-2. El segundo objetivo, contempló estandarizar protocolos de inmunodetección selectivos para determinar las subunidades asociadas al control de funcionalidad de kinesina KIF5 y dineína citoplasmática en células PC12. Los análisis por Western blot mostraron que las cantidades de las subunidades de kinesina KIF5 (cadena pesada y liviana) y dineína citoplasmática (cadena intermedia) presentes en las células PC12, no varían durante el período de diferenciación estudiado. Esto significa, que Tax no estaría alterando su expresión proteica. El tercer objetivo planteado fue comparar el grado de fosforilación de las subunidades de proteínas motoras en células expuestas a productos secretados desde células MT-2 con la condición control con medio de cultivo de la línea celular K562. Al no disponer de anticuerpos contra las formas fosforiladas de estas proteínas motoras, se procedió a separarlas mediante la técnica de electroforesis de geles en dos dimensiones. Este objetivo requirió inicialmente estandarizar esta técnica y luego se emplearon las muestras de lisados de PC12 provenientes del tercer día de diferenciación que habían sido sometidas al medio condicionado MT-2 y al de K562. Estos análisis no mostraron diferencias significativas en las migraciones electroforéticas, que podrían dar cuenta de cambios del estado de fosforilación de estas subunidades motoras. No obstante, estos resultados no se puede descartar que existan diferencias en el grado de fosforilación de las subunidades de estos motores moleculares, puesto que las diferencias en el grado de fosforilación pueden ser muy menores para ser observadas como cambios en la migración electroforética. Se debiera usar un método inmunológico más sensible empleando anticuerpos que reconozcan fosforilaciones determinadas estas proteínas / Effect of secretable proteins from HTLV-I infected lymphocytes on phosphorylation of motor proteins in PC12 cells as a model of neuronal culture HTLV-I virus (Human T-cell lymphotropic virus type I) is the etiologic agent of two main pathologies, the Myelopathy associated to HTLV-I/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP), a neurodegenerative axonopathy with impairment of axonal transport, and the Leukemia of adult T-cells (ATL). No infection in neurons has been detected, being unknown the mechanisms of the neurodegeneration in HAM/TSP. Lymphocytes T-CD4+ represent the main reservoir of the virus. Therefore, some secreted products from these infected lymphocytes infiltrated into the central nervous system could produce alteration of signal transduction pathways related with cytoskeletons and axonal transport, thus accounting for the distal to proximal axonal damage observed in HAM/TSP patients. Secreted products from MT-2 cells (HTLV-I infected lymphopcytes cell line) produce retraction in differentiated neuroblastoma SH-SY5Y cells and reduced the rate of neurite growing during PC12 cell differentiation to neuronal type. Among the viral secretable proteins is Tax, hence, the reduction of PC12 neurite growing could be mediated by this viral protein through transduction signalings that involves semaphorins and their receptor Plexins. As an example, in the case of Sema3A-Plexin A, an increase in Cdk5 activity causes Tau and CRMP-2 hyperphoshorylations. The failure of axonal transport could be explained by deregulation of phosphorylation of molecular motor subunits kinesin KIF5 and cytoplasmatic dynein Dync. In this work it was proposed to study the effect of secreted products, including Tax, from infected lymphocytes on the neuronal differentiation process. We employed the rat pheochromocytoma cell line, PC12 cells during NGF-differentiation to neuronal type. The Hypothesis stated expresses that: “Exposure to secreted products from HTLV-I infected lymphocytes causes an increase in the phosphorylation state of motor proteins in a neuronal model of PC12 cells” The first goal developed was to determine if Tax was one of the viral secreted products to the culture medium of MT-2 cell line responsible of retardation of PC12 neurite growing. Addition to the cell culture monoclonal antibodies anti-Tax blocked the effect on retardation rate of neurite growing, this pointed to the action of Tax present in the secretion medium of MT-2 cells. The second goal consisted in the standardization of selective protocols for immunodetection of subunits associated with the functional control of kinesin KIF5 and cytoplasmic dynein present in PC12 cells. Western blots analyses showed that levels of kinesin KiF5 (heavy and light chains) and cytoplasmic dynein (intermediate chain) present in PC12 cells did not change during the followed period of differentiation. This result suggests that their protein expression is not altered by Tax. The third goal included the comparison of phosphorylation levels of the subunits of the motor proteins exposed to MT-2 cell secreted products with the control condition with K562 cell line medium. Due to non-availability of the antibodies against phosphorylated forms of motor proteins, we separated them by two-dimensional gel electrophoresis. This goal initially required the standardization of the technique, and then PC12 lysates obtained at third day of differentiation in the presence of either MT-2 or K562 cell culture medium were used. These analyses did not show significant differences in the electrophoresis migrations of KiF5 and dynein that could account for changes in the phosphorylation levels of these subunits of motor proteins. In spite of our results, it cannot be discarded the existence of differences in the phosphorylation degree of the molecular motor subunits because the differences in the phosphorylation degree could be minors and undistinguishable by electrophoretic migration changes. Thereby, it should be used more sensitive immunological methods employing antibodies capable of distinguish motor proteins phosphorylations