Ein kompetitiver ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) für den Nachweis von Carbamazepin (CBZ) mit einer Bestimmungsgrenze von ca. 30 ng/L wurde entwickelt und validiert. Dieser in Gewässern häufig auftretende anthropogene Marker wurde anschließend in einer Vielzahl an Proben aus Abwässern, Oberflächengewässern und Trinkwässern nachgewiesen. Der ELISA zeigte eine exzellente Präzision und erbrachte in allen Matrizes geringfügig höhere Analysenergebnisse als die Referenzmethode HPLC-MS/MS. Die beständige Überbestimmung der CBZ-Konzentration in Höhe von ca. 7 % konnte auf die Präsenz von Cetirizin und geringen Mengen des persistenten Metaboliten 10,11 Epoxy¬carbamazepin (EP-CBZ) zurückgeführt werden. Die Bindungseigenschaften des verwendeten Antikörpers wurden anhand der Kreuz¬reaktivi¬täten von 37 Substanzen eingehend untersucht. Nach Kopplung von Flüssig¬chromato¬graphie und ELISA konnte das strukturell nicht mit CBZ verwandte Anti¬histaminikum Cetirizin als Kreuzreaktand identifiziert werden. Der störende Einfluss dieses Kreuz¬reaktanden auf den CBZ-ELISA konnte nach einer Änderung des pH-Wertes im Proben¬puffer minimiert werden. Die pH-abhängige Selektivitätssteuerung ermöglichte überdies die Entwicklung eines Dual-Analyt-Immunoassays für die parallele Bestimmung von CBZ und Cetirizin. Darüber hinaus wurden die Metaboliten EP-CBZ, DiOH-CBZ, 2-OH-CBZ, 3-OH-CBZ und 10 OH-CBZ in Abwasser, Oberflächenwasser und Trinkwasser quantifiziert. DiOH-CBZ erwies sich als ähnlich persistent wie CBZ und wurde in besonders hohen Konzentrationen gefunden. Außerdem wurden mehrere weitere bislang nicht identifizierte Abbauprodukte von CBZ gefunden. Da weder Probenvorbereitung noch Probenanreicherung erforderlich sind, ist der Test schnell und kostengünstig durchführbar. Die für den Test nötigen Probenvolumen sind mit weniger als 1 mL sehr gering. Diese Eigenschaften erlauben ein Hochdurchsatzscreening und machen die Methode interessant für den Einsatz im Gewässermonitoring. / A competitive ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) for the quantitation of carbamazepine (CBZ) was developed and validated. A limit of quantitation (LOQ) of ca. 30 ng/L allowed for the quantitation of CBZ in many samples from wastewater, surface water and drinking water. The method was found to be excellently precise, but it displayed slightly higher results than obtained by the reference method liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The nearly constant overestimation of 7 % could be attributed to the presence of small amounts of cetirizine and the persistent metabolite 10,11 epoxy¬carbamazepine (EP-CBZ). The binding properties of the antibody were studied by determining the cross-reactivities of 37 compounds. Hyphenating liquid chromatography to ELISA led to the discovery of the cross-reactive antihistamine cetirizine that shares no obvious structural similarity with CBZ. The bias caused by cetirizine was eliminated by changing the pH value of the sample buffer. Moreover, the antibody’s pH-dependent selectivity enabled a dual-analyte immunoassay for the parallel determination of CBZ and cetirizine. Furthermore, the metabolites EP-CBZ, DiOH-CBZ, 2-OH-CBZ, 3-OH-CBZ and 10-OH-CBZ were quantified in wastewater, surface water and drinking water. DiOH-CBZ showed the highest concentrations of all analaytes investigated and was found to be equally persistent as CBZ. In addition, several further degradation products of CBZ were found that could not be identified. The ELISA allowed the detection of diurnal and seasonal fluctuations of analyte concentrations in wastewater and surface water. The anthropogenic marker CBZ enabled to trace wastewater from the source to the receiving waters. Since neither sample pretreatment nor enrichment is necessary, the method is very fast and cost-effective. Only a small sample volume (less than 1 mL) is needed making this ELISA an appropriate high-throughput screening tool for environmental monitoring.

Koffein (1,3,7-Trimethylxanthin) und Coprostanol (5beta-cholestan-3beta-ol) wurden im Berliner Oberflächenwasser nachgewiesen. Ihre Konzentrationen korrelierten mit dem Verunreinigungsgrad der Proben, was nahelegt, dass sie sich als Marker für menschliche Aktivität eignen. Bemerkenswerterweise wurde Koffein in jeder einzelnen Oberflächenwasserprobe oberhalb der Bestimmungsgrenze von 0,025 µg/L gefunden. Um Oberflächenwasserproben in größeren Serien zu untersuchen, war die Entwicklung zweier neuer Methoden erforderlich: ein Immunoassay, basierend auf einem monoklonalen Antikörper für Koffein und eine dispersive flüssig-flüssig Mikroextraktionsmethode (DLLME), gefolgt von Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) für Coprostanol. Der entwickelte Koffein-Immunoassay zeigt die beste je erhaltene Nachweisgrenze für Koffein (0,001 µg/L), erlaubt Hochdurchsatz-Analysen und erfordert keine Probenvorbereitung. Der Assay wurde auch erfolgreich für die Messung von Koffein in Getränken, Haarwaschmitteln, Koffeintabletten und menschlichem Speichel angewendet. Antikörper gegen Coprostanol sind nicht kommerziell erhältlich. Eine neue Strategie Anti-Coprostanol-Antikörper zu generieren wurde erarbeitet, die eine analoge Verbindung – Isolithocholsäure (ILA) – als Hapten verwendet, mit der eine Gruppe von Mäusen immunisiert wurde. Ein polyklonales Anti-ILA-Serum wurde produziert, welches Coprostanol bindet, aber die niedrige Affinität erlaubte nicht den Aufbau eines Immunoassays, der die Messung von Umweltkonzentrationen des Anayten (im Bereich ng/L) zulässt. Spezifische Anti-ILA-Immunglobuline G wurden auch in den Faeces der Mäuse gefunden. Coprostanol wurde in den Wasserproben durch die Verwendung einer neuentwickelten LC-MS/MS-Methode unter APCI-Ionisation (atmospheric pressure chemical ionisation) gemessen. Konzentrationen oberhalb von 0,1 µg/L wurden nach Voranreicherung der Probe mittels DLLME bestimmt. / Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) and coprostanol (5beta-cholestan-3beta-ol) were detected in samples of Berlin’s surface water. Their concentrations correlated with the contamination status of the samples, suggesting their usefulness as markers of human activity. Remarkably, caffeine concentrations were always well above the limit of quantitation of 0.025 µg/L. In order to screen surface water samples in larger series, the development of two novel methods was required: a monoclonal antibody-based immunoassay for caffeine and a dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) method, followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for coprostanol. The caffeine immunoassay developed shows the best analytical limit of detection (LOD) obtained so far for caffeine (0.001 µg/L), allows high-throughput analysis, and does not require sample pre-treatment. The assay was also successfully employed to measure caffeine in beverages, shampoos, caffeine tab-lets, and human saliva. Antibodies to coprostanol are not commercially available. A new strategy to generate anti-coprostanol antibodies was elaborated using an analogous com-pound as hapten – isolithocholic acid (ILA) – and immunizing a group of mice. A polyclonal anti-ILA serum was produced, which binds coprostanol but the low affinity did not permit setting up an immunoassay to measure environmental concentrations of the analyte (in the range of ng/L). Specific anti-ILA immunoglobulin G were also found in the faeces of the immunized mice. Coprostanol was quantified in the water samples using a newly developed LC-MS/MS method using atmospheric pressure chemical ionisation (APCI). Concentrations above 0.1 µg/L were determined after sample preconcentration using DLLME. This extraction method also proved to be successful for enrichment of coprostanol-related compounds such as cholesterol, cholestanol, cholestanone, ergosterol, and stigmasterol.

Las hormonas recombinantes eritropoyetina (EPO) y hormona de crecimiento (GH), prácticamente iguales a las endógenas y de corta vida media en circulación, son de difícil detección directa en el control antidopaje. Se determinaron los valores poblacionales de los biomarcadores indirectos EPO, receptor soluble de la transferrina, insulin-like growth factor-I (IGF-I) y procolágeno tipo III péptido (P-III-P), en poblaciones seleccionadas de deportistas, y el efecto del ejercicio y los distintos tipos de entrenamiento sobre su concentración sérica. La comparación de resultados obtenidos mediante distintos ensayos demostró la necesidad de una validación exhaustiva previa a su utilización. A excepción del P-III-P, los biomarcadores séricos propuestos para la detección de rhEPO y rhGH no se encuentran directamente afectados por el nivel atlético, el ejercicio o la distinta carga de entrenamiento realizada a lo largo de la temporada deportiva. La edad es la principal influencia sobre las concentraciones séricas de IGF-I y P-III-P. / Direct detection of recombinant peptidic hormones erythropoietin (EPO) and growth hormone (GH), very similar to endogen molecules and with a short half life in blood, is difficult in antidoping control. The main objective of this work is to determine indirect biomarkers' values of EPO, soluble transferrin receptor, insulin-like growth factor-I (IGF-I) and procollagen type III peptide (P-III-P), in selected populations of athletes, and the effect of exercise and different types of training on their concentration in serum. The comparison of results obtained by the different assays showed the need of extensive validation of the analytical techniques before their use in the antidoping field. Excepting P-III-P, proposed biomarkers for the detection of rhEPO and rhGH abuse are not directly influenced by the athletic level, exercise or different training workload along the sport season. Age is the main factor affecting IGF-I and P-III-P concentrations in serum.

Thesis (M.S.)--Uniformed Services University of the Health Sciences, 2005. / Typescript (photocopy).

Along with proteins, a myriad of different molecular biomarkers, such as post-translational modifications and autoantibodies, could be used in an attempt to improve disease detection and progression. In this thesis, I build on several iterations of the proximity ligation assay to develop and apply new adaptable methods to facilitate detection of proteins, autoantibodies and post-translational modifications. In paper I, we present an adaptation of the solid-phase proximity ligation assay (SP-PLA) for the detection of post-translational modification of proteins (PTMs). The assay was adapted for the detection of two of the most commons PTMs present in proteins, glycosylation and phosphorylation, offering the encouraging prospect of using detection of PTMs in a diagnostic or prognostic capacity.  In paper II, we developed a variant of the proximity ligation assay using micro titer plate for detection and quantification of protein using optical density as readout in the fluorometer, termed PLARCA. With a detection limit considerably lower than ELISA, PLARCA detected femtomolar levels of these proteins in patient samples. In paper III, we aim to compare detection values of samples collected from earlobe capillary, venous plasma, as well as capillary plasma stored in dried plasma spots (DPS) assessed with a 92-plex inflammation panel using multiplex proximity extension assay (PEA). Despite the high variability in protein measurements between the three sample sources, we were able to conclude that earlobe capillary sampling is a suitable less invasive alternative, to venipuncture. In paper IV, we describe the application of PLARCA and proximity extension assay (PEA) for the detection of GAD65 autoantibodies (GADA). Thus, offering highly sensitive and specific autoimmunity detection.

Aujourd'hui, avec l'augmentation de la population, la consommation de médicaments et de produits phytosanitaires dans l'agriculture a considérablement augmenté. Cela devient inquiétant car une grande partie de ces molécules, rejetée dans l'environnement, ne sont pas bien éliminées par les stations d'épuration (lorsqu'elles existent). En trop grande quantité, ces produits deviennent des poisons pour tous les organismes vivants, y compris l’Homme.Des méthodes analytiques classiques pour la mesure de ces produits chimiques existent déjà (méthodes séparatives classiques telles que la chromatographie en phase gazeuse, la chromatographie liquide à haute performance, éventuellement couplée à la spectrométrie de masse, etc.). Cependant, même si elles sont extrêmement précises et fiables, ces techniques sont difficiles à appliquer pour la surveillance sur site et sont généralement coûteuses. Pour cette raison, ma thèse se concentre sur de nouvelles approches analytiques pour détecter de petites molécules en milieu aqueux, telles que ces polluants. Dans une première partie de mon travail, j’ai développé un immunocapteur basé sur une complexation compétitive originale et sur une transduction électrochimique (ampérométrique), pour la détection du diclofénac, un anti - inflammatoire non stéroïdien généralement utilisé pour réduire l’inflammation et soulager la douleur. L'électrode de travail a été fonctionnalisée par deux sels de diazonium, l'un utilisé comme sonde moléculaire (un dérivé du diclofénac couplé à une arylamine) et l'autre comme sonde redox (une quinone) également couplée à une arylamine, capable de transduire l'association haptène-anticorps par une variation de son électroactivité ; en particulier, la transduction a été conçue pour délivrer une augmentation de courant lors de la détection du diclofénac (soit une détection « signal-on »). J’ai montré une limite de détection d’environ 20 fM dans l'eau du robinet, ce qui rend ce type de capteur très compétitif. Dans la suite de mon travail, j'ai conservé la même approche de transduction originale (immunoreconnaissance compétitive) mais appliquée à un transistor à effet de champ organique à grille électrolytique (EGOFET) dont le semiconducteur est le poly (N-alkyldiketopyrrolo-pyrrole dithiénylthiéno [3,2-b ] thiophène) (DPP-DTT) et dont l'électrode de grille a été fonctionnalisée par électrogreffage d'un sel de diazonium fonctionnel capable de lier un anticorps spécifique de l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D), un herbicide courant. Le design de la sonde moléculaire a été rationalisée par modélisation moléculaire afin d’optimiser la capture de l’anticorps en surface de grille. Dans la dernière partie de mon travail, je propose une approche qui met à profit à la fois le couplage capacitif de l'EGOFET mais aussi sa sensibilité aux charges électrostatiques accumulées en surface de grille. J'ai immobilisé en surface de grille un peptide court (Gly-Gly-His) connu pur avoir une forte affinité envers les ions cuivre Cu2+. Le peptide a été immobilisé par électro-oxydation directe de l'amine primaire du premier fragment glycine. J’ai démontré que les dispositifs EGOFET, modifiés par GGH, peuvent transduire la complexation de Cu2+ par des variations significatives de leurs caractéristiques de sortie et de transfert, en particulier par un décalage de la tension de seuil (VTh). / Today, with the increase of population, the consumption of drugs and of chemicals in agriculture has dramatically increased. It becomes a worrisome issue because a large amount of these molecules, excreted to the environment, are not well eliminated by water-treatment plants (when they exist) and are therefore released without control into the ecosystem. In too large quantities, these drugs are poisons for living organisms, including humans. Classical analytical methods for the measurement of these chemicals already exist (classical separative methods such as gas chromatography, high-performance liquid chromatography, possibly coupled with mass spectrometry, etc). However, even if extremely precise and reliable, these techniques are difficult to apply for on-site monitoring and are usually costly. For this reason, my thesis focuses on novel analytical approaches to detect small organic molecules such as these pollutants. In a first part of my work, I developped an original immunosensor based on a competitive complexation and on an electrochemical (amperometric) transduction, for detection of diclofenac, which is a non – steroidal anti – inflammatory drug generally employed to protect patients from inflammation and relieve pain. The working electrode was electrografted with two functional diazonium salts, one as molecular probe (a diclofenac derivative coupled with an arylamine) and the other as redox probe (a quinone) also coupled with an arylamine, able to transduce the hapten-antibody association into a change in electroactivity. The transduction was designed to deliver a current increase upon detection of diclofenac (“signal-on” detection). The detection limit is ca. 20 fM in tap water, which is competitive compared to other label-free immunosensors. In the following part of my thesis, I kept the same original transduction approach (competitive immunoassay) but applied to an Electrolyte-Gated Organic Field-Effect Transistor (EGOFET) based on poly(N-alkyldiketopyrrolo-pyrrole dithienylthieno[3,2-b]thiophene) as organic semiconductor whose gate electrode was functionalized by electrografting a functional diazonium salt capable to bind an antibody specific to 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), an herbicide well-known to be a soil and water pollutant. Molecular docking computations were performed to design the functional diazonium salt to rationalize the antibody capture on the gate surface. In the last part of my work, I propose an approach which takes profit not only of the capacitive coupling of the EGOFET but also on its sensitivity to electrostatic charges accumulated on the gate surface. To illustrate this in the field of sensors, I used a short peptide (Gly-Gly-His), known to selectively bind copper ions Cu2+. The peptide was immobilized by direct electrooxidation of the primary amine of the first glycine moiety. I demonstrated that GGH-modified EGOFETs can transduce Cu2+ complexation through significant changes of their output and transfer characteristics, in particular their threshold voltage (VTh).

Affinity-based proteomics utilizes affinity binders to detect target proteins in a large-scale manner. This thesis describes a high-throughput method, which enables the search for biomarker candidates in human plasma and serum. A highly multiplexed antibody-based suspension bead array is created by coupling antibodies generated in the Human Protein Atlas project to color-coded beads. The beads are combined for parallel analysis of up to 384 analytes in patient and control samples. This provides data to compare protein levels from the different groups. In paper I osteoporosis patients are compared to healthy individuals to find disease-linked proteins. An untargeted discovery screening was conducted using 4608 antibodies in 16 cases and 6 controls. This revealed 72 unique proteins, which appeared differentially abundant. A validation screening of 91 cases and 89 controls confirmed that the protein autocrine motility factor receptor (AMFR) is decreased in the osteoporosis patients. Paper II investigates the risk proteome of inflammatory bowel disease (IBD). Antibodies targeting 209 proteins corresponding to 163 IBD genetic risk loci were selected. To find proteins related to IBD or its subgroups, sera from 49 patients with Crohn’s disease, 51 with ulcerative colitis and 50 matched controls were analyzed. From these targeted assays, the known inflammation-related marker serum amyloid protein A (SAA) was shown to be elevated in the IBD cases. In addition, the protein laccase (multi-copper oxidoreductase) domain containing 1 (LACC1) was found to be decreased in the IBD subjects. In conclusion, assays using affinity-based bead arrays were developed and applied to screen human plasma and serum samples in two disease contexts. Untargeted and targeted screening strategies were applied to discover disease-associated proteins. Upon further validation, these potential biomarker candidates could be valuable in future disease studies. / <p>QC 20180412</p>

Der Sprengstoff PETN ist äußerst schwer zu detektieren. Ein verbesserter anti-PETN-Antikörper wurde durch Anwendung des Bioisosterie-Konzepts entwickelt. Diese polyklonalen IgGs sind sehr selektiv und sensitiv. Die Nachweisgrenze des ELISAs beträgt 0,15 µg/L. Der Messbereich des Immunoassays liegt zwischen 1 und 1000 µg/L. Die Antikörper sind recht pH-stabil als auch robust gegen Lösungsmittelzusätze. Für die Umweltanalytik von TNT wurde eine HPLC-kompatible Affinitätssäule mit porösem Glas als Trägermaterial hergestellt. Um die anti-TNT-Antikörper selektiv aus den TNT-Seren zu isolieren, wurde eine Trennung an einer Dinitrophenyl-Affinitätssäule durchgeführt. Zur Optimierung der Kopplungsmethode wurden orangefarbene Dabsyl-Proteine synthetisiert und auf der Oberfläche gebunden. Die Färbung wurde als Indikator für die Ligandendichte verwendet. Wegen der hohen Affinitätskonstanten der anti-TNT-IgGs lässt sich TNT nicht reversibel von der TNT-Affinitätssäule eluieren. Daher wurde eine neuartige Elutionsmethode entwickelt, die thermische Online-Elution. Die maximale Kapazität einer TNT- Affinitätssäule betrug 650 ng TNT bzw. 10 µg/mL Säulenvolumen. Um die Ligandendichte der TNT-Affinitätssäulen zu bestimmen, wurde ein neues Verfahren entwickelt, da die spektroskopischen Proteinbestimmungsmethoden nicht geeignet waren. Zur Proteinbestimmung wurde eine HPLC-Trennung der Aminosäuren Tyr und Phe ohne vorherige Derivatisierung entwickelt. Die Proteinhydrolysezeit wurde durch Einsatz einer Mikrowelle von 22 h auf 30 min verkürzt. Zur internen Kalibrierung wurden HTyr und FPhe verwendet. Die Nachweisgrenze bei 215 nm ist sowohl für Tyr als auch für Phe 0,05 µM (~ 10 µg/L). Dieses neue Verfahren, das als Aromatische Aminosäureanalyse (AAAA) bezeichnet werden kann, wurde zur Proteinbestimmung von homogenen Proben mit NIST-BSA validiert, wobei die Nachweisgrenze für Proteine 16 mg/L (~ 300 ng BSA) ist. Die relative Standardabweichung incl. der Hydrolysestufe beträgt 5%. / The explosive Pentaerythritol tetranitrate (PETN) is extremely difficult to detect. An improved antibody against PETN was developed by using the bioisosteric concept. These polyclonal antibodies are highly selective and sensitive. The limit of detection (LOD) of the ELISA was determined to be 0.15 µg/L. The dynamic range of the assay was found to be between 1 and 1000 µg/L. The antibodies are sufficiently pH-stable and resistant to solvent additives. An HPLC-compatible TNT-affinity column with porous glass as support material was prepared for the environmental analysis. In order to isolate the anti-TNT antibodies of the TNT sera a separation was carried out on a dinitrophenyl-affinity column. To optimize the immobilization method, orange-coloured dabsyl proteins were synthesized and bound to the surface. The colour intensity was found to be an indicator for the immobilization rate. In consequence of the high affinity constants of the anti-TNT antibodies, TNT can''t elute by a typical acidic elution step. Therefore, a novel separation approach, the thermal online-elution was developed. The maximum capacity of an affinity column was 650 ng TNT or 10 µg/mL of column volume. To quantify the immobilization rate of proteins, a new method has been developed, because the usual protein determination methods were unsuitable. Therefore an HPLC separation method of Tyr and Phe was developed without prior derivatization. Two internal standard compounds, HTyr and FPhe, were used for calibration. The LOD was estimated to be 0.05 µM (~ 10 µg/L) for Tyr and Phe at 215 nm. The protein hydrolysis time was reduced from 22 h to 30 min using microwave technique. This procedure, that was termed aromatic amino acid analysis (AAAA), has been validated for protein determination of homogeneous samples with NIST-BSA. The LOD for proteins was calculated to be below 16 mg/L (~ 300 ng BSA absolute). The relative standard deviation, including the hydrolysis step, is 5%.