The RNA-binding protein HuR controls key cellular processes by binding target mRNAs and regulating them at various post-transcriptional levels. HuR can function as an Internal Ribosome Entry Site (IRES) trans-acting factor that regulates the IRES-mediated translation of XIAP. Since XIAP and Bcl-xL expression was reported to be co-regulated, we investigated whether HuR is also a regulat or of Bcl-xL expression. We found that HuR binds the 3’end of the Bcl-xL 5’UTR in-vitro. In U2OS cells, we showed that loss of HuR by siRNA significantly increased Bcl-xL protein expression while Bcl-2 and Mcl-1 levels remained unchanged. We found that the HuR-dependent Bcl-xL increase was through translation, shown by polysome profiling. Possible transcriptional, stability and splicing changes were eliminated. At the physiological level HuR levels did not impact cell survival but altered mitochondrial morphology, partially through Bcl-xL. Thus, HuR may be involved in maintaining proper mitochondrial function by controlling Bcl-xL expression.

The structure, kinetics, and interactions of the conserved 16mer and 15mer RNA motifs of the internal ribosome entry site (IRES) of the Foot-and-Mouth Disease virus (FMDV), have been investigated by homonuclear and heteronuclear NMR techniques. The 16mer RNA is endowed with a classic GNRA tetraloop motif, which is essential for IRES activity and the 15mer RNA motif is a potential tetraloop receptor. We have determined three high resolution NMR solution structures of the 16mer apo-RNA, the 16mer Mg2+ RNA complex and the 15mer apo-RNA with RMSDs of 0.17Å, 0.16Å and 0.35Å, respectively. The high precision of these NMR structures was achieved by including a large number of NMR experimental restraints, derived from NOEs and coupling constants, and validating them using the MolProbity program. The 16mer RNA structure comprised of six base pairs with a GUAA tetraloop and the 15mer RNA structure comprised of four base pairs and a large heptaloop; this is the first heptaloop to be studied by NMR.Addition of Mg2+ to the 16mer apo-RNA caused selective chemical shift changes to the stem G177 and loop G178 imino proton resonances, suggesting Mg2+-induced conformational change to the GUAA tetraloop. This was supported by a significant chemical shift change to the selectively 19F-labelled loop U179 in the 5-FU 16mer RNA. Furthermore, variable temperature experiments revealed retarded imino proton exchange for the stem and loop imino protons, demonstrating the enhanced thermodynamic stability conferred by Mg2+. This enhancement in stability was confirmed by measuring the imino proton exchange rates for the 16mer apo-RNA and the 16mer Mg2+ RNA complex. Analysis of the 16mer apo-RNA and its Mg2+ RNA complex NMR solution structures revealed that Mg2+-induced structural changes to the GUAA tetraloop act to stabilise the loop via stronger base stacking and intramolecular interactions. Fascinatingly, we discovered that Mg2+ ions provide increased stability required for the formation of a G.A sheared base pair in the GUAA tetraloop. RNA-RNA interactions between the 16mer and 15mer RNAs and their fluorinated analogues were studied by NMR spectroscopy. Small changes to chemical shift and linewidth of proton peaks in the non-fluorinated RNA-RNA complex provided evidence for a weak interaction between the loop of the 16mer RNA and the stem of the 15mer RNA. 19F-NMR experiments revealed additional peaks for the 19F-labelled U179 of the fluorinated 16mer/15mer RNA complex providing further good evidence of RNA-RNA interaction. The NMR structures of the conserved RNA motifs and their interactions have yielded important information in understanding the properties and behaviour of RNA. This will provide the first stepping stone in understanding the IRES mechanism and its use in antiviral therapy and biotechnology.

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Le facteur de transcription p53 joue un rôle crucial dans la suppression de tumeurs et dans la sénescence cellulaire. Selon la littérature, l’ARN messager de p53 contient deux sites d’entrée interne des ribosomes (IRES), un dans la région 5’ non-traduite et l’autre au début de la région codante. L’utilisation de ces IRES devrait activer la synthèse de p53 en conditions de stress, comme dans la sénescence. Notre but était d’identifier les éléments-clés qui contrôlent l’activité des IRES de p53 et d’étudier leur comportement dans la sénescence. Nous avons construit des vecteurs bicistroniques à deux luciférases contenant le gène de la Renilla (Rluc), traduit via le mécanisme classique coiffe-dépendant, une région intercistronique, contenant une des séquences IRES de p53, et le gène de la luciole (Fluc), dont la traduction dépend de cet IRES. L’activité IRES a été évaluée par le rapport des activités Fluc/Rluc dans des extraits cellulaires de HEK293T et de fibroblastes primaires humains. Nous avons inséré une structure précédant l’IRES évitant qu’une translecture ou une réinitiation de la traduction puisse conduire à la synthèse de Fluc. Nous avons vérifié l’absence de promoteur cryptique dans les IRES et nous avons construit des vecteurs contenant la séquence complémentaire inversée (SERI) des IRES. Nous avons observé que l’efficacité de traduction via les IRES de p53 ou les séquences SERI est semblable. De plus, la traduction de Fluc via les présumés IRES de p53 ne représente qu’environ 1% de la traduction de Fluc via une initiation coiffe-dépendante. L’activité des prétendus IRES ne semble pas augmenter en conditions de sénescence. Enfin, nous avons introduit une région structurée dans la région 5’UTR du messager bicistronique. Cette structure a bloqué la traduction coiffe-dépendante mais aussi la traduction IRES-dépendante. L’ensemble de nos résultats nous conduit à affirmer que l’ARN messager de p53 ne contient pas d’IRES et nous suggérons que la faible activité Fluc observée résulterait d’un épissage cryptique conduisant à l’apparition d’un messager dont la traduction génère une portion de Rluc fusionnée à Fluc. Nos résultats sont en accord avec des données rapportées dans la littérature démontrant que l’existence de la plupart des IRES cellulaires est contestée. Un ensemble de contrôles rigoureux doit être appliqué à l’étude de tout IRES présumé avant d’affirmer son existence. Le système à deux luciférases, considéré comme le modèle de choix pour l’étude des IRES, peut en fait révéler diverses anomalies de l’expression des gènes. / p53 is a transcription factor that plays a crucial role in tumor suppression and cellular senescence. According to the literature, the p53 mRNA contains two internal ribosome entry sites (IRES), one in the 5’ untranslated region and the other one at the beginning of the coding region. The two IRES should enable the synthesis of p53 to occur under stress conditions, such as senescence. The aim of our study was to identify the key elements that control the activity of the two p53 IRES and to study their behavior in senescence. We constructed two dicistronic vectors containing the Renilla luciferase gene (Rluc), which is translated in a classical cap-dependent manner, an intercistronic region containing one of the two IRESs sequences of p53, and the firefly luciferase gene (Fluc), whose translation depends on the IRES in the intercistronic region. The IRES activity was assessed by the ratio between the two luciferase activities (Fluc/Rluc) in cell extracts from HEK293T and primary human fibroblasts. We also inserted a structure preceding the IRES sequence that prevented readthrough or translation reinitiation, which could lead to Fluc synthesis. We verified the absence of cryptic promoter in the two IRES sequences. We also constructed vectors containing the reverse complement region of each of the two p53 IRES (called SERI). We found that the efficiency of translation of Fluc via IRES sequences or via SERI sequences is similar. In addition, the level of Fluc translated via the presumed p53 IRES represents only 1% of the level of Fluc translated in a cap-dependent manner. The activities of so-called IRES of the p53 messenger do not increase in senescent human fibroblasts. Finally, the introduction of a structured region in the 5'UTR of the dicistronic messenger repressed not only the cap-dependent translation of Rluc but also the IRES-dependent translation of Fluc. Our results lead us to conclude that the p53 messenger does not contain any IRES and suggest that the low Fluc activity observed results from a cryptic splicing producing a messenger whose translation generates a portion of Rluc fused to Fluc. Our results are consistent with data reported in the literature showing that the existence of most cellular IRES is disputed. A set of stringent controls must be applied to the study of any presumed IRES before asserting its existence. The two-luciferase reporter, considered as the model of choice for studying IRES-translation, can in fact reveal various abnormalities of gene expression.

Une des caractéristiques des cellules cancéreuses réside dans la modification de leur capacité à répondre à divers stress par rapport à des cellules saines. La modulation afférente de l'expression de gènes peut se produire à deux niveaux : transcriptionnel et post-transcriptionnel. La plupart des efforts de compréhension ont été axés sur l'étude la régulation transcriptionnelle. Néanmoins, une façon efficace et rapide de modifier l'expression des gènes est la capacité de réguler le " pool d'ARNm " pré-existant en intervenant au niveau post-transcriptionnel. Aussi, les modifications de la stabilité de l'ARNm et/ou de l'efficacité de traduction dans un contexte particulier tel que le stress tumoral et faisant intervenir des interactions ARN/protéines sont de plus en plus étudiés dans le cas des cancers. Une compréhension plus approfondie de ces mécanismes permettra de mieux comprendre 1/ l'implication des protéines liant l'ARN (RBP) dans le développement tumoral et 2/ considérer le développement de thérapies ciblées contre le cancer. Nous nous sommes concentrés sur l'étude d'une RBP pertinente vis à vis du cancer, mais très peu étudiée sur cette problématique : la protéine Staufen1 (Stau1). Stau1 est un membre de la famille des protéines qui lient l'ARN double-brin. Cette RBP contribue à la régulation post-transcriptionnelle de nombreux gènes par son implication dans des mécanismes qui vont promouvoir le transport, la dé-répression de la traduction et l'induction de la dégradation d'ARN messagers (ARNm) spécifiques. Stau1 apparait également comme un régulateur spécifique de l'expression génique intervenant dans un contexte particulier de stress cellulaire, contexte familier aux tumeurs en cours de développement. Les transcrits régulés par Stau1 se classent dans un large éventail de catégories fonctionnelles et il est intéressant de noter qu'une grande proportion d'entre eux code pour des protéines impliquées dans la régulation de processus biologiques cellulaires critique dans le développement de cancers. De part son rôle de régulateur de l'expression génique et son implication dans la réponse au stress cellulaire, nous avons émis l'hypothèse que la modification de l'expression de Stau1 puisse avoir un impact à différent niveaux sur le développement et la progression tumorale. Ce projet de thèse s'est orienté sur deux axes 1) l'étude de l'expression de Stau1 en condition de stress cellulaire et 2) l'effet de la répression de Stau1 sur le développement tumoral. / One of the characteristics of cancer cells lies in the modification of their ability to adapt to various stresses compared to healthy cells. The afferent modulation of gene expression can occur at two levels: transcriptional and post-transcriptional. Most of the efforts for understanding the gene expression process are focused on transcriptional regulation study. However, a quick and effective way to modify gene expression is the ability to regulate the "mRNA pool" by intervening in post-transcriptional level. Besides, changes in mRNA stability and/or translation efficiency in a context such as cellular stress in tumors and interactions involving RNA / protein are increasingly studied in the case of cancers. A deeper knowledge of these mechanisms will allow a better understanding of 1 / the involvement of RNA binding proteins (RBP) in tumor development and the 2 / the consideration of the development of targeted cancer therapies. We focused on the study of a relevant RBP for cancer development process, but very few studies have been undertaken on this issue: the Staufen1 protein (Stau1). Stau1 is a family member of double-stranded RNA-binding proteins. This RBP contributes to the post-transcriptional regulation of many genes through its involvement in mechanisms that will promote the transport, the derepression of translation and the induction of degradation of specific RNA transcripts (mRNA). Stau1 also appears as a regulator of specific genes expressed in respond to cellular stress induced by an unfavorable tumor microenvironment. The transcripts regulated by Stau1 can be divided into a wide range of functional categories. Interestingly, a large proportion of Stau1 targets encode proteins which regulate many critical biological cell processes in cancer development. Regarding Stau1 regulatory role and its involvement in the response to cellular stress, we made assumptions that the modification of Stau1 expression could have an impact on various levels of development and tumor progression. This project will be considered from two aspects 1/ the study of Stau1 expression under cellular stress 2/ the impact of Stau1 repression on tumor development.

Le système lymphatique a pour rôle principal de drainer les fluides tissulaires et de participer à la surveillance immune. La lymphangiogenèse est principalement activée par deux facteurs : les vascular endothelial growth factors-C et -D (VEGF-C et VEGF-D). Ces facteurs participent à la progression métastatique à la fois en stimulant la prolifération des vaisseaux lymphatiques dans la tumeur et en périphérie et en provoquant la dilatation des vaisseaux collecteurs facilitant ainsi le passage des cellules tumorales de la tumeur primaire aux ganglions lymphatiques. Lors de son développement, une tumeur est soumise à de nombreux stress cellulaires tels que l'hypoxie, l'inflammation ou la déprivation en nutriments. Ma thèse a donc été consacrée à l'analyse des régulations moléculaires permettant une surexpression des facteurs lymphangiogéniques en condition de stress cellulaire. Lors d'un premier projet de recherche j'ai démontré que l'hypoxie réduit la transcription de VEGF-C ainsi que sa traduction coiffe-dépendante mais activait une traduction médiée par un site interne d'entrée du ribosome (IRES). De plus, cette activation de la synthèse de VEGF-C en hypoxie est indépendante de HIF-1a et stimule la lymphangiogenèse dans les tumeurs ainsi que dans les ganglions lymphatiques participant ainsi à la dissémination tumorale. Dans un second temps, j'ai démontré que le VEGF-D possédait lui aussi un IRES activé par un choc thermique. L'activité de l'IRES du VEGF-D est régulée par la localisation subcellulaire d'un facteur trans-activateur de l'IRES (ITAF) : la nucléoline. Cette protéine est exportée du noyau vers le cytoplasme lors d'un choc thermique. Ce processus est inhibé par un traitement avec un anti-inflammatoire non stéroïdien ce qui supprime l'activation de la traduction IRES dépendante du VEGF-D. Enfin lors d'un troisième projet, j'ai travaillé sur le lymphœdème secondaire, une pathologie caractérisée par une destruction du système lymphatique où la lymphangiogenèse doit être stimulée. J'ai évalué l'impact de l'hormonothérapie, principal traitement du cancer du sein, sur l'expression du VEGF-C et -D. J'ai démontré que l'estradiol stimulait l'expression de ces facteurs alors que l'hormonothérapie diminue leur synthèse et provoque une destruction de l'endothélium lymphatique. En conclusion, mes trois projets de thèse m'ont permis d'étudier les régulations moléculaires des deux facteurs lymphangiogéniques principaux dans des pathologies provoquées par une lymphangiogenèse excessive ou insuffisante. / Tumor lymphangiogenesis promotes lymph node metastasis using two mechanisms consisting of lymphatic vessels proliferation and dilatation to facilitate tumor spread. Lymphangiogenesis is mainly promoted by two growth factors: the vascular endothelial growth factor C and D. My PhD was focused on the molecular regulations inducing a tumoral over-expression of these two factors during stress. I demonstrated that hypoxia reduced VEGF-C transcription and cap-dependent translation while activating an Internal Ribosome Entry Site (IRES)-dependent mechanism of translation. This upregulation of VEGF-C in hypoxia is independent of HIF-1a; and stimulates lymphangiogenesis in tumors and lymph nodes and contribute to lymphatic metastasis. Then, I have discovered that VEGF-D had an IRES selectively activated by heat shock. VEGF-D IRES is regulated by a subcellular relocalization of an ITAF, the nucleolin. This molecular process is reversed by non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAID) that decrease VEGF-D IRES translation initiation by targeting the nucleolin. Finally, I worked on secondary lymphedema, a pathology that is characterized by a disruption of the lymphatic network where lymphangiogenesis thus need to be restored. In this condition, I have evaluated the impact of hormone therapy, the main treatment for breast cancer, on the regulation of lymphangiogenic factors. I found that estradiol stimulates the expression of VEGF-C and-D contrary to the hormone therapy that inhibits VEGF-C and -D and thus mediates a disruption of the lymphatic endothelium. Taken together, my PhD projects have allowed me to study the regulations of VEGF-C and -D in pathologies mediated either by an excessive or an insufficient lymphangiogenesis.

La cellule est susceptible de modifier l'expression de ces gènes en fonction de son environnement. Dans les cellules eucaryotes, la régulation de l'expression de ces gènes se présente dans plusieurs étapes. Cette régulation peut intervenir dès la transcription de l'ADN jusqu'au devenir des transcrits. La régulation post-transcriptionnelle tient un rôle déterminant dans la synthèse protéique. Elle regroupe l'ensemble des contrôles qui s'exercent sur les transcrits. Cette régulation est induite en réponse à différents stimuli comme la différenciation ou lors de stress cellulaires. En situation de stress, la traduction canonique dépendante de la coiffe est bloquée, à l'exception de certains ARNm essentiels pour assurer la survie des cellules. De ce fait, les cellules mettent en place un mécanisme alternatif afin de continuer la traduction. Un des mécanismes de traduction, implique le site d'entrée interne du ribosome ou IRES (Internal Ribosome Entry Site). L'IRES est une séquence en structure secondaire dans la partie 5' non-traduite de certains ARNm. Il existe des facteurs responsables de leur activation appelés ITAF ou IRES-transacting factor, permettant le recrutement des ribosomes pour initier la traduction. Les protéines pouvant se lier aux ARN sont les acteurs majeurs de l'activation des IRES. Mon travail de thèse est d'étudier les régulateurs post-transcriptionnels en réponse à différents stimuli par le biais de la traduction IRES-dépendante. Dans la première partie de mon projet, nous avons montré la régulation de la traduction via l'activation de l'IRES du FGF1 et ce de manière promoteur-dépendante au cours de la différenciation des myoblastes. Grâce à la technique de résonance plasmonique de surface (SPR) nous avons découvert deux protéines p54nrb/NONO et hnRNPM en tant qu'ITAF capables de former un complexe pour activer l'IRES du FGF1 durant la différenciation des myoblastes. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons démontré l'existence de l'IRES du VEGFD durant un choc thermique dans les cellules cancéreuses. Nous avons aussi découvert que cette activation est médiée par un ITAF qui est la nucléoline, jamais démontrée auparavant comme ITAF de l'IRES du VEGFD. D'après nos résultats, le stress thermique induit la délocalisation de la nucléoline du noyau vers le cytoplasme pour changer la conformation de l'IRES du VEGFD afin de continuer sa traduction. Dans la troisième partie de mon projet, j'ai étudié de manière générale la régulation des gènes angiogéniques et lymphangiogéniques. L'ensemble des données montre que ces gènes sont majoritairement régulés au niveau traductionnel dans les cardiomyocytes en condition hypoxique. En étudiant les IRES angiogéniques et lymphangiogéniques, nos résultats montrent l'activation de ces IRES à différents temps au cours de l'hypoxie précoce. Dans la même condition, nous avons découvert la protéine vasohibin-1 comme ITAF hypoxique et spécifique de l'IRES du FGF1 dans les cardiomyocytes. En conclusion, nous avons découvert différents ITAF spécifiques à un IRES et en fonction du stress. P54nrb/NONO, hnRNPM sont des ITAF de l'IRES du FGF1 durant la différenciation cellulaire et la vasohibine-1 en hypoxie dans les cardiomyocytes. La nucléoline permet d'activer un IRES du VEGFD en réponse au choc thermique. / In cell, gene expression can be modified depending on the cellular microenvironment. Regulation of gene expression occurs at different levels, ranging from the transcription of the DNA to the mRNA. Among the post- transcriptional regulation, the control of translation plays a crucial role. In particular, the translational regulation occurs in response to different stimuli such as cell differentiation or cell stress. In stress condition, the canonical cap-dependent translation is blocked, excepted some mRNAs that are translated by alternative mechanisms. One of these mechanisms involves the structural elements of the mRNAs, the IRES (Internal Ribosome Entry Sites). The IRES activation involves some factors called ITAFs (IRES trans-acting factors), which allow the internal recruitement of ribosomes to initiate translation. My thesis is to study the mechanisms of IRES-dependent translation regulation in response to different stimuli, and to identify ITAFs responsible for this regulation. In the first part of my project, we have shown that the translation controlled by the FGF1 mRNA IRES is activated. This activation depends on its own promoter during the early phase of murine myoblast differentiation. Through biomolecular interaction analysis technology by surface plasmon resonance coupled to mass spectrometry (BIA/MS), we identified two proteins, p54nrb/NONO and hnRNPM bound both to the IRES and the FGF1gene promoter. These two proteins are both ITAFs activators of IRES and activators of FGF1 promoter transcription, resulting in a coupling of transcription and translation responsible for the induction of the FGF1 expression during myoblast differentiation. In the second part of this thesis, we demonstrated the existence of an IRES within the VEGFD mRNA. This IRES is activated by heat shock in mammary murine carcinoma. BIA/MS technology has enabled us to identify nucleolin as ITAF responsible for this activation. SHAPE experiments revealed the presence of two alternative structures of VEGFD IRES. According to our results, the heat shock induced the relocation of nucleolin from the nucleus to the cytoplasm, suggesting its binding to the mRNA in the cytoplasm could stabilize the conformation of the mRNA VEGFD IRES and activate its translation. The third part of my thesis focused on translational regulation of lymphangiogenic and angiogenic genes into cardiomyocytes in hypoxic conditions. The data obtained by the semi-global approach Fluidigm indicate that only few genes are induced at the transcriptional level, while the majority of them, especially those which have the mRNA IRES, are activated at translational level in hypoxic cardiomyocytes. I have also shown that the mRNA IRES of factors (lymph)angiogenic VEGF and FGF are activated during early hypoxia. Through Technology BIA/MS, I identified a specific hypoxic ITAF of FGF1 IRES in cardiomyocytes: it is the vasohibin - 1 protein involved in angiogenesis and stress tolerance. So, my thesis has enabled to make progress in understanding the mechanisms of IRES-dependent translation regulation. In addition, I have demonstrated that in cardiomyocytes during hypoxia the gene expression is surprisingly regulated at translational level. My work led to the identification of several molecular actors responsible for the regulation of mRNA (lymph)angiogenic factors translation, which could play a key role in ischemic pathologies and in cancer, and provide new targets therapeutic.

Le ribosome est une machine biomoléculaire primordiale pour la survie de tout organisme du fait de son rôle central au sein de la synthèse protéique. La caractérisation des interactions avec ses nombreux partenaires est un élément crucial pour mieux comprendre les mécanismes de la traduction et de son inhibition chez les eucaryotes et procaryotes. Cette inhibition est d’ailleurs une stratégie utilisée par beaucoup d’antibiotiques ciblant le ribosome pour lutter contre les infections bactériennes. La compréhension de leur mode d’action est devenue une priorité mondiale pour faire face au problème de la résistance bactérienne. Chez les eucaryotes, une autre stratégie est employée par les virus pour bloquer et s’approprier la machinerie traductionnelle de l’hôte grâce à des structures d’ARN non codant (IRES) capables de recruter directement le ribosome. Bien que largement caractérisés, peu de données thermodynamiques et cinétiques sont disponibles concernant ces deux systèmes d’interaction avec le ribosome. Mon projet a pour vocation d’utiliser des approches biophysiques innovantes afin de compléter les études sur les interactions du ribosome d’E. coli avec les macrolides, et du ribosome de S. cerevisiae avec l’IRES intergénique du CrPV. / The ribosome is a biomolecular machine essential for the survival of any organism due to its central role in protein synthesis. The characterization of its interactions with its many partners is a crucial element in better understanding the mechanisms of translation and inhibition in eukaryotes and prokaryotes. Inhibition of translation is a strategy used by many ribosome-targeting antibiotics to fight bacterial infections. Understanding their mode of action has become a global priority in addressing the problem of bacterial resistance. In eukaryotes, another strategy is used by viruses to block and appropriate the host's translational machinery through non-coding RNA structures (IRES) capable of directly recruiting the ribosome. Although widely characterized, few thermodynamic and kinetic data are available for these two ribosome interaction systems. My project is intended to use innovative biophysical approaches in order to provide an original view of the interactions of the E. coli ribosome with macrolides, and of the S. cerevisiae ribosome with the intergenic IRES of the CrPV.

p53 is a nodal tumor suppressor protein that acts as a major defense against cancers. Approximately 50% of human tumours have mutations in p53 gene. Among its myriad features, the most distinctive is the ability to elicit both apoptotic death and cell cycle arrest. p53 has several isoforms. Most of them are produced by either internal promoter activity of the gene or alternate splicing of the pre-mRNA. Apart from these mechanisms, p53 mRNA has also been shown to be translated into two isoforms, the full-length p53 (FL-p53) and a truncated isoform ΔN-p53, which acts as a dominant-negative inhibitor of FL-p53. Under conditions of cellular stress, the canonical mode of translation initiation is compromised. To maintain the synthesis of proteins important for cell survival and cell-fate decisions, a subset of cellular mRNAs utilizes a non-canonical mode of translation initiation. The 5’ untranslated region of these mRNAs are highly structured and function as Internal Ribosome Entry Site (IRES). Previously, from our laboratory it has been shown that translation of p53 and its N-terminally truncated isoform ΔN-p53 can be initiated by IRES mediated mechanism. IRES mediated translation of ΔNp53 was maximum at G1-S phase but that of FL-p53 was maximum at the G2-M phase. Interestingly in case of a human genetic disorder X-linked dyskeratosis congenita (X-DC), aberrant IRES mediated p53 translation has been reported. It has also been reported that during oncogenic induced senescence (OIS) a switch between cap-dependent to IRES meditated translation occurs in p53 mRNA. From our laboratory, we have also demonstrated that polypyrimidine tract binding protein (PTB) positively regulates the IRES activities of both the p53 isoforms by shuttling from nucleus to the cytoplasm during genotoxic stress conditions. It is very important to understand how these two isoforms are regulated and in turn control the cellular functions. In the first part of the thesis, to investigate the importance of the structural integrity of the cis acting elements within p53 RNA, we have compared the secondary structure of the wild-type RNA with cancer-derived silent mutant p53 RNAs having mutations in the IRES elements such as L22L (CTA to CTG) a natural cancer mutation and Triple Silent Mutation (mutations were present at the wobble position of codon 17, 18, 19). These mutations result in the conformational alterations of p53 IRES RNA that abrogates the IRES function ex vivo significantly. It appears that these mutant RNAs failed to bind some trans-acting factors (p37, p41/44 etc) which might be critical for the IRES function. By super-shift assay using anti hnRNPC1/C2 antibody, we have demonstrated that the TSM mutant showed reduced binding to this protein factor. Partial knockdown of hnRNP C1/C2 showed significant decrease in p53 IRES activity and reduced synthesis of ΔN-p53. Also we have showed that introducing compensatory mutations in TSM mutant RNA rescued the secondary structure as well as function of p53 IRES. Further, the role of another silent point mutation in the coding sequence of p53 was investigated. Silent mutation (CCG to CCA) at codon 36 (P36P) showed decreased IRES activity. The mutation also resulted in differential binding of cellular proteins. Taken together, our observations suggest pivotal role of some specific trans acting factors in regulating the p53-IRES function, which in turn influences the synthesis of different p53 isoforms. In the second part of the thesis, p53 IRES RNA interacting proteins were identified using RNA affinity approach. Annexin A2 and PTB associated Splicing Factor (PSF/SFPQ) were identified and their interaction with p53 IRES RNA in vitro and ex vivo was studied. Interestingly, in the presence of Ca2+ ions Annexin A2 showed increased binding with p53 IRES. By competition UV crosslinking we have showed Annexin A2 and PSF interact specifically with p53 IRES. Toe printing assay results showed the putative contact points of Annexin A2 and PSF proteins on p53 IRES RNA. Interestingly, both proteins showed extensive toe-prints in the neighbourhood of the initiator AUG region of p53. Further, competition UV-crosslinking reveals the interplay of these two proteins. Annexin A2 and PSF appear to compete each other for binding with p53 IRES. PSF is known to interact with PTB protein. Since PTB also interacts with p53 IRES and positively regulates the translation, we wanted to study the interplay between PTB and PSF proteins binding with p53 IRES. To address this, we have performed competition UV crosslinking experiment and showed that increasing concentrations of PTB decreases PSF and p53 IRES interaction. However, increasing concentrations of PSF does not decrease or increase in PTB p53 IRES interaction. Results suggest that both Annexin A2 and PSF proteins play important role in regulation of p53 IRES activity. To address the physiological role of Annexin A2 and PSF proteins on p53 IRES activity, these proteins were partially knocked down in cellulo. This in turn showed decrease in p53 IRES activity in dual luciferase assays as well as in the steady state levels of both the p53 isoforms in transient transfection experiments. Heightened or continued expression of p53 protein is very important under stress where IRES-dependent translation supersedes normal cap-dependent translation. Results showed that expression of Annexin A2 under doxorubicin and thapsigargin induced stress are important for maintenance of both p53 IRES activity and steady state levels of p53 isoforms. Earlier from our laboratory we have showed that the IRES responsible for ∆N-p53 translation is active at G1/S phase while the IRES responsible for full length p53 translation is active at G2/M phase. Subcellular localization of the trans-acting factors plays a pivotal role in regulation of IRES activity of cellular mRNA. In this context we wanted to study the nuclear and cytoplasm localization of Annexin A2 under different cell cycle stages. We have seen Annexin A2 protein is dispersed in nucleus and cytoplasm at G1/S boundary, but post-G2 phase it moved from nucleus to cytoplasm. Further we wanted to investigate the effect of Annexin A2 and PSF on expression of p53 transactivated genes. Partial knock down of Annexin A2 and PSF proteins showed decrease in p21 luciferase activity. By real-time PCR analysis, we have also showed decrease in expression of different p53 targets upon silencing of Annexin A2 protein. Taken together, our observations suggest pivotal role of cis acting and trans-acting factors in regulating the p53-IRES function, which in turn influences the synthesis of p53 isoforms.

L'ARN génomique du Virus de l'Immunodéficience Humaine-1 (VIH-1) est multifonctionnel. Il constitue le génome encapsidé dans les virions et sert d'ARN messager pour la traduction des protéines virales Gag et Gag-Pol. La traduction de ces protéines dépend exclusivement de la machinerie traductionnelle cellulaire et est initiée par deux mécanismes différents : l'initiation canonique dépendante de la coiffe et l'initiation par entrée interne des ribosomes (IRES). Le VIH-1 présente deux IRES, l'un dans la région 5' non traduite (5'-UTR) qui est stimulé en phase G2/M du cycle cellulaire et l'autre dans la région codante de Gag. Ce dernier permet l'initiation de la traduction sur deux AUG en phase et conduit à la production de la protéine Gag pleine longueur mais également à la production d'une isoforme alternative de Gag, tronquée en région N-terminale. Le rôle de cette isoforme reste mal connu. Toutefois la mutation du second AUG chez VIH-1 et donc la suppression de la seconde isoforme de Gag provoque une diminution importante du taux de la réplication virale. La conservation structurelle et fonctionnelle de l'IRES Gag parmi les lentivirus suggère un rôle important de cette isoforme et de l'IRES gag dans le cycle viral. Nos travaux visent à comprendre à un niveau moléculaire les relations hôtes-pathogènes lors de la traduction des messagers viraux. Je me suis particulièrement intéressée aux rôles de la sous unité ribosomale 40S et de l'hélicase cellulaire DDX3 dans l'initiation de la traduction de la polyprotéine Gag du VIH-1. La première partie de ma thèse est consacrée à l'étude de l'interaction entre la sous unité ribosomale 40S et l'IRES gag du VIH-1. Par l'utilisation d'approches complémentaires, nous avons pu démontrer la présence de deux sites distincts de liaison au ribosome qui sont présents à proximité des deux codons d'initiation. Nous avons ensuite évalué à la fois in vitro et in cellulo (en collaboration avec l'équipe de T. Ohlmann, CIRI-ENS-Lyon) l'effet de la délétion de chacun des sites de liaison au 40S sur l'efficacité de traduction de la polyprotéine Gag. Nos résultats valident l'importance fonctionnelle des sites de liaison au ribosome pour une production optimale des deux isoformes de la polyprotéine Gag. La seconde partie de mon travail a consisté à définir le rôle de DDX3 dans l'initiation « coiffe-dépendante » de la traduction de la polyprotéine Gag. DDX3 est une hélicase à ARN à boîte DEAD impliquée dans de nombreux processus cellulaires tels que la régulation du cycle cellulaire et la réponse immunitaire innée mais également dans tous les aspects du métabolisme de l'ARN comme la transcription, l'épissage, l'export nucléaire ou encore la traduction. Plus récemment, il a été montré que DDX3 est nécessaire à la traduction de l'ARN génomique du VIH-1, cependant son rôle exact n'a pas encore été défini. Nous avons purifié une forme recombinante de la protéine en fusion avec la MBP (Maltose Binding Protein) et effectué des cinétiques enzymatiques afin de caractériser ses propriétés biochimiques. Contrairement à ce qui a été précédemment décrit, nos résultats montrent que DDX3 possède une activité ATPase strictement ARN-dépendante avec des constantes cinétiques similaires à celles de son homologue chez la levure, Ded1p. Nous avons également évalué l'activité hélicase de la protéine en présence de substrats de longueur et de nature variables (duplex ARN/ARN ou des hétéroduplex ADN/ARN). D'un point de vue fonctionnel, nous avons réalisé une première série d'expériences qui confirme la stimulation exercée par DDX3 sur la traduction de Gag in vitro. Ces résultats permettent d'envisager la caractérisation biochimique fine des interactions DDX3-ARN viral ainsi que de disséquer le rôle de DDX3 dans l'expression du génome viral. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) genomic RNA is multifunctional. It acts both as a genome that is packaged within virions and as messenger RNA translated to yield the Gag and Gag-Pol polyproteins. The translation of these proteins relies exclusively on the cellular translation machinery and is initiated through two mechanisms: the canonical cap-dependent initiation pathway and the use of internal ribosome entry sites (IRESes). HIV-1 has two IRESes, one located within the 5' UTR (5' UnTranslated Region) that is stimulated during the G2/M phase of the cell cycle, and the other embedded within the Gag polyprotein coding region. The later drives translation initiation from two AUG in frame and results in the production of the full-length Gag protein but also of an additional N-terminally truncated Gag isoform. Few things are known about this isoform, but the mutation of the second AUG causes a significant decrease in the rate of viral replication. The structural and functional conservation of Gag IRES among lentiviruses suggests an important role of this isoform and thus of the IRES in the viral cycle. Our work aims to understand at a molecular level the host-pathogen relationships in the translation of the viral messenger RNA. My work focused on the roles of the 40S ribosomal subunit and of the cellular helicase DDX3 in the translation initiation of Gag. During the first part of my Phd, I studied the interaction between the 40S ribosomal subunit and HIV-1Gag IRES. Following complementary approaches, we evidenced two distinct ribosome binding sites present close to the two the initiation sites of Gag. Then, we evaluated the effect of each 40S binding site deletion on Gag translation efficiency, both in vitro and in cellulo (in collaboration with the team of T. Ohlmann, CIRI-ENS-Lyon). Taken together, our results confirm the functional relevance of the two ribosomal binding sites to ensure optimal production of the two Gag isoforms. The second part of my Phd project aims to define the role of DDX3 in the translation initiation of Gag. DDX3 is a RNA DEAD-box helicase involved in many cellular processes such as cell cycle regulation and the innate immune response but also in all aspects of RNA metabolism such as transcription, splicing, mRNA nuclear export and translation. Recently DDX3 has been shown to favor HIV-1 Gag translation. To define its role, we first purified a recombinant form of the protein and performed kinetic experiments to analyze its biochemical properties. Contrary to what has been previously described, MBP-DDX3 displays a strictly RNA-dependent ATPase activity with kinetic constants similar to those displayed by its yeast counterpart Ded1p. We next evaluated MBP-DDX3 helicase activity towards RNA duplexes or RNA/DNA hybrids, with different length and single strand overhangs. Our preliminary results indicate that DDX3 alone is sufficient to enhance Gag translation in our in vitro system which paves the way to fine biochemistry experiments such as reconstruction of functional initiation complexes assembled onto Gag RNA and evaluation of its role on Gag RNA structure.