Majorer la tolérance de l’hôte à l’inflammation est un facteur qui pourrait diminuer l’ampleur des lésions tissulaires au cours des pathologies inflammatoires. Dans ce travail, nous rapportons que la molécule clusterine, une protéine chaperonne extracellulaire très conservée et présente dans la plupart des tissus et fluides biologiques, neutralise les effets cytotoxiques de molécules associées à l’inflammation. Le taux sérique de clusterine est diminué chez les patients atteints de certaines maladies inflammatoires, et les souris déficientes en clusterine ont une sensibilité plus importante à l’inflammation. Clusterine interagit avec certaines molécules associées à l’inflammation et forme des complexes qui sont détectés dans le sérum des patients. In vitro, clusterine inhibe la mort cellulaire induite par les molécules associées à l’inflammation. Bien que l’inflammation induise la libération rapide d’un stock préformé contenu dans les polynucléaires neutrophiles et les plaquettes, les taux de clusterine sérique sont abaissés chez l’homme et la souris en contexte inflammatoire. Démontrant la non redondance et le rôle protecteur de clusterine, l’inflammation est majorée chez la souris déficiente en clusterine.Nous concluons que clusterine augmente la tolérance de l’hôte à l’inflammation. / Increasing host tolerance to inflammation may lower the intensity of tissular injury in inflammatory diseases. We report here that clusterin, a conserved extracellular chaperone, present in most tissues and fluids, neutralizes the in vitro and in vivo cytotoxic properties of inflammation-induced molecules. Serum clusterin levels are decreased in patients with some inflammatory diseases and clusterin deficient mice have higher sensibility to inflammation.Clusterin interacts with some inflammation-associated molecules and form complexes that are detected in human serum and, consequently, prevents in vitro cell death induced by these molecules. Although inflammation triggers the rapid release of preformed clusterin stock by neutrophils and platelets, serum clusterin concentrations get down in inflammatory conditions in human and mice. Inflammation is boosted, in vivo and in vitro, using clusterin-deficient mice, showing the non-redundant and major protective roles of clusterin. We conclude that clusterin enhances host tolerance to inflammation.

Les lymphocytes « Natural Killer » (NK) sont des effecteurs de l’immunité innée, capables de lyser les cellules cancéreuses grâce au relargage de la protéase cytotoxique Granzyme B (GzmB). Récemment, de nouvelles stratégies anti-cancéreuses, basées sur l’utilisation des cellules NK, ont émergé et se sont révélées très prometteuses. Il est maintenant clairement établi que le microenvironnement tumoral hypoxique influence la réponse immunitaire et constitue, de ce fait, un obstacle majeur pour établir des protocoles d’immunothérapies efficaces. Des études récentes ont montré que l’autophagie est un régulateur important de l’immunité innée dans le microenvironnement tumoral, mais les mécanismes de régulation impliqués restent encore peu connus. Nous avons montré in vitro que l'hypoxie diminue la sensibilité des cellules de carcinome mammaire à la lyse dépendante des cellules NK par un mécanisme impliquant l'activation de l'autophagie. De manière intéressante, cette diminution de lyse est reversée par l’inhibition de l’autophagie. Nous avons démontré que la résistance des cellules tumorales hypoxiques à la lyse par les cellules NK n'est liée ni à un défaut de reconnaissance des cellules cibles, ni à une altération de l’activité cytotoxique des effecteurs. Nous avons mis en évidence que l'activation de l’autophagie conduit à la dégradation de GzmB dans les lysosomes des cellules hypoxiques. Ainsi, ces cellules deviennent résistantes à l’apoptose, qui est normalement induite par GzmB, transféré par les cellules NK. L’invalidation génétique et pharmacologique de l'autophagie permet de restaurer le niveau intracellulaire de GzmB et réduit la résistance des cellules cibles hypoxiques in vitro. Nos résultats mettent en évidence que l'autophagie est un régulateur primordial de la réponse immunitaire anti-tumorale dépendante des cellules NK. Nous avons validé ce concept in vivo en montrant que l’inhibition de l'autophagie favorise de manière significative la prise en charge de la tumeur par les cellules NK dans des modèles murins de mélanome et de carcinome mammaire. Cette étude contribue à l’avancé des connaissances sur la manière dont l'autophagie, induite par l'hypoxie, affecte la lyse dépendante des cellules NK et ouvre la voie à la formulation de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-tumorales combinant l’utilisation des cellules NK à des inhibiteurs d'autophagie. / Natural killer (NK) cells are effectors of the antitumor immunity, able to kill cancer cells through the release of the cytotoxic protease granzyme B. NK-based therapies have recently emerged as promising anticancer strategies. However, it is well established that hypoxic microenvironment interferes with the function of antitumor immune cells and constitutes a major obstacle for cancer immunotherapies. Recent studies demonstrated that autophagy is an important regulator of innate immune response in this microenvironment, but the mechanism by which autophagy regulates NK cell-mediated antitumor immune responses remains elusive. Here, we demonstrate that hypoxia impairs breast cancer cell susceptibility to NK-mediated lysis in vitro via the activation of autophagy. This impairment was not related to a defect in target cell recognition by NK cells but to the degradation of NK-derived granzyme B in autophagosomes of hypoxic cells. Inhibition of autophagy by targeting beclin1 (BECN1) restored granzyme B levels in hypoxic cells in vitro and induced tumor regression in vivo by facilitating NK-mediated tumor cell killing. Together, our data highlight autophagy as a mechanism underlying the resistance of hypoxic tumor cells to NK-mediated lysis and provides a cutting-edge advance in our understanding of the underlying mechanism. This study might pave the way for the formulation of more effective NK cell-based antitumor therapies.

La drosophile se défend contre les infections microbiennes par un ensemble de réponses immunitaires très efficaces comme la synthèse de peptides antimicrobiens. L’expression de ces peptides antimicrobiens est contrôlée par deux voies indépendantes : la voie Toll et la voie IMD. La voie IMD est activée par PGRP-LC, une protéine de la famille PGRP (Peptidoglycan Recognition Protein). PGRP-LF est un régulateur négatif spécifique de la voie IMD. Il a été proposé que cette protéinepourrait agir spécifiquement au niveau du récepteur PGRP-LC, en séquestrant le ligand peptidoglycane (PGN) et en empêchant son accès à PGRP-LC. Mon travail de thèse a été de résoudre la structure des deux domaines PGRP de PGRP-LF, LFz et LFw, dans le but de caractériser le mécanisme de régulation par cette protéine.J’ai exprimé le domaine LFz dans des cellules S2 et le domaine LFw dans des bactéries. J’ai résolu la structure cristallographique de LFz à la résolution de 1.72Å et celle de LFw à la résolution de 1.94Å. Les structures de LFz et LFw montrent qu’elles ne possèdent pas la crevasse de liaison classique des PGRP, et ne peuvent pas interagir avec le PGN. J’ai confirmé ces résultats structuraux par des étudesbiochimiques de liaison des ces domaines à du PGN insoluble. L’aspect de régulation par PGRP-LF, par une séquestration du PGN, n’est donc valide. J’ai cloné et exprimé dans des cellules S2 les protéines PGRP-LCx et PGRP-LCa (partenaire du complexe activateur de la voie IMD) dans le but d’étudier leur interaction avec PGRP-LF. J’ai mis en évidence, par des analyses de résonnance plasmonique de surface, une interaction entre PGRP-LF et PGRP-LCx en absence et en présence duPGN. Ces données nous permettent de proposer un modèle dans lequel PGRP-LF assure la régulation négative de la voie IMD par compétition avec PGRP-LCa pour la liaison au récepteur PGRP-LCx. / The fruit fly defends itself against microbial infections by a set of highly effective immune responses that involve the synthesis of antimicrobial peptides. The expression of these antimicrobial peptides is controlled by two independent pathways: the Toll pathway and the IMD pathway. The IMD pathwayis activated by PGRP-LC, a protein of the PGRP family (Peptidoglycan Recognition Protein). PGRPLF is a specific negative regulator of the IMD pathway. It has been proposed that this protein specifically acts at the receptor PGRP-LC, by sequestering peptidoglycan (PGN) and preventing its access to PGRP-LC. My thesis work aims to solve the structure of the two PGRP domains of PGRPLF, LFz and LFw, in order to characterize the mechanism of regulation by this protein. I have expressed the LFz domain in S2 cells and the LFw domain in bacteria. I have solved the crystalstructure of LFz at 1.72 Å resolution and that of LFw at 1.94Å resolution. Structures of LFz and LFw show they do not possess the classical binding cleft found in others PGRP, and cannot interact with the PGN. I have confirmed these structural results with biochemical studies of binding of these domains with insoluble PGN. The model of regulation by PGRP-LF, by a sequestration of PGN, is no longer valid. I have cloned and expressed in S2 cells PGRP-LCx and PGRP-LCa proteins (partners of theactivating complex of the IMD pathway) in order to elucidate whether there is direct interaction between PGRP LF and one of two isoforms of PGRP-LC. I have demonstrated, through Surface Plasmon Resonance analysis, an interaction between PGRP-LF and PGRP-LCx. Actually, PGRP-LF regulates negatively the IMD pathway by competing with PGRP-LCa to bind to the PGRP-LCx receptor.

Biomphalaria glabrata est un mollusque d’eau douce, vivant en Amérique latine. Ce planorbe est principalement connu pour être l’hôte intermédiaire de Schistosoma mansoni, vers plat parasite responsable de la bilharziose intestinale, seconde endémie parasitaire humaine mondiale derrière le paludisme.Dans ce contexte, il apparaît clairement qu’une meilleure compréhension de l’interaction entre le parasite et le mollusque, hôte intermédiaire, représente une voie de recherche prometteuse. La compréhension des interactions immunologiques entre l’escargot et le parasite ainsi que des mécanismes moléculaires par lesquels les deux partenaires interagissent apparaît comme un pré-requis à la découverte de nouvelles cibles ou de nouvelles stratégies afin de développer desmoyens de lutte contre le pathogène.Le projet de cette thèse s’inscrit dans cette optique et vise à une meilleure compréhension des interactions immunologiques entre le mollusque Biomphalaria glabrata et le trématode Schistosoma mansoni. Différents aspects de l’interaction entre B.glabrata et S.mansoni ont été explorés, des bases moléculaires et cellulaires à l’interaction tripartite entre l’immunité du mollusque, son microbiote et le pathogène. Dans un premier temps nous avons pu démontrer ungradient d’infectivité des parasites et de susceptibilité des mollusques de différents provenances géographiques. De plus, l’interaction immunologique entre le mollusque et le parasite est supportée par une adaptation locale, à l’échelle moléculaire. Nous avons également pu montrer qu’une opsonine, la BgTEP, jouait un rôle clé dans l’interaction entre B.glabrata et ses différents pathogènes. Enfin, l’existence d’une véritable interaction tripartite entre la réponse immunitaire du mollusque, son microbiote et son parasite a pu être mise en évidence. / Biomphalaria glabrata is tropical fresh water snail, living in Latin America. This planorbe is the intermediary host of Schistosoma mansoni, a trematode responsible for the intestinal Schistosomiasis, second worldwide human vector-borne disease after the malaria. In this context, a better comprehension of the parasite/snail interaction is necessary and appearsa promising research field. The understanding of immunological interaction between the host and the parasite and the molecular mechanisms used by the two partners appears like essential for the discovery of new targets and new strategies in order to develop means of struggle against the pathogen. The aim of this thesis is to better understand the immunological interactions between the B. glabrata snail and S. mansoni trematode. Different aspects of the interaction between the snail and the parasite have been explored, from molecular and cellular bases to the tripartite interaction between the snail immunity, its microbiota and the pathogen. In a first step we have been able to demonstrate a gradient of parasite infectivities and snail susceptibilities from different geographical origins. Moreover, the immunological interaction between B. glabrata and S. mansoni is supported by local adaptation, at the molecular level. We were also able to show than an opsonin, the BgTEP, plays a key role in the interaction between B. glabrata and its various pathogens. Finally, the existence of a true tripartite interaction between the snail immune response, its microbiota and its parasite could was demonstrated.