Infusões de células T e células NK (Natural Killer) de sangue periférico estão sendo realizadas para tratamento de malignidades. Os linfócitos propagados ex vivo, em normóxia (20% O2), são intravenosamente infundidos e precisam sobreviver a hipóxia associada a circulação venosa, da medula óssea (5% O2) e do microambiente tumoral (1% O2). O objetivo principal deste estudo foi determinar a capacidade proliferativa das células humanas T e NK em normóxia (20% O2) versus hipóxia (1% O2), por 28 dias, utilizando uma célula apresentadora de antígeno artificial (aAPC) para propagação em grau clínico. As células T expostas a hipóxia cresceram 100 vezes menos que as células T cultivadas em normóxia, enquanto que houve uma diminuição de 1000 vezes na taxa proliferativa das células NK hipóxicas, que exibiram um aumento na apoptose bem como um prejuízo na citotoxicidade. Hipóxia também induziu uma diminuição na expressão dos receptores KIR, NCR e NKG2D das células NK. Nesta mesma condição, a produção de IL-2 e IFNγ nas células T estavam diminuídas, sendo que nas células NK esse efeito foi mais acentuado. Hipóxia aumentou a expressão de genes relacionados com apoptose, angiogênese e metabolismo glicolítico, os quais estavam moderadamente aumentados nas células T, mas profundamente super-regulados nas células NK. Os níveis de ATP nas células T foram muito similares em ambas as condições de oxigênio, mas intensamente diminuídos nas células NK cultivadas em hipóxia. Também se observou, que a expressão do miR-210 induzido por hipóxia, estava super regulada nas células NK hipóxicas correlacionando com a perda da expressão da molécula NCAM/CD56. Em conjunto, os resultados deste estudo demonstram um maior impacto da hipóxia sobre as atividades proliferativas e citotóxicas das células NK estimuladas por aAPCs. Estudos adicionais são necessários para o entendimento do impacto deste comportamento das células NK em condições hipóxicas sobre a imunoterapia celular adotiva. / Infusions of T cells and natural killer (NK) cells from peripheral blood (PB) are being undertaken for the treatment of malignancies. Lymphocytes are propagated ex vivo in normoxia (20% O2) and intravenously infused and must survive hypoxia associated with venous blood and bone marrow (5% O2), and the tumor environment (1% O2). The objective this study was to determine the ability of T and NK cells to proliferate under normoxia (20% O2) versus hypoxia (1% O2) over 28 days using an artificial antigen presenting cells (aAPC) to propagate clinical-grade lymphocytes. T cells continuously exposed to 4 weeks of hypoxia grew at a rate of 100-fold less than T cells cultured in normoxia while the proliferative rate of NK cells lagged by 1,000-fold, behind normoxic conditions. Hypoxic cultured NK cells exhibit an increase in apoptosis as well as a correspondent impairment in cytotoxicity. In low oxygen tension the expression of KIR, NCR, and NKG2D receptors were decreased in NK cells. In hypoxia, the production of IL-2 and IFNγ were decreased in T cell and more so in NK cell. Chronic hypoxia increased the expression of related apoptosis, glycolytic metabolism and angiogenesis genes which were moderately increased in T cells but profoundly upregulated in NK cells. ATP levels in T cell were very similar in both oxygen conditions, but profoundly diminished in NK cells under hypoxia. We also noted that hypoxia inducible miR-210 levels are up regulated in hypoxic NK cells correlating with loss of CD56 expression. Taken together, this data show that a greater impact of hypoxia on proliferative and cytotoxic activity of NK cells activated by artificial antigen-presenting cells. More studies are needed to understand the impact of this behavior on the cell adoptive immunotherapy.

The aim of my thesis is the introduction of the systemic mastocytosis and discussion about results of allergen immunotherapy in patients with systemic mastocytosis and its preventive effects against recurrent anaphylactic reactions. Patients with systemic mastocytosis are more prone to severe systemic anaphylactic reactions after Hymenoptera stings than in the general insect venom allergic population patients without elevated basal tryptase. This severe reaction can result in the death of the patient, it is important to prevent it prophylactically. The medication of choice in insect venom allergic patients is hyposensibilization therapy - allergen immunotherapy, which uses venom allergens of causal Hymenoptera (honey bee, yellow jacket). The thesis aims to summarize the results obtained so far about the appropriateness of this treatment in patients with systemic mastocytosis, side-effects during VIT, optimal dosing schedule and duration of treatment in these patients.

A hipersensibilidade a veneno de Hymenoptera representa importante problema do ponto de vista de saúde da população, uma vez que pacientes alérgicos aos componentes do veneno podem desenvolver reações graves, às vezes fatais. A única profilaxia efetiva em pacientes sensibilizados é a imunoterapia veneno específica. Objetivos: avaliar as evidências científicas a respeito dos efeitos da imunoterapia específica utilizada na profilaxia secundária das reações graves em pacientes sensibilizados a veneno de Hymenoptera, por meio da realização de uma revisão sistemática. Métodos: a estratégia de busca seguiu as recomendações do Grupo de Pele da Colaboração Cochrane. A pesquisa foi realizada nas seguintes bases de dados: MEDLINE, the Cochrane Central Register of Controlled Trials (CENTRAL, The Cochrane Library), EMBASE, LILACS, SciSEARCH e nas referências de artigos mais relevantes. Todos os ensaios clínicos controlados e randomizados envolvendo imunoterapia com veneno de Hymenoptera versus imunoterapia com placebo ou apenas seguimento dos pacientes foram avaliados. Dois revisores de forma independente (ASW e LAMF) avaliaram a elegibilidade e a qualidade metodológica de cada ensaio clínico e extraíram os dados. O risco de reações sistêmicas, conseqüentes a ferroada acidental ou a teste de provocação com o inseto responsável, após a imunoterapia específica, foi avaliado por meio do cálculo do odds ratio e do respectivo intervalo de confiança de 95%. Resultados: 2267 resumos foram identificados. A maioria dos artigos foi excluída pelas seguintes razões: os estudos não eram controlados e randomizados ou não satisfaziam alguns critérios de inclusão. Apenas quatro estudos foram analisados. A idade dos pacientes variou entre dois e 65 anos. Apenas um estudo comparou imunoterapia com veneno de formiga contra placebo (Brown et al.) e três estudos (Hunt et al., Schubert et al. e Valentine et al.) comparam imunoterapia com venenos de abelha e vespa contra placebo ou seguimento de pacientes. Em cada estudo, o odds ratio para reações sistêmicas foi: Hunt et al.- Grupo I (veneno) x III (placebo): 0,10 (0,01 <OR < 0,68) Schubert et al.: 0,35 (0,05<OR<2,56); Valentine et al.: 0,16 (0,02 < OR < 1,21) e Brown et al.: 0,04 (0,01<OR<0,28). Após o teste de heterogeneidade, apenas dois estudos (Schuberth 1983 e Valentine 1990) se mostraram homogêneos o suficiente e assim puderam ser incluídos na meta-análise (p = 0,623). Ao combinar os dois estudos, o odds ratio passou a ser significativo: 0.29 (0.10 a 0.87). Entretanto, ao analisar a gravidade das reações ocorridas após a imunoterapia, observou-se que os benefícios podem não ser tão relevantes, pois as reações foram, na grande maioria, ou mais leves ou semelhantes à reação original. Conclusões: A imunoterapia específica deve ser recomendada para adultos que apresentaram reações sistêmicas e para crianças com reações moderadas a graves, porém não é necessária em crianças que apresentaram apenas reações cutâneas após ferroada de abelha ou vespa, principalmente se a exposição for esporádica. / Background: Hymenoptera venom hypersensitivity is a significant public health problem. For patients who are allergic to components of the venom, reactions can be severe and sometimes fatal. The only effective treatment in the management of those patients is the specific venom immunotherapy. Objective: to assess the effects of the specific venom immunotherapy for Hymenoptera venom hypersensitivity through a systematic review. Methods: the standard search strategy of the Cochrane Skin Group was used for searches of electronic and other databases. These included MEDLINE, the Cochrane Central Register of Controlled Trials (CENTRAL, The Cochrane Library), EMBASE, LILACS, SciSEARCH and the references of relevant articles. All randomized controlled trials involving Hymenoptera venom immunotherapy versus immunotherapy with placebo or only follow-up of the patients were included. Two independent reviewers (ASW and LAMF) assessed the eligibility, and the methodological quality of each trial, and extracted the data. Post immunotherapy risk of systemic reactions after either challenge or accidental stings was calculated through the odds ratio and respective 95 percent confidence interval. Main results: 2,267 abstracts, identified through electronic sources, were assessed. Most articles were excluded for the following reasons: the studies did not satisfy all the inclusion criteria or they were not randomized controlled trials. Four studies were included on this review. The age of the participants varied between two and 65 years. Only one study compared ant venom immunotherapy with placebo (Brown et al.) and three studies (Hunt et al., Schubert et al. and Valentine et al.) compared bees and wasps immunotherapy with placebo or simply patient follow-up. In each study, the odds ratio to a systemic reaction was: Hunt et al.- Group I (venom) x III(placebo): 0,10 (0,01 < OR < 0,68) Schubert et al.: 0,35 (0,05 < OR < 2,56); Valentine et al.: 0,16 (0,02 < OR < 1,21) and Brown et al.: 0,04 (0,01 < OR < 0,28). After the heterogeneity test (p = 0,623), only two studies (Schuberth 1983 and Valentine 1990) were homogeneous enough as to be included in a meta-analysis. The summary odds ratio was 0.29 (IC 95%: 0.10 - 0.87). However, when the severity of the reaction occurring after the sting challenge or accidental sting was taken into account, the benefits were not so relevant because the reactions were, for the most, milder than the original one. Conclusions: The specific-venom immunotherapy must be recommended for adults with systemic reactions and for children with moderate to severe reactions, but there is no need to prescribe it for children who present only skin reactions after insects sting, particularly if the exposure is sporadic.

As células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígenos (APCs). Foi proposto que as DCs selecionam os Ags que serão apresentados em MHC-II baseado na presença de ligantes para TLR na partícula fagocitada. Contudo, esse fenômeno não foi estudado em classe I. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar se o acoplamento de Ags particulados a um agonista de TLR melhoraria a apresentação cruzada (AC) dos mesmos por DCs humanas tratadas com as moléculas acopladas. Nós vimos que a presença de um ligante de TLR no material fagocitado não contribuiu nem para a maturação do fagossomo, nem para a via endossômica de AC. A AC não envolve acidificação endossômica e depende de moléculas de MHC recém-sintetizadas do retículo endoplasmático. Nossos dados confirmam também a importância do estado de maturação das DCs para a indução de proliferação de LT CD8+, embora este não tenha sido associado com o nível de apresentação do complexo MHC-I/peptídeo, ou com as moléculas normalmente utilizadas para indicar a maturação das DCs. / Dendritic cells (DCs) are the main antigen presenting cells (APCs). It was proposed that DCs select the Ags that will be presented at their surfaces on class II based on the presence of a TLR-ligand on the cargo. However, the relevance of the coupling of the Ag to a TLR-ligand on class I was not yet addressed. Thus, the goal of this study was to investigate whether the coupling of particulate Ags to a TLR-agonist improve the cross-presentation (CP). We saw that the CP does not involve endosomal acidification and it relies on newly synthesized MHC-I molecules from the endoplasmic reticulum. Also, the presence of a TLR-ligand on the cargo neither contributed to the phagosome maturation nor to the endosomic route of CP. Furthermore, the maturation status of DCs was crucial for the induction of CD8+ T cells proliferation. Although the coupling of the Ag to the adjuvant has neither changed the expression of the markers related to maturation nor the presentation of the complex MHC-I/peptide at the DC surface, it affected its capacity of stimulating CD8+ T cells.

Infusões de células T e células NK (Natural Killer) de sangue periférico estão sendo realizadas para tratamento de malignidades. Os linfócitos propagados ex vivo, em normóxia (20% O2), são intravenosamente infundidos e precisam sobreviver a hipóxia associada a circulação venosa, da medula óssea (5% O2) e do microambiente tumoral (1% O2). O objetivo principal deste estudo foi determinar a capacidade proliferativa das células humanas T e NK em normóxia (20% O2) versus hipóxia (1% O2), por 28 dias, utilizando uma célula apresentadora de antígeno artificial (aAPC) para propagação em grau clínico. As células T expostas a hipóxia cresceram 100 vezes menos que as células T cultivadas em normóxia, enquanto que houve uma diminuição de 1000 vezes na taxa proliferativa das células NK hipóxicas, que exibiram um aumento na apoptose bem como um prejuízo na citotoxicidade. Hipóxia também induziu uma diminuição na expressão dos receptores KIR, NCR e NKG2D das células NK. Nesta mesma condição, a produção de IL-2 e IFNγ nas células T estavam diminuídas, sendo que nas células NK esse efeito foi mais acentuado. Hipóxia aumentou a expressão de genes relacionados com apoptose, angiogênese e metabolismo glicolítico, os quais estavam moderadamente aumentados nas células T, mas profundamente super-regulados nas células NK. Os níveis de ATP nas células T foram muito similares em ambas as condições de oxigênio, mas intensamente diminuídos nas células NK cultivadas em hipóxia. Também se observou, que a expressão do miR-210 induzido por hipóxia, estava super regulada nas células NK hipóxicas correlacionando com a perda da expressão da molécula NCAM/CD56. Em conjunto, os resultados deste estudo demonstram um maior impacto da hipóxia sobre as atividades proliferativas e citotóxicas das células NK estimuladas por aAPCs. Estudos adicionais são necessários para o entendimento do impacto deste comportamento das células NK em condições hipóxicas sobre a imunoterapia celular adotiva. / Infusions of T cells and natural killer (NK) cells from peripheral blood (PB) are being undertaken for the treatment of malignancies. Lymphocytes are propagated ex vivo in normoxia (20% O2) and intravenously infused and must survive hypoxia associated with venous blood and bone marrow (5% O2), and the tumor environment (1% O2). The objective this study was to determine the ability of T and NK cells to proliferate under normoxia (20% O2) versus hypoxia (1% O2) over 28 days using an artificial antigen presenting cells (aAPC) to propagate clinical-grade lymphocytes. T cells continuously exposed to 4 weeks of hypoxia grew at a rate of 100-fold less than T cells cultured in normoxia while the proliferative rate of NK cells lagged by 1,000-fold, behind normoxic conditions. Hypoxic cultured NK cells exhibit an increase in apoptosis as well as a correspondent impairment in cytotoxicity. In low oxygen tension the expression of KIR, NCR, and NKG2D receptors were decreased in NK cells. In hypoxia, the production of IL-2 and IFNγ were decreased in T cell and more so in NK cell. Chronic hypoxia increased the expression of related apoptosis, glycolytic metabolism and angiogenesis genes which were moderately increased in T cells but profoundly upregulated in NK cells. ATP levels in T cell were very similar in both oxygen conditions, but profoundly diminished in NK cells under hypoxia. We also noted that hypoxia inducible miR-210 levels are up regulated in hypoxic NK cells correlating with loss of CD56 expression. Taken together, this data show that a greater impact of hypoxia on proliferative and cytotoxic activity of NK cells activated by artificial antigen-presenting cells. More studies are needed to understand the impact of this behavior on the cell adoptive immunotherapy.

Meduloblastoma (MB) e Tumor Teratóide Rabdóide Atipico (TTRA) são tumores malignos do sistema nervoso central (SNC) que ocorrem na infância. Embora tenha havido um aumento na sobrevida, recorrência e metástases são frequentes e as opções terapêuticas poucas e tóxicas para crianças. Uma alternativa à terapia tradicional é a imunoterapia, que pode contornar os efeitos tóxicos associados à radioterapia e quimioterapia. De uma forma geral a imunoterapia depende da presença de antígenos associados a tumor (TAA) e/ou processamento de antígenos expressos pelo HLA classe I. No entanto, TAA para MB ou ATRT não estão bem definidos e tecidos neuronais tem a expressão de HLA classe I muito baixa. As células Natural Killer (NK) não dependem de TAA para citólise e são particularmente ativas na ausência de moléculas do HLA classe I tendo, portanto, potencial para o tratamento dessas doenças. Atualmente as barreiras para a aplicação clínica de células NK são quantitativas e qualitativas. Com o intuito de quebrar a barreira quantitativa foi criada uma plataforma tecnológica para a expansão das NK ex vivo. Essa plataforma consiste no co-cultivo de células mononucleares de sangue periférico com células apresentadoras de antígeno artificiais (aAPC), que expressam Interleucina 21 ligada à membrana. Com essa tecnologia foi possível expandir células NK na ordem de 40.000 vezes. Também foi demonstrada a persistência das células NK expandidas in vitro por 3 semanas após infusão em cérebro murino e que essas células expressam altos níveis de citocinas antitumorais e estimulantes do sistema imune: Interferon gama e Fator de Necrose Tumoral alfa. Finalmente, foi demonstrada a atividade citolítica das células NK tanto in vitro, contra um painel de células de MB e ATRT, quanto in vivo em um modelo murino de MB. Os resultados obtidos fornecem a primeira evidência pré-clínica que provê suporte ao uso de células NK expandidas usando essa plataforma tecnológica no combate a cânceres de cérebro pediátricos. Com base nesses dados, nosso grupo no MD Anderson Cancer Center iniciou um ensaio clínico fase I para testar a segurança e eficácia de administração locorregional de células NK expandidas usando aAPC para o tratamento de tumores pediátricos da fossa posterior do cérebro. / Medulloblastoma (MBs) and Atypical Teratoid/Rhabdoid Tumor (ATRT) are malignant pediatric brain tumors. Although survival has improved, recurrence and metastasis are frequent with few therapeutic options for these children. Immunotherapy is an alternative to traditional therapies that may circumvent the potential toxicities associated with traditional chemotherapy and radiation approaches. Many immune based therapies rely on the presence of tumor associated antigens (TAAs) and/or antigen processing and class I human leukocyte antigen (HLA I) expression. However, TAAs for MB are not well defined and neuronal tissues have very low HLA I expression. Natural killer (NK) cells do not rely on TAA for cytolysis and therefore have potential for the treatment of these diseases. The current barriers to clinical application of NK therapy are quantitative and qualitative. To overcome quantitative barriers, we have worked with a platform technology for the ex vivo expansion of NK cells through co-culture of peripheral blood mononuclear cells with artificial antigen presenting cells expressing membrane-bound IL-21 (mbIL21) to promote a 40,000-fold expansion of NK cells. We also demonstrate prolonged life-span of ex vivo expanded NK cells and persistence for up to 3 weeks post-infusion in the murine brain. These cells express high levels of immune stimulatory and anti-tumor cytokines - interferon gamma and TNF-alpha following activation. Finally we demonstrate NK cytolytic activity in vitro against a panel of primary and established ATRT and MB cells and in vivo following locoregional delivery in a mouse orthotopic model of MB. Our data provide the first pre-clinical evidence supporting the use of mbIL21 expanded NK cells against pediatric brain tumors. Based on this data we have initiated a novel Phase I clinical trial at MD Anderson Cancer Center to assess the safety and efficacy of locoregional delivery of mbIL21 expanded NK cells for the treatment of posterior fossa pediatric brain tumors.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_juliana_alcoforado_diniz.pdf: 1026827 bytes, checksum: f7e6dae0a1eabce2f815ea02d01d8e6a (MD5) Previous issue date: 2012-09-12 / Leptospirosis is a zoonosis caused by bacteria of the Leptospira genus. In recent years, efforts to identify immunogenic components of leptospires have resulted in the characterization of several outer membrane lipoproteins that are expressed during infection. Previously, our group had produced polyclonal IgY antibodies against whole-cell leptospires strain Fiocruz L1-130, which were used in different forms of capture ELISAs. In this study we produced and characterized IgY antibodies against LipL32 in recombinant form (rLipL32), the most abundant lipoprotein in the proteome of pathogenic leptospires, in order to use they in diagnostic assays and prophylaxis of leptospirosis. For this, two 22-week-old hens were immunized on day 0 with rLipL32 and oil adjuvant by intramuscular route. Three booster immunizations on days 14, 28 and 42 were held, and the eggs were collected daily from day 45. The yolks were processed and the antibodies purified with polyethylene glycol, and monitored by SDS-PAGE. Specificity of purified antibodies was assessed through indirect ELISA and Western blot (WB) using both rLipL32 and whole-cell Fiocruz L1-130. After standardization of the first batch of IgY, antibodies were conjugated with horseradish peroxidase and fluorescein (FITC). In addition, we conducted a passive immunoprotection assay in hamster model, using homologous and heterologous challenge. SDS-PAGE confirmed the successful purification of IgY and a batch with a concentration of 13μg.μL-1 was stored at -20ºC until use. Both IgY and IgY conjugated with horseradish peroxidase recognized the recombinant and native protein in ELISA and WB. In this study we produced and characterized successfully IgY against rLipL32. Although these antibodies have not been tested with clinical samples from humans or animals, they have antigen detecting potential for use in the diagnosis of leptospirosis. / A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias do gênero Leptospira. Nos últimos anos, esforços para a identificação de componentes imunogênicos nas leptospiras resultaram na caracterização de várias lipoproteínas de membrana externa que são expressas durante a infecção. Anteriormente, nosso grupo havia produzido IgY contra Leptospira interrogans cepa Fiocruz L1-130 inteira, a qual foi usada em diferentes formatos de ELISA de captura. No presente estudo, objetivamos produzir e caracterizar anticorpos IgY contra a proteína LipL32 na forma recombinante (rLipL32), a lipoproteína mais abundante no proteoma das leptospiras patogênicas, com intuito de utilizá-los posteriormente, no diagnóstico e na imunoprofilaxia da leptospirose. Para isso, duas galinhas com 22 semanas de idade foram imunizadas no dia 0 com rLipL32 e adjuvante oleoso, através da via intramuscular. Três outras imunizações foram realizadas nos dias 14, 28 e 42 e os ovos coletados diariamente a partir do dia 45. Os anticorpos foram obitidos através do processamento das gemas, purificados com polietilenoglicol e monitorados por SDS-PAGE. A especificidade dos anticorpos foi avaliada através de ELISA indireto e Western blot (WB), ambos utilizando rLipL32 e Fiocruz L1-130 inteira. Após a padronização do primeiro lote de IgY, os anticorpos foram conjugados com peroxidase e fluoresceína (FITC), e avaliados em um ensaio de imunização passiva em hamsters, com desafio homólogo e heterólogo. O SDS-PAGE confirmou o sucesso de purificação, e um lote de IgY com a concentração de 13μg.μL-1 foi estocado a -20ºC até o uso. A IgY pura e conjugada com peroxidase reagiram com as proteínas recombinante e nativa no ELISA e no WB. Nesse estudo, produzimos e caracterizamos com sucesso IgY contra rLipL32. Embora esses anticorpos não tenham sido testados com amostras clínicas de humanos e animais, eles possuem potencial para compor ensaios que visem a detecção do antígeno no diagnóstico da leptospirose.

Orientadores: Carlos Alberto Petta, Fernando Guimarães / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T09:37:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_PauloCesarMartins_M.pdf: 1689043 bytes, checksum: d194c0a2789183c6c8600428851acdbc (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo:A possibilidade de se gerar preparações de células efetoras enriquecidas com células natural killer (NK) de pacientes com câncer tem sido foco de estudos que buscam fontes de células efetoras autólogas para o tratamento de tumores humanos. Objetivos: O objetivo neste estudo foi avaliar a possibilidade de se expandir células NK a partir do sangue de pacientes com neoplasia de ovário, assim como o potencial citotóxico destas células. Sujeitos e métodos: Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 13 pacientes voluntárias com neoplasia de ovário, Grupo Benigno (n=7) e Grupo Maligno (n=6), foram cultivados em meio CellGro suplementado com anti-CD3 (20ng/ml, adicionado aos primeiros 10 dias), IL-2 ( 1000 UI / ml) e SFB (10%) por 21 dias. A ação citotóxica das preparações de células efetoras foi avaliada por citometria de fluxo utilizando como células alvo linhagens tumorais K562 e OVCAR3.Resultados: No Grupo Benigno, as células cultivadas por 21 dias apresentaram variação percentual positiva dos subtipos de linfócitos NK (17,1 ± 5,2%) e NK-T (10,4 ± 3,1%) associados à variação percentual negativa das células T (-6,2 ± 6,2 %). No Grupo Maligno, as células cultivadas por 21 dias apresentaram variação percentual positiva para todos os subtipos (NK 12,5 ± 6,0%, NK-T 4,2 ± 0,7% e T 15,3 ± 5,6%). As preparações de células enriquecidas com células NK, de ambos os grupos, foram citotóxicas contra as linhagens de células tumorais. A citotoxicidade foi significativamente (p <0,05) maior quando utilizadas células efetoras cultivadas por 21 dias, em comparação com células efetoras obtidas no dia 14 da cultura. Também foi observado maior ação citotóxica (p<0,05) nas frações, separadas magneticamente, contendo células CD56+ em comparação com as frações CD56-. Conclusões: Preparações de células efetoras ricas em células NK podem ser expandidas in vitro a partir de CMSP de pacientes com neoplasia de ovário. Estas células são providas de função citolítica, indicando o sistema de cultivo empregado como uma fonte viável de células efetoras autólogas / Abstract: The possibility of generating natural killer (NK) enriched cell preparations from cancer patients has been focused on studies seeking for autologous effector cell source for treatment of human malignancies. The objective of the present work was to evaluate the possibility of expanding NK cells from peripheral blood of patients with ovarian neoplasia, and to evaluate their cytotoxic function. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 13 volunteer patients with ovarian neoplasia, 7 benign and 6 malignant tumors, were cultured in CellGro medium supplemented with anti-CD3 (20ng/ml, for the 9-10 initial days), IL-2 (1000 UI/ml) and FBS (10%) for 21 days. The cytotoxic capacity of NK cells was evaluated using a flow cytometry-based cytotoxicity assay. The K562 and the OVCAR3 cell lines were used as target cells. Day-21 cultured cells of the benign neoplasia patients resulted in positive percentual variation of NK (+17.1±5.2%) and NK-T (+10.4±3.1%) lymphocyte subtypes associated with negative percentual variation of T cells (-6.2±6.2%). Differently, day-21 cultured cells of the malignant neoplasia patients presented positive percentual variation for all of the lymphocyte subtypes (NK +12.5±6.0%, NK-T +4.2±0.7% and T +15.3±5.6%). NK enriched effector cell preparations from both, benign and malignant ovarian neoplasia patients, were cytotoxic against the K562 and OVCAR3 cell lines. Cytotoxicity was significantly (p<0.05) higher using effector cells from day-21 cultures, compared with effector cells from day-14. Cytotoxicity was significantly (p<0.05) higher using magnetically separated effector cell fractions containing CD56+ cells compared with effector cell fractions deprived of these cells. The present study demonstrated that NK enriched effector cell preparations can be expanded in vitro from PBMC of ovarian neoplasia patients. These cells are provided with cytolytic function, indicating the culture system employed as a feasible source for autologous effector cells that should be evaluated for the NK-based adoptive therapy of cancer / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Tocoginecologia

Orientador: Otavio Augusto Camara Clark / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T13:39:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sasse_AndreDeeke_D.pdf: 24031684 bytes, checksum: 2accebd159f3ca01d70c9229968723b0 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: RAZÕES: O melanoma maligno é o mais agressivo de todos os cânceres de pele, e sua incidência vem continuamente aumentando no mundo. O principal tratamento é a excisão cirúrgica da lesão primária, com intenção curativa em estágios iniciais. Os pacientes que apresentam doença metastática são considerados incuráveis, pois o melanoma é considerado refratário à maioria das terapias sistêmicas. Existem vários estudos prospectivos randomizados comparando diferentes esquemas de tratamento. Alguns estudos sugerem maior eficácia antitumoral combinando quimioterapia com imunoterapia, mas não existem evidências definitivas, pois comparações paralelas randoinizadas com tratamento com apenas quimioterapia apresentam resultados controversos. A conduta médica atual é baseada na opinião de especialistas, que determina qual é o tratamento considerado padrão. Frente a resultados controversos derivados de estudos randomizados, uma revisão sistemática da literatura faz-se necessária para determinar qual das abordagens terapêuticas apresenta ganhos reais para o paciente OBJETIVOS: Comparar os efeitos da quimioterapia associada à imunoterapia (quimioimunoterapia) com os da quimioterapia isolada em pacientes com melanoma maligno metastático. MÉTODOS: Revisão sistemática da literatura com meta-análise. Estudos clínicos randomizados no tratamento do melanoma metastático foram identificados, através de busca nas bases de dados Cochrane Central Register of Controlled Trials (CENTRAL), MEDLINE, EMBASE, e LILACS. Referências de artigos encontrados, resumos de apresentações em congressos e bases de dados de estudos em andamento também foram utilizados para localizar estudos pertinentes. Critérios de inclusão: estudos controlados randomizados que compararam o uso de quimioterapia com o de quimioimunoterapia no tratamento de pacientes com qualquer idade, portadores de melanoma metastático. Dois revisores extraíram independentemente os dados dos artigos utilizando formulários de extração de dados. Quando possível, para cada desfecho clínico foi feita meta-análise com os dados extraídos, com o fim de calcular o efeito dos tratamentos entre os estudos. Os resultados da meta-análise são expressos com Risco Relativo (RR), Diferença entre os Riscos (DR) e Hazard Ratio (HR), com o correspondente intervalo de confiança (1C) de 95% Os desfechos clínicos avaliados foram sobrevida global, sobrevida em 1, 2 e 5 anos, taxas de resposta, sobrevida livre de progressão, toxicidade e qualidade de vida. RESULTADOS: No total, aproximadamente 1050 citações foram analisadas. 26 estudos foram inicialmente identificados Destes, 18 foram incluídos. A meta-análise dos dados mostra evidência de aumento das taxas de resposta objetiva [RR=1,40, IC95% 1,20 a 1,63; p<0,0001] em pacientes tratados com quimioimunoterapia, em relação aos tratados com quimioterapia. No entanto, o impacto deste aumento nas taxas de resposta não se traduziu em benefício em sobrevida [HR=0,89; IC95% 0,72 a 1,11; p=0,31]. Adicionalmente, há maior toxicidade hematológica e não-hematológica nos pacientes tratados com quimioimunoterapia, o que demonstra danos em relação ao benefício de aumento nas taxas de resposta. CONCLUSÃO: Há evidências de que de que a utilização de quimioimunoterapia não aumenta a sobrevida em pacientes com melanoma metastático. O aumento nas taxas de resposta não justifica a combinação de quimioterapia e imunoterapia fora do ambiente de estudos clínicos / Abstract: BACKGROUND: Malignant melanoma, the most aggressive of all skin cancers, is in increasing incidence throughout the world. Surgery remains the cornerstone of curative treatment in earlier stages. Metastatic disease is incurable in most patients, as melanoma is reputed as refractory to most systemic treatments. The combination of chemotherapy with immunotherapy has been reported to improve treatment results, but it is still unclear whether evidence exists to support this choice, compared with chemotherapy alone OBJECTIVES: To review and to compare the effects of therapy with chemotherapy plus immunotherapy (chemoimmunotherapy) versus chemotherapy alone in patients with metastatic malignant melanoma. METHODS: Systematic review, with meta-analysis. andomized controlled trials in the treatment of metastatic melanoma were identified. We searched the Cochrane Central Register of Controlled Trials (CENTRAL), MEDLINE, EMBASE, and LILACS. References, conference proceedings, and databases of ongoing trials were also used to locate trials. We included all randomized controlled trials that compared the use of chemotherapy versus chemoimmunotherapy in the treatment of people with any age, diagnosed with metastatic melanoma. Two reviewers independently extracted the data from the articles using data extraction forms. Whenever possible, a meta-analysis was performed with the data extracted, in order to calculate a weighted treatment effect across trials For binary endpoints the risk ratio (RR) or the risk difference (RD) was calculated, and for time-to-event data, we calculated Hazard Ratio (HR), both with 95% confidence intervals. The endpoints evaluated were overall survival, one-, two-, and five- year survival rates, response rates, progression-free survival, treatment-related toxicity and quality of life measures. RESULTS: Approximately 1050 citations were scanned. We initially identified 26 studies. Of these, 18 studies were included This systematic review showed evidence of an increase of objective response rates [RR=1.40; 95%CI 1.20 to 1.63; p0.0001] in patients treated with chemoimmunotherapy, in comparison with patients treated with chemotherapy Nevertheless, the impact of these increased response rates in patients was not translated in a survival benefit [HR=0 89; 95%CI 0.72 to 1.11; p=0.31]. Additionally, we found increased hematological and non-hematological toxicities in patients treated with chemoimmunotherapy, which bring harms to the subjective vantage of increased responses. CONCLUSION: There is evidence that the use of chemoimmunotherapy does not increase survival in patients with metastatic melanoma. The improve in response rates did not justify the use of combination of immunotherapy and chemotherapy in chemoimmunotherapy regimens outside of clinical trials / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:54:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:07:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Endostatina é um inibidor específico de proliferação de células endoteliais, migração e um potente inibidor de angiogênese. Foi demonstrado que a administração contínua de endostatina é mais efetiva na supressão tumoral do que a mesma dose administrada s.c. diariamente. Encontrar a concentração de endostatina para combater o crescimento tumoral é complicado pela pequena meia vida da proteína. O transplante de células encapsuladas em dispositivos de imunoisolamento é uma abordagem promissora para muitas doenças, pois permite uma liberação por longo tempo da proteína com propriedades terapêuticas. A membrana semipermeável pode proteger as células da rejeição do sistema imune, para evitar o problema de toxicidade, meia vida limitada e variação nos níveis circulantes. O dispositivo Theracyte® é um sistema de membranas semipermeáveis para macroencapsulamento que permite o implante de células geneticamente modificadas para liberação de proteínas terapêuticas in vivo sem a necessidade de imunosupressão do hospedeiro. Foi demonstrado neste estudo que fibroblastos murinos (células LM) expressando 0,4 µg de endostatina murina/106 células em 24 horas se apresentam como uma abordagem promissora para terapia tumoral. O sistema de liberação é composto de células LM produtoras de endostatina encapsuladas em macrocápsulas Theracyte para imunoisolamento de células. Para demonstrar a utilidade deste sistema, modelos de camundongos com tumores de Ehrlich e melanoma foram tratados com 107 células encapsuladas expressando endostatina. Foram analisados dois protocolos para o implante dos dispositivos: No primeiro, os dispositivos foram implantados nos animais e após 14 dias (cicatrização das feridas), as células expressando endostatina foram implantadas no interior destes dispositivos. Em um segundo, os dispositivos contendo as células foram implantados nos animais. O crescimento do tumor melanoma foi reduzido de 42% pela utilização do primeiro protocolo de implante e de 54% quando o segundo protocolo foi utilizado. O crescimento do tumor de Ehrlich foi reduzido de 25% utilizando o primeiro protocolo de implante. A imunohistoquímica utilizando anticorpo anti-endostatina demonstrou a liberação da endostatina para o estroma ao redor do dispositivo, mostrando que a endostatina, secretada pelas células recombinantes confinadas permeou através da membrana, atingindo os tecidos adjacentes. A efetividade da ação da endostatina na neovascularização de melanoma (B16-F10) foi determinada pela análise do número de estruturas vasculares, analisadas por imunohistoquímica utilizando anticorpo anti-CD34. Foi demonstrado um decréscimo de 41,5% no número de estruturas vasculares, 35,9% no número de vasos viáveis e de 33,5% na extensão da área vascular no grupo tratado. Os resultados descritos são promissores e podem oferecer uma alternativa para uma variedade te tipos de tumores. / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP