Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3716.pdf: 15456968 bytes, checksum: 4a39e68e7b10a9e50bb83087365cf289 (MD5) Previous issue date: 2011-09-26 / Financiadora de Estudos e Projetos / Ten herbs used in traditional medicine supported by literature for its effectiveness to osteoarticular diseases were selected to conduct a screening of inhibition activity against the cathepsin K, an important enzyme responsible for cleavage of collagen, the main constituent of extracellular matrix of cartilage and bone. Out of the ten herbs selected (ginger, saffron, camellia, cat s claw, mentrasto , moringa , babaçu , devil s claw, urtica e pequi ), one, gengibre (Z. officinale), should be highlighted by a high inhibitory activity of its extracts and fractions against cathepsin K and due to its ancient use as a therapeutic agent. From the dichloromethane fraction obtained of the crude extract of the rhizome of Z. officinale were isolated and identified 18 compounds (4-gingerol, 6-gingerol, 8-gingerol, 6-shogaol, 8-shogaol, 10-shogaol, 6- paradol, 6-gingerdiol, methyl 6-gingerol, methyl 6-shogaol, diacetoxy-6-gingerdiol, methyl diacetoxy-6-gingerdiol, zingerone, gingerenone A, galanolactone, 3-acetoxy- 5-hydroxy-1,7-bis(4 -hydroxy-3 -methoxyphenyl)-heptane and hexahydrocurcumin). From the hexane fraction and essential oil were identified two monoterpenes and four sesquiterpenes. The most active compounds against cathepsin K were gingerols and shogaols with longer alkyl chain. Optimization of the separation of major compounds (6, 8 and 10-gingerol) and an overload study of C18 column was performed using HPLC, obtained as result dozens to hundreds of milligrams of each gingerol with high purity. Structural modifications of 6-gingerol were carried out and of the seven derivatives obtained 4 presented significant increase in inhibition of cathepsin K. Of all the compounds, three, SSi6, 10-gingerol, 6-shogaol, were selected for later tests: determinating of the mode the inhibition against cathepsin K, inhibition against cathepsin K and inhibition of nitric oxide (NO) production, in cellular culture. The inhibitions determined were: partially noncompetitive, partially uncompetitive and complete uncompetitive for the SSi6, 10-gingerol and 6-shogaol, respectively. Excellent inhibition activity against the cathepsin K, in cellular culture, can be observed for SSi6 and 6-shogaol. In the inhibition assay of NO production, the 6- shogaol was the only compound that appeared as effective. / Dez plantas utilizadas pela medicina tradicional com indicativos na literatura de suas eficácias frente a doenças osteoarticulares foram selecionadas para a realização de uma triagem de atividade inibitória frente à catepsina K, uma importante enzima responsável pela clivagem do colágeno, principal constituinte da matriz extracelular da cartilagem e ossos. Das dez plantas selecionadas (gengibre, açafrão, camélia, unha-de-gato, mentrasto, moringa, babaçu, garra-do-diabo, urtigão e pequi), uma, gengibre (Zingiber officinale), merece destaque pela alta inibição de seu extrato e frações frente à catepsina K e por seu uso milenar como agente terapêutico. Da fração de diclorometano obtida do extrato bruto dos rizomas de Z. officinale isolou-se e identificou-se 18 substâncias (4-gingerol, 6-gingerol, 8-gingerol, 6-shogaol, 8- shogaol, 10-shogaol, 6-paradol, 6-gingerdiol, metil-6-gingerol, metil-6-shogaol, diacetato de 6-gingerdioila, diacetato de metil-6-gingerdioila, zingerona, gingerenona A, galanolactona, 3-acetato de 5-hidroxi-1,7-bis(4 -hidroxi-3 -metoxifenil)-heptila e hexaidrocurcumina). Da fração de n-hexano e do óleo essencial, foram identificados 2 monoterpenos e 4 sesquiterpenos. As substâncias mais ativas frente à catepsina K foram os gingerois e shogaois de maior cadeia alquílica. Otimização da separação das substâncias majoritárias (6, 8 e 10-gingerol) e um estudo de sobrecarga de uma coluna C18 por CLAE, foram realizados, obtendo-se como resultado o isolamento de dezenas a centenas de miligramas de cada gingerol com considerável grau de pureza. Modificações estruturais do 6-gingerol foram realizadas e, das sete substâncias obtidas, 4 tiveram um aumento considerável do poder inibitório. Das substâncias obtidas, três, SSi6, 10-gingerol, 6-shogaol, foram selecionadas para ensaios posteriores: determinação do tipo de inibição frente à catepsina K, inibição da catepsina K e inibição da produção de óxido nítrico (NO), em meio celular. As inibições determinadas foram não-competitiva parcial, acompetitiva parcial e acompetitiva completa, para o SSi6, 10-gingerol e 6-shogaol, respectivamente. Excelentes atividades de inibição frente à catepsina K, em meio celular, puderam ser observadas para o SSi6 e 6-shogaol. No ensaio de inibição da produção de NO, o 6- shogaol foi a única substância que se apresentou como efetivo.

Orientador: Ljubica Tasic / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-19T12:26:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_FabioHenriquedosSantos_M.pdf: 24628982 bytes, checksum: f6b1490bc6bf2bf5497e5cad40a40daa (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A Adenosina Quinase (ADK) é uma enzima importante (EC 2.7.1.20), cuja ação pode estar relacionada a diversas doenças, tais como inflamações, derrame, infarto, entre outras. Desse modo, a inibição de sua atividade é de grande importância, e desperta interesse científico. Na tentativa de inibir a ação da ADK, houve busca por compostos orgânicos cuja capacidade inibitória seja superior comparando-se com inibidores da ADK existentes. Desse modo, derivados de 4-anilinoquinazolinas mostraram-se alvos interessantes. Foi sintetizada uma série de 22 derivados de 8-metóxi-4-anilinoquinazolinas, substituídas nas posições 3'e 4'do anel anilínico. Os compostos sintetizados foram caracterizados e testados frente à ADK, de forma a verificar seu potencial inibitório, principalmente através da técnica de fluorescência de emissão. Da série de compostos, seis apresentaram-se promissores na inibição da ADK. Ensaios in silico também foram realizados, buscando-se uma melhor compreensão do mecanismo de inibição do sistema compostos/ADK / Abstract: The Adenosine Kinase (ADK) is an important enzyme (EC 2.7.1.20) that might be related to several diseases, such as inflammation, stroke and infarct, and many others. Therefore, its activity inhibition is of great importance, arising significant scientific interest. Aiming ADKs inhibition, a search for suitable organic species was realized, in such way that 4-anilinoquinazoline derivatives showed themselves interesting targets. A serie of 22 8-methoxy-4-anilinequinazoline derivatives, substituted on the aniline ring at 3'and 4'positions, was synthesized. The compounds were characterized and tested in in vitro ADKs inhibition, in order to verify their inhibitory potentials, mainly applying emission fluorescence technique. Six compounds of this serie presented promising properties in ADKs inhibition. In silico assays were also conducted, in order to better explain the inhibitory mechanism of the system compounds/ADK / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

A (-)- grandisina (GRA) é um produto natural da classe das lignanas e é encontrada em muitas espécies de plantas das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Por apresentar diversas propriedades biológicas, como atividade tripanocida, anti-inflamatória, antinociceptiva, e principalmente atividade antileucêmica e antitumoral contra tumores de Ehrlich, a GRA pode ser considerada um potencial candidato a fármaco. Porém, para que a GRA se torne um fármaco são necessárias diversas etapas de estudos, incluindo estudos pré-clínicos de interações medicamentosas (DDI). As DDI ocorrem principalmente devido a inibições diretas e tempo-dependentes das enzimas do citocromo P450 (CYP450), uma superfamília de enzimas responsável por metabolizar cerca de 75% dos fármacos em uso. Os estudos pré-clínicos de DDI envolvem o conhecimento do potencial inibitório do candidato a fármaco sobre essas enzimas e esses estudos podem ser realizados empregando diversos modelos in vitro, como, por exemplo, microssomas hepáticos de humanos (HLM). Assim, nesse estudo foi avaliado o efeito inibitório da GRA sobre a atividade das principais isoformas do CYP450 e também foram determinadas as isoformas que contribuem para a formação dos metabólitos da GRA. Os resultados demonstraram que múltiplas isoformas participam da formação dos metabólitos da GRA, com destaque para a CYP2C9, que participa da formação de todos os metabólitos. Em relação aos estudos de inibição, foi possível concluir que a GRA é um inibidor fraco da CYP1A2 e CYP2D6, com valores de IC50 maiores do que 200 µM e 100 µM, respectivamente, e um inibidor moderado e competitivo da CYP2C9, com IC50 igual a 40,85 µM e Ki igual a 50,60 µM. Para a CYP3A4 o potencial inibitório da GRA foi avaliado utilizando dois substratos distintos. A GRA demonstrou ser tanto um inibidor dose-dependente moderado e competitivo dessa isoforma, quanto um inibidor tempo-dependente baseado em mecanismo com potencial de inativação equiparável ao do irinotecano, inibidor baseado em mecanismo clinicamente significativo. Utilizando a nifedipina como substrato os valores de IC50 e Ki foram 78,09 µM e 48,71 µM, respectivamente. Já os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 6,40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5,78 mL min-1 µmol-1. Para os ensaios empregando o midazolam os valores de IC50 e Ki foram 48,87 µM e 31,25 µM, respectivamente, e os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 31,53 µM, kinact= 0,049 min-1 e Clinact= 1,55 mL min-1 µmol-1. Com relação a CYP2E1, por sua vez, foi possível observar que a GRA tem capacidade de aumentar a atividade dessa isoforma significativamente a partir da concentração de 4 µM. Portanto, conclui-se que não há risco da GRA apresentar interações medicamentosas com fármacos metabolizados pela CYP1A2 e CYP2D6, enquanto que para a CYP2C9, apesar da GRA ser um inibidor moderado dessa isoforma, o risco é baixo. Já para medicamentos metabolizados pela CYP2E1 e CYP3A4 o risco de DDI existe e isso deve ser cuidadosamente monitorado in vivo, principalmente porque a CYP3A4 é a isoforma responsável por catalisar o metabolismo da maioria dos fármacos. / (-)-grandisin (GRA) is a lignanic natural product found in many species of plants from North and Northeast of Brazil. This compound has several biological properties, such as trypanocide, anti-inflammatory, antinociceptive, antileukemia activity and antitumor activity against Ehrlich tumor. Because of these biological properties, GRA is considered a potential drug candidate, however, before becoming a new drug, GRA has to undergo various tests, including preclinical drug-drug interactions (DDI) studies. Most of the times, DDI occur because of direct and time-dependent inhibitions of cytochrome P450 (CYP450) enzymes, an enzyme superfamily responsible for metabolizing the vast majority of drugs administered. Preclinical drug-drug interactions studies involve the evaluation of the potential of a drug candidate to inhibit this superfamily of enzymes and these studies can be conducted using in vitro models, such as human liver microsomes (HLM). Therefore, in this project, the inhibitory effect of GRA on the activity of some CYP450 isoforms was evaluated and the isoforms that catalyze the formation of GRA\'s metabolites were also determined. Results showed that multiple CYP450 isoforms participate in the GRA\'s metabolites formation, highlighting CYP2C9, which catalyzes the formation of all metabolites. The inhibition studies showed that GRA is a weak inhibitor of CYP1A2 and CYP2D6, with IC50 values greater than 200 µM and 100 µM, respectively, and a moderate and competitive inhibitor of CYP2C9, with IC50 value equal to 40.85 µM and Ki value equal to 50.60 µM. The capability of GRA to inhibit CYP3A4 was evaluated using two different substrates. GRA showed to be a moderate and competitive dose- dependent inhibitor of this isoform and also a mechanism-based time-dependent inhibitor with potential of inactivation comparable to irinotecan, a clinically significant mechanism-based inhibitor. IC50 and Ki values obtained using nifedipine as substrate were 78.09 µM and 48.71 µM, respectively, and inactivation kinetics parameters were KI= 6.40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5.78 mL min-1 µmol-1. On the other hand, IC50 and Ki values using midazolam as substrate were 48.87 µM and 31.25 µM, respectively, and the values of inactivation kinetics parameters were KI= 31.53 µM, kinact= 0,049 min-1 and Clinact= 1.55 mL min-1 µmol-1. With respect to CYP2E1, it was observed that GRA increases its activity significantly from a concentration of 4 µM. Therefore, it is possible to conclude that there is no risk of DDI between GRA and drugs metabolized by CYP1A2 and CYP2D6, while for CYP2C9, although GRA is a moderate inhibitor of this isoform, the risk is low. Finally, for drugs metabolized by CYP3A4 and CYP2E1 there is risk of DDI and this should be carefully monitored in humans, mainly because CYP3A4 is an isoform responsible for catalyzing the metabolism of most drugs in use.

A (-)- grandisina (GRA) é um produto natural da classe das lignanas e é encontrada em muitas espécies de plantas das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Por apresentar diversas propriedades biológicas, como atividade tripanocida, anti-inflamatória, antinociceptiva, e principalmente atividade antileucêmica e antitumoral contra tumores de Ehrlich, a GRA pode ser considerada um potencial candidato a fármaco. Porém, para que a GRA se torne um fármaco são necessárias diversas etapas de estudos, incluindo estudos pré-clínicos de interações medicamentosas (DDI). As DDI ocorrem principalmente devido a inibições diretas e tempo-dependentes das enzimas do citocromo P450 (CYP450), uma superfamília de enzimas responsável por metabolizar cerca de 75% dos fármacos em uso. Os estudos pré-clínicos de DDI envolvem o conhecimento do potencial inibitório do candidato a fármaco sobre essas enzimas e esses estudos podem ser realizados empregando diversos modelos in vitro, como, por exemplo, microssomas hepáticos de humanos (HLM). Assim, nesse estudo foi avaliado o efeito inibitório da GRA sobre a atividade das principais isoformas do CYP450 e também foram determinadas as isoformas que contribuem para a formação dos metabólitos da GRA. Os resultados demonstraram que múltiplas isoformas participam da formação dos metabólitos da GRA, com destaque para a CYP2C9, que participa da formação de todos os metabólitos. Em relação aos estudos de inibição, foi possível concluir que a GRA é um inibidor fraco da CYP1A2 e CYP2D6, com valores de IC50 maiores do que 200 µM e 100 µM, respectivamente, e um inibidor moderado e competitivo da CYP2C9, com IC50 igual a 40,85 µM e Ki igual a 50,60 µM. Para a CYP3A4 o potencial inibitório da GRA foi avaliado utilizando dois substratos distintos. A GRA demonstrou ser tanto um inibidor dose-dependente moderado e competitivo dessa isoforma, quanto um inibidor tempo-dependente baseado em mecanismo com potencial de inativação equiparável ao do irinotecano, inibidor baseado em mecanismo clinicamente significativo. Utilizando a nifedipina como substrato os valores de IC50 e Ki foram 78,09 µM e 48,71 µM, respectivamente. Já os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 6,40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5,78 mL min-1 µmol-1. Para os ensaios empregando o midazolam os valores de IC50 e Ki foram 48,87 µM e 31,25 µM, respectivamente, e os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 31,53 µM, kinact= 0,049 min-1 e Clinact= 1,55 mL min-1 µmol-1. Com relação a CYP2E1, por sua vez, foi possível observar que a GRA tem capacidade de aumentar a atividade dessa isoforma significativamente a partir da concentração de 4 µM. Portanto, conclui-se que não há risco da GRA apresentar interações medicamentosas com fármacos metabolizados pela CYP1A2 e CYP2D6, enquanto que para a CYP2C9, apesar da GRA ser um inibidor moderado dessa isoforma, o risco é baixo. Já para medicamentos metabolizados pela CYP2E1 e CYP3A4 o risco de DDI existe e isso deve ser cuidadosamente monitorado in vivo, principalmente porque a CYP3A4 é a isoforma responsável por catalisar o metabolismo da maioria dos fármacos. / (-)-grandisin (GRA) is a lignanic natural product found in many species of plants from North and Northeast of Brazil. This compound has several biological properties, such as trypanocide, anti-inflammatory, antinociceptive, antileukemia activity and antitumor activity against Ehrlich tumor. Because of these biological properties, GRA is considered a potential drug candidate, however, before becoming a new drug, GRA has to undergo various tests, including preclinical drug-drug interactions (DDI) studies. Most of the times, DDI occur because of direct and time-dependent inhibitions of cytochrome P450 (CYP450) enzymes, an enzyme superfamily responsible for metabolizing the vast majority of drugs administered. Preclinical drug-drug interactions studies involve the evaluation of the potential of a drug candidate to inhibit this superfamily of enzymes and these studies can be conducted using in vitro models, such as human liver microsomes (HLM). Therefore, in this project, the inhibitory effect of GRA on the activity of some CYP450 isoforms was evaluated and the isoforms that catalyze the formation of GRA\'s metabolites were also determined. Results showed that multiple CYP450 isoforms participate in the GRA\'s metabolites formation, highlighting CYP2C9, which catalyzes the formation of all metabolites. The inhibition studies showed that GRA is a weak inhibitor of CYP1A2 and CYP2D6, with IC50 values greater than 200 µM and 100 µM, respectively, and a moderate and competitive inhibitor of CYP2C9, with IC50 value equal to 40.85 µM and Ki value equal to 50.60 µM. The capability of GRA to inhibit CYP3A4 was evaluated using two different substrates. GRA showed to be a moderate and competitive dose- dependent inhibitor of this isoform and also a mechanism-based time-dependent inhibitor with potential of inactivation comparable to irinotecan, a clinically significant mechanism-based inhibitor. IC50 and Ki values obtained using nifedipine as substrate were 78.09 µM and 48.71 µM, respectively, and inactivation kinetics parameters were KI= 6.40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5.78 mL min-1 µmol-1. On the other hand, IC50 and Ki values using midazolam as substrate were 48.87 µM and 31.25 µM, respectively, and the values of inactivation kinetics parameters were KI= 31.53 µM, kinact= 0,049 min-1 and Clinact= 1.55 mL min-1 µmol-1. With respect to CYP2E1, it was observed that GRA increases its activity significantly from a concentration of 4 µM. Therefore, it is possible to conclude that there is no risk of DDI between GRA and drugs metabolized by CYP1A2 and CYP2D6, while for CYP2C9, although GRA is a moderate inhibitor of this isoform, the risk is low. Finally, for drugs metabolized by CYP3A4 and CYP2E1 there is risk of DDI and this should be carefully monitored in humans, mainly because CYP3A4 is an isoform responsible for catalyzing the metabolism of most drugs in use.

Esta tese apresenta o desenvolvimento de metodologias analíticas em sistemas de solução em fluxo com detecção amperométrica e espectrofotométrica explorando a utilização de tecidos vegetais como fonte enzimática para a biocatálise de reações. Desempenhos satisfatórios foram obtidos com a utilização do mesocarpo fibroso do coco (Cocus nucifera, L.) e com a casca e/ou polpa de frutos da palmeira leque (Latania sp), fontes de polifenol oxidase. Uma metodologia, simples e rápida, para a determinação dos parâmetros bioquímicos da polifenol oxidase foi desenvolvida ao longo do presente trabalho com a enzima naturalmente imobilizada no tecido do coco, pela eliminação das etapas de extração e de purificação e associando-se análise em fluxo e espectrofotometria. Parâmetros cinéticos importantes como o efeito do pH, a constante de Michaelis-Menten (Km), a velocidade máxima (Vmax),a energia de ativação (Ea) e os parâmetros térmicos (valores D, z e Q10)foram determinados utilizando como substrato o catecol. A atividade relativa junto a diferentes substratos e o efeito de inibidores foram também avaliados. Aplicações envolvendo estes tecidos vegetais em reatores empacotados (associados com FIA) ou incorporados em eletrodos de pasta de carbono (medidas realizadas em batelada) para a determinação de produtos fenólicos como catecol, fenol e dopamina, inibidores da atividade enzimática como o sulfito, bem como para a quantificação do conteúdo de água, demonstram a sua versatilidade. Os produtos fenólicos foram quantificados com boa sensibilidade (na faixa de µmol L-1) pela redução amperométrica das respectivas quinonas, produzidas pela oxidação enzimática. Aplicações com amostras reais, dentre as quais água de rio e resíduos de uma fábrica de papel puderam ser implementadas. A determinação do conteúdo de água em meio aquo-restrito explorou a estimulação, pela água, da atividade catalitica da polifenoI oxidase naturalmente imobilizada no mesocarpo fibroso do coco na presença de catecol. Esta propriedade foi utilizada para a determinação rápida e reprodutível do conteúdo de água em amostras comerciais de álcool, utilizando acetonitrila como carregador. A quantificação de sulfito baseou-se no seu efeito inibidor sobre a polifenol oxidase naturalmente imobilizada em relação à catálise oxidativa do catecol. Diversos interferentes comumente presentes em amostras de vinho foram também investigados. Durante este trabalho, foi desenvolvida uma simples e interessante maneira de conservar o mesocarpo fibroso do coco como fonte de polifenol oxidase naturalmente imobilizada. O tecido desta fruta foi desidratado e moído. O pó deste tecido, estocado a mais de dois anos à temperatura ambiente, ainda apresenta boa atividade enzimática. / The development of analytical methodologies exploring plant tissues as enzymatic source for biocatalysis of many reactions is presented in this thesis. Amperometry and spectrophotometry was associated with flow analysis for analytical purposes and for biochemical characterization of naturally immobilized polyphenol oxidase. Good performance was achieved with tissues from the fruits of two palm trees: the fibrous mesocarp of green coconut fruits, Cocus nucifera, L., and the skin and the pulp of green fruits from Latania sp. Both tissues are very effective in the biotransformation of o-diphenols to the corresponding o-quinones. A simple, fast, and new methodology for the determination of the biochemical parameters of the poyphenol oxidase naturally immobilized on the fibrous tissue was developed (eliminating the extraction and purification of enzymes) by association of flow injection analysis and spectrophotometry. For coconut tissue, cinetic parameters like pH effect, Michaelis-Menten constant (Km) and maximum rate (Vmax), activation energy (Ea) and thermal parameters (D, z and Q10values) on catechol biotransformation were determined. Also the response for several substrates as too for various inhibitors was explored. Amperometric quantification of phenolic compounds was made using the vegetal tissue in form of packed reactors (associated with FIA) or incorporated in carbon paste electrodes (measurements in batch). Very good response for catechol, phenol and dopamine was registered for this compounds, with very high sensitivity (µmol L-1 range). Applicability to real samples as for river water and for a paper plant waste water was verified. The same amperometry-FIA system was employed for enzymology in non-aqueous medium. The activity of the polyphenol oxidase contained in coconut tissues are strongly dependent of water. The strategy involves the stimulation by the content of water on the biocatalytic activity of the enzyme in the presence of catechol substrate. This strategy was used for the determination of water content in alcohol samples, in medium of dry acetonitrile. The inhibition of the enzymatic activity produced by many compounds can be explored for an indirect quantification of the inhibitor. A flow injection amperometric procedure was developed for the determination of sulphite ion based in its inhibitory effect on the activity of polyphenol oxidase on the oxidation of catechol. The effect on the bioreactor performance of potential interferents commonly present in wine samples were also investigated. During this work, it was developed a simple and interesting way to preserve coconut tissue. The mesocarp of this fruit can be dried and grounded. These tissues still with very good activity after more than two years in \"shelf temperature\".

Esta tese apresenta o desenvolvimento de metodologias analíticas em sistemas de solução em fluxo com detecção amperométrica e espectrofotométrica explorando a utilização de tecidos vegetais como fonte enzimática para a biocatálise de reações. Desempenhos satisfatórios foram obtidos com a utilização do mesocarpo fibroso do coco (Cocus nucifera, L.) e com a casca e/ou polpa de frutos da palmeira leque (Latania sp), fontes de polifenol oxidase. Uma metodologia, simples e rápida, para a determinação dos parâmetros bioquímicos da polifenol oxidase foi desenvolvida ao longo do presente trabalho com a enzima naturalmente imobilizada no tecido do coco, pela eliminação das etapas de extração e de purificação e associando-se análise em fluxo e espectrofotometria. Parâmetros cinéticos importantes como o efeito do pH, a constante de Michaelis-Menten (Km), a velocidade máxima (Vmax),a energia de ativação (Ea) e os parâmetros térmicos (valores D, z e Q10)foram determinados utilizando como substrato o catecol. A atividade relativa junto a diferentes substratos e o efeito de inibidores foram também avaliados. Aplicações envolvendo estes tecidos vegetais em reatores empacotados (associados com FIA) ou incorporados em eletrodos de pasta de carbono (medidas realizadas em batelada) para a determinação de produtos fenólicos como catecol, fenol e dopamina, inibidores da atividade enzimática como o sulfito, bem como para a quantificação do conteúdo de água, demonstram a sua versatilidade. Os produtos fenólicos foram quantificados com boa sensibilidade (na faixa de µmol L-1) pela redução amperométrica das respectivas quinonas, produzidas pela oxidação enzimática. Aplicações com amostras reais, dentre as quais água de rio e resíduos de uma fábrica de papel puderam ser implementadas. A determinação do conteúdo de água em meio aquo-restrito explorou a estimulação, pela água, da atividade catalitica da polifenoI oxidase naturalmente imobilizada no mesocarpo fibroso do coco na presença de catecol. Esta propriedade foi utilizada para a determinação rápida e reprodutível do conteúdo de água em amostras comerciais de álcool, utilizando acetonitrila como carregador. A quantificação de sulfito baseou-se no seu efeito inibidor sobre a polifenol oxidase naturalmente imobilizada em relação à catálise oxidativa do catecol. Diversos interferentes comumente presentes em amostras de vinho foram também investigados. Durante este trabalho, foi desenvolvida uma simples e interessante maneira de conservar o mesocarpo fibroso do coco como fonte de polifenol oxidase naturalmente imobilizada. O tecido desta fruta foi desidratado e moído. O pó deste tecido, estocado a mais de dois anos à temperatura ambiente, ainda apresenta boa atividade enzimática. / The development of analytical methodologies exploring plant tissues as enzymatic source for biocatalysis of many reactions is presented in this thesis. Amperometry and spectrophotometry was associated with flow analysis for analytical purposes and for biochemical characterization of naturally immobilized polyphenol oxidase. Good performance was achieved with tissues from the fruits of two palm trees: the fibrous mesocarp of green coconut fruits, Cocus nucifera, L., and the skin and the pulp of green fruits from Latania sp. Both tissues are very effective in the biotransformation of o-diphenols to the corresponding o-quinones. A simple, fast, and new methodology for the determination of the biochemical parameters of the poyphenol oxidase naturally immobilized on the fibrous tissue was developed (eliminating the extraction and purification of enzymes) by association of flow injection analysis and spectrophotometry. For coconut tissue, cinetic parameters like pH effect, Michaelis-Menten constant (Km) and maximum rate (Vmax), activation energy (Ea) and thermal parameters (D, z and Q10values) on catechol biotransformation were determined. Also the response for several substrates as too for various inhibitors was explored. Amperometric quantification of phenolic compounds was made using the vegetal tissue in form of packed reactors (associated with FIA) or incorporated in carbon paste electrodes (measurements in batch). Very good response for catechol, phenol and dopamine was registered for this compounds, with very high sensitivity (µmol L-1 range). Applicability to real samples as for river water and for a paper plant waste water was verified. The same amperometry-FIA system was employed for enzymology in non-aqueous medium. The activity of the polyphenol oxidase contained in coconut tissues are strongly dependent of water. The strategy involves the stimulation by the content of water on the biocatalytic activity of the enzyme in the presence of catechol substrate. This strategy was used for the determination of water content in alcohol samples, in medium of dry acetonitrile. The inhibition of the enzymatic activity produced by many compounds can be explored for an indirect quantification of the inhibitor. A flow injection amperometric procedure was developed for the determination of sulphite ion based in its inhibitory effect on the activity of polyphenol oxidase on the oxidation of catechol. The effect on the bioreactor performance of potential interferents commonly present in wine samples were also investigated. During this work, it was developed a simple and interesting way to preserve coconut tissue. The mesocarp of this fruit can be dried and grounded. These tissues still with very good activity after more than two years in \"shelf temperature\".