Orientador: Sergio Daishi Sasaki / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29 / O Aedes aegypti é o vetor mais importante de arboviroses humana sendo responsável pelas transmissões de dengue e febre amarela urbana. As enzimas tipo tripsina apresentam um importante papel na digestão de estádios de vida larval e adulto de Ae. aegypti. No presente trabalho, nós identificamos as duas enzimas tipo tripsina majoritárias do intestino médio larval através da construção de uma biblioteca de fragmentos de cDNA de tripsina. Elas são AAEL005607 e AAEL006371, com frequências de expressão de 29,3% e 20%, respectivamente. Análises por PCR semi-quantitativo mostraram que a tripsina AAEL005607 foi transcrita em todos os instars larval, mas a tripsina AAEL006371 apareceu somente nos 3º e 4º instar larvais. A fim de confirmar os dados de transcrição, enzimas tipo tripsina do intestino médio de larvas de 4º instar foram purificadas por cromatografias de afinidade, troca iônica e fase reversa. A tripsina purificada apresentou massa molecular de 28 kDa por SDS-PAGE. Sua sequência de aminoácidos parcial nos permitiu sugerir que a atividade de tripsina é codificada pela sequência AAEL005607. A tripsina purificada (AAEL005607) exibiu um valor de Km de 36,4 μM para o substrato Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa e foi fortemente inibida por AaTI e HiTI, ambos inibidores de tripsina, com valores de Ki de 0,94 pM e 160 pM, respectivamente. Em conclusão, pela primeira vez, a enzima digestiva majoritária de 4º instar larval de Ae. aegypti foi purificada e caracterizada. / Aedes aegypti is the most important vector of human arboviral diseases and it is responsible for dengue and urban yellow fever transmissions. Trypsin-like enzymes plays an important role in the Ae. aegypti adult and larval life stages digestion. In the present work, we identified the two major trypsin-like enzymes of Ae. aegypti larval midgut through the trypsin cDNA fragments library construction. They are AAEL005607 and AAEL006371, with expression frequencies of 29.3% and 20%, respectively. Semi quantitative PCR analysis showed that the AAEL005607 was transcripted in all larval instars, but AAEL006371 appeared only in 3rd and 4th larval instars. In order to confirm the transcription data, trypsin-like enzymes from 4th instar larvae of Ae. aegypti midgut were purified by affinity, ionic exchange and reversedphase chromatographies. Purified trypsin presented molecular mass of 28 kDa by SDS-PAGE. Its partial amino acid sequence allowed us to suggest that the trypsin activity is encoding by AAEL005607 sequence. The purified trypsin (AAEL005607) showed Km value of 36.4 μM for Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa substrate and was strongly inhibited by AaTI and HiTI, both trypsin inhibitors, with Ki of 0.94 pM and 160 pM, respectively. In conclusion, for the first time, the major digestive enzyme of 4th larval instar of Ae. aegypti was identified and characterized. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Amblyomin-X é um inibidor de serinoprotease do tipo kunitz obtido de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajannense. Dados preliminares mostraram que a injeção in vivo de Amblyomin-X reduziu a formação de massa tumoral induzida por células de melanoma B16F10 em camundongos. Com base neste dado e na ação de inibidores de serinoproteases sobre a angiogênese, este projeto foi delineado para caracterizar as ações do Amblyomin-X sobre a angiogênese in vivo e sobre funções da célula endotelial in vitro na vigência do fator de crescimento VEGF-A. Os efeitos do Amblyomin-X sobre a cinética de formação de novos vasos na rede microcirculatória in vivo foram investigados no modelo de câmara dorsal em camundongos e na membrana corioalantóica. Empregando cultura de células endoteliais de linhagem de microcirculação (t-End), foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X sobre viabilidade e citoproteção celular (anexina e iodeto de propídio - PI), proliferação celular (incorporação do fluoróforo diacetato de carboxi-fluoresceína succinimidil éster) e ciclo celular, além da expressão das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 e β3 integrinas em ensaios de citometria de fluxo. A aderência celular em Matrigel foi quantificada por espectrofotometria, a formação de tubos foi mensurada por microscopia óptica e a expressão gênica das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1 e VCAM-1 por RT-PCR. Os dados obtidos mostraram que a aplicação tópica do Amblyomin-X (100ng/10µL) reduziu a formação de novos vasos no tecido subcutâneo dorsal de camundongos, quando o tratamento foi iniciado anterior ou concomitantemente, mas não posteriormente ao tratamento ao VEGF (10ng/10µL) e, reduziu a formação de novos vasos na membrana corioalantóica, quando administrado concomitantemente com o VEGF (0,25ng/10µL). O Amblyomin-X não alterou a viabilidade de células t-End (1000ng/mL, 72 horas); inibiu a apoptose e apoptose tardia causada por meio de cultura carenciado (100ng/mL); inibiu a proliferação (10, 100 ou 1000ng/mL de Amblyomin-X, 48 e 72 horas); induziu parada nas fases G1/G0 do ciclo celular; diminuiu a aderência e a formação de tubos das células endoteliais; não alterou a expressão basal de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 e β3 integrinas, mas reduziu a expressão de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induzida pelo VEGF-A. A redução da expressão protéica da PECAM-1 e ICAM-1 parece não ser dependente de ação do Amblyomin-X na expressão gênica, já que os níveis de RNAm não foram afetados pela ação do Amblyomin-X. Em conjunto, os dados obtidos neste trabalho mostram que o Amblyomin-X inibe a formação de novos vasos in vivo, por interferir, possivelmente, em mecanismos relacionados a sinalização da célula endotelial induzida pelo VEGF-A, em especial com a proliferação, adesão , tubulogênese e expressão de moléculas de adesão da família das imunoglobulinas. / Amblyomin-X is a type-kunitz serineprotease inhibitor obtained from a cDNA library of the Amblyomma cajannense salivary glands. Preliminary data showed that in vivo injection of the protein reduced the formation of tumor-induced B16F10 melanoma cells in mice. Based on this data and on actions of serinorpoteases inhibitors on angiogenesis, this project aimed to characterize the actions of Amblyomin-X on angiogenesis in vivo and on in vitro endothelial cells functions in the presence of the growth factor VEGF. The effects of Amblyomin-X on the in vivo formation of microcirculatory new vessels were investigated in the dorsal chamber model in mice and in the chorioallantoic membrane assay. Mice microvascular endothelial cell lineage (t-End) was employed to evaluate the effects of Amblyomin-X on cytoprotection and cell viability (Annexin-V and propidium iodide-PI), cell proliferation (incorporation of the fluorophore fluorescein diacetate carboxy-succinimidil ester), cell cycle, membrane expression of PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 and β3 integrins adhesion molecules using flow cytometry. Cell adhesion was assessed in matrigel by spectrophotometry, the formation of tubes was measured by optical microscopy and adhesion molecules PECAM-1, ICAM-1 and VCAM-1 gene expression was evaluated by RT-PCR. Data obtained showed that topical application of Amblyomin-X (100ng/10µL) reduced the formation of new vessels, only when Amblyomin-X treatment started before or simultaneously to VEGF-A stimulation (10ng/10µL). Amblyomin-X (100ng/10µL) also reduced the formation of new vessels in the chorioallantoic membrane assay, when coadministered with VEGF (0.25ng/10µL). The Amblyomin-X did not alter the viability of t-End (1000ng/mL, 72 hours), inhibited apoptosis and late apoptosis caused by deprivated serum (100ng/mL), inhibited proliferation (10, 100 or 1000ng/mL, 48 and 72 hours), induced G1/G0 arrest in cell cycle phases, decreased the cell adhesion and tube formation (100ng/mL), did not alter the basal expression of PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 or β3 integrin, but reduced the PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induced by VEGF-A. Impaired PECAM-1 and ICAM-1 expression seems not be dependent on gene expression, as, mRNA levels were not affected by the action of Amblyomin-X. Together, the data obtained shows that the Amblyomin-X inhibits new vessel formation in vivo, by interfering, possibly, with mechanisms related to VEGF-A induced endothelial cell signaling, especially with the proliferation, adhesion, tubulogenesis and expression of adhesion molecules.

Amblyomin-X é um inibidor de serinoprotease do tipo kunitz obtido de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajannense. Dados preliminares mostraram que a injeção in vivo de Amblyomin-X reduziu a formação de massa tumoral induzida por células de melanoma B16F10 em camundongos. Com base neste dado e na ação de inibidores de serinoproteases sobre a angiogênese, este projeto foi delineado para caracterizar as ações do Amblyomin-X sobre a angiogênese in vivo e sobre funções da célula endotelial in vitro na vigência do fator de crescimento VEGF-A. Os efeitos do Amblyomin-X sobre a cinética de formação de novos vasos na rede microcirculatória in vivo foram investigados no modelo de câmara dorsal em camundongos e na membrana corioalantóica. Empregando cultura de células endoteliais de linhagem de microcirculação (t-End), foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X sobre viabilidade e citoproteção celular (anexina e iodeto de propídio - PI), proliferação celular (incorporação do fluoróforo diacetato de carboxi-fluoresceína succinimidil éster) e ciclo celular, além da expressão das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 e β3 integrinas em ensaios de citometria de fluxo. A aderência celular em Matrigel foi quantificada por espectrofotometria, a formação de tubos foi mensurada por microscopia óptica e a expressão gênica das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1 e VCAM-1 por RT-PCR. Os dados obtidos mostraram que a aplicação tópica do Amblyomin-X (100ng/10µL) reduziu a formação de novos vasos no tecido subcutâneo dorsal de camundongos, quando o tratamento foi iniciado anterior ou concomitantemente, mas não posteriormente ao tratamento ao VEGF (10ng/10µL) e, reduziu a formação de novos vasos na membrana corioalantóica, quando administrado concomitantemente com o VEGF (0,25ng/10µL). O Amblyomin-X não alterou a viabilidade de células t-End (1000ng/mL, 72 horas); inibiu a apoptose e apoptose tardia causada por meio de cultura carenciado (100ng/mL); inibiu a proliferação (10, 100 ou 1000ng/mL de Amblyomin-X, 48 e 72 horas); induziu parada nas fases G1/G0 do ciclo celular; diminuiu a aderência e a formação de tubos das células endoteliais; não alterou a expressão basal de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 e β3 integrinas, mas reduziu a expressão de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induzida pelo VEGF-A. A redução da expressão protéica da PECAM-1 e ICAM-1 parece não ser dependente de ação do Amblyomin-X na expressão gênica, já que os níveis de RNAm não foram afetados pela ação do Amblyomin-X. Em conjunto, os dados obtidos neste trabalho mostram que o Amblyomin-X inibe a formação de novos vasos in vivo, por interferir, possivelmente, em mecanismos relacionados a sinalização da célula endotelial induzida pelo VEGF-A, em especial com a proliferação, adesão , tubulogênese e expressão de moléculas de adesão da família das imunoglobulinas. / Amblyomin-X is a type-kunitz serineprotease inhibitor obtained from a cDNA library of the Amblyomma cajannense salivary glands. Preliminary data showed that in vivo injection of the protein reduced the formation of tumor-induced B16F10 melanoma cells in mice. Based on this data and on actions of serinorpoteases inhibitors on angiogenesis, this project aimed to characterize the actions of Amblyomin-X on angiogenesis in vivo and on in vitro endothelial cells functions in the presence of the growth factor VEGF. The effects of Amblyomin-X on the in vivo formation of microcirculatory new vessels were investigated in the dorsal chamber model in mice and in the chorioallantoic membrane assay. Mice microvascular endothelial cell lineage (t-End) was employed to evaluate the effects of Amblyomin-X on cytoprotection and cell viability (Annexin-V and propidium iodide-PI), cell proliferation (incorporation of the fluorophore fluorescein diacetate carboxy-succinimidil ester), cell cycle, membrane expression of PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 and β3 integrins adhesion molecules using flow cytometry. Cell adhesion was assessed in matrigel by spectrophotometry, the formation of tubes was measured by optical microscopy and adhesion molecules PECAM-1, ICAM-1 and VCAM-1 gene expression was evaluated by RT-PCR. Data obtained showed that topical application of Amblyomin-X (100ng/10µL) reduced the formation of new vessels, only when Amblyomin-X treatment started before or simultaneously to VEGF-A stimulation (10ng/10µL). Amblyomin-X (100ng/10µL) also reduced the formation of new vessels in the chorioallantoic membrane assay, when coadministered with VEGF (0.25ng/10µL). The Amblyomin-X did not alter the viability of t-End (1000ng/mL, 72 hours), inhibited apoptosis and late apoptosis caused by deprivated serum (100ng/mL), inhibited proliferation (10, 100 or 1000ng/mL, 48 and 72 hours), induced G1/G0 arrest in cell cycle phases, decreased the cell adhesion and tube formation (100ng/mL), did not alter the basal expression of PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 or β3 integrin, but reduced the PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induced by VEGF-A. Impaired PECAM-1 and ICAM-1 expression seems not be dependent on gene expression, as, mRNA levels were not affected by the action of Amblyomin-X. Together, the data obtained shows that the Amblyomin-X inhibits new vessel formation in vivo, by interfering, possibly, with mechanisms related to VEGF-A induced endothelial cell signaling, especially with the proliferation, adhesion, tubulogenesis and expression of adhesion molecules.

Orientador: Prof. Dr. Sergio Daishi Sasaki / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, São Bernardo do Campo, 2018. / A doença pulmonar obstrutiva crônica é uma doença caracterizada por progressiva limitação do fluxo aéreo e suas principais manifestações são a bronquite crônica e o enfisema pulmonar. O quadro é geralmente irreversível e engloba uma série de processos que incluem a resposta inflamatória anormal dos pulmões com participação ativa de macrófagos, neutrófilos e linfócitos, a falha na reparação de células anormais, a apoptose precoce e a destruição da matriz extracelular ocasionada pelo desequilíbrio entre proteases e antiproteases, sendo esse desequilíbrio apontado como um dos principais mecanismos que levam à instalação da doença. O tabagismo é a principal causa atribuída ao seu aparecimento, seguida por fatores genéticos e ambientais. Algumas enzimas estão relacionadas ao processo de patogênese da DPOC como a elastase de neutrófilos humana e as metaloproteinases 9 e 12. Em trabalhos anteriores o uso do inibidor de serinoproteases rBmTI-A, inibidor do tipo Kunitz-BPTI, resultou na prevenção do enfisema pulmonar por meio do controle da resposta inflamatória comumente observada, além de redução da atividade proteolítica presente no lavado broncoalveolar. Nesse trabalho, o objetivo inicial foi dar prosseguimento à pesquisa com rBmTI-A, com a caracterização da expressão gênica diferencial no modelo de enfisema animal utilizando camundongos, indução realizada com a administração de elastase pancreática porcina (PPE); para isso foi utilizado o ensaio de micro arranjo de DNA (Microarray). Os ensaios de Microarray resultaram na identificação de genes que respondem ao tratamento nos animais induzidos ao enfisema e que receberam o tratamento com rBmTI-A, dentre estes genes estão: genes do sistema imune e inflamação, genes da contração muscular, genes da tradução em mitocôndria e genes de outras funções celulares. Na segunda parte do trabalho, o inibidor de serinoproteases rBmTI-6-D1, inibidor Kunitz-BPTI, foi aplicado no modelo de enfisema pulmonar em camundongos, resultados obtidos previamente já haviam mostrado que rBmTI-6 também apresenta a capacidade de prevenir o desenvolvimento do enfisema induzido por PPE, neste trabalho mostramos que o tratamento utilizando rBmTI-6-D1 evita a perda do recolhimento elástico dos pulmões dos animais induzidos ao enfisema, bem como também evita a degradação alveolar, e o aumento do número de macrófagos e linfócitos nos lavados broncoalveolares dos animais que receberam tratamento em comparação com os que não receberam. Também foi demonstrado que rBmTI-6 evita o aumento de atividade proteolítica (calicreínas e elastase de neutrófilos) no lavado broncoalveolar de animais tratados com o inibidor e induzidos ao enfisema em comparação aos controles. Na terceira parte do trabalho, foram realizados ensaios em cultura de células A549 para investigar o potencial anti-inflamatório dos inibidores rBmTI-A, rBmTI-6-D1 e rBmTI-6-D2/3, a aplicação dos inibidores nestas células mostrou um aparente papel antiinflamatório por meio da diminuição da secreção das citocinas IL-6 e IL-8, no tratamento utilizando rBmTI-6-D1 e rBmTI-6-D2/3. Concluímos que os inibidores rBmTI-A e rBmTI-6 apresentam atividade que previne o desenvolvimento do enfisema induzido por PPE, devido às atividades antiproteases destes inibidores e por interferirem na resposta inflamatória. / Chronic obstructive pulmonary disease is characterized by progressive airflow limitation and its main manifestations are chronic bronchitis and pulmonary emphysema. It is generally irreversible and encompasses a series of processes that include the abnormal inflammatory response of the lungs with active involvement of macrophages, neutrophils and lymphocytes, failure to repair abnormal cells, early apoptosis, and destruction of the extracellular matrix caused by the imbalance between proteases and antiproteases, and this imbalance is one of the main mechanisms that lead to the establishment of the disease. Smoking is the main cause attributed to its onset, followed by genetic and environmental factors. Some enzymes are related to the pathogenesis of COPD such as human neutrophil elastase and metalloproteinases 9 and 12. In previous studies, the use of the serine proteinase inhibitor, rBmTI-A, a Kunitz- BPTI inhibitor type, resulted in the prevention of pulmonary emphysema by controlling of the inflammatory response commonly observed, as well as reducing the proteolytic activity present in bronchoalveolar lavage. In this work, the initial objective was to continue the research with rBmTI-A, with the characterization of differential gene expression in the emphysema model using mice, induced to emphysema by porcine pancreatic elastase (PPE) instillation; to reach this aim a microarray assay was performed. The microarray results in the identification of some genes which are affected by the treatment using rBmTI-A in animals that received PPE instillation previously. Among these genes were identified immune and inflammatory related genes, muscular contraction related genes, translation in mitochondria related genes and genes of other cellular functions. In the second part of this work, the serine proteinase inhibitor rBmTI-6-D1, other Kunitz-BPTI inhibitor type, was applied in the emphysema model using mice; previous results had shown that rBmTI-6 also presented the ability to avoid the emphysema development in the PPE instillation model. The present work we showed that the rBmTI-6-D1 treatment was sufficient to avoid the loss of elastic recoil, an effective decrease in alveolar enlargement and in the number of macrophages and lymphocytes in bronchoalveolar lavage fluid. Proteolytic analysis showed a significant increase in elastase activity in induced emphysema group that is controlled by rBmTI-6-D1. Kallikrein activity was decreased in the induced emphysema and inhibitor treated group when compared to induced emphysema group without treatment. In the third part of this work, assays using A549 cells were performed to investigate the anti-inflammatory potential of rBmTI-A, rBmTI- 6-D1 and rBmTI-6-D2/3 inhibitors. These inhibitors presented an apparent antiinflammatory role, due the reduced levels of IL-6 and IL-8 that were secreted by A549 cell when treated with rBmTI-6-D1 and rBmTI-6-D2/3. We concluded that rBmTI-A and rBmTI-6 inhibitors prevent the emphysema development induced by PPE, due the anti-proteinases activities of these inhibitors and by its interference in inflammatory response.