O transplante de células-tronco hematopoéticas (CTHs) é o tipo de terapia celular mais usada atualmente. As células-tronco da medula óssea humana, do sangue periférico mobilizado e do sangue do cordão umbilical (SCU) são as únicas fontes de células utilizadas clinicamente para a recuperação hematopoética, mas elas têm uma disponibilidade limitada e apenas um terço dos pacientes apresentam um doador compatível. Uma fonte alternativa para suprir esta demanda seriam as células hematopoéticas derivadas a partir de células-tronco pluripotentes. Célulastronco embrionárias (CTE) são um tipo de células pulripotentes caracterizadas por sua capacidade ilimitada de autorrenovação e diferenciação em todas as células especializadas do indivíduo adulto. A alta capacidade de diferenciação dessas células em linhagens específicas por métodos de indução in vitro faz delas grandes promessas para o desenvolvimento de novas tecnologias aplicáveis à medicina regenerativa e terapia celular. Entretanto, ainda é necessário determinar se células-tronco hematopoéticas (CTH) geradas a partir de células pluripotentes são funcionais in vivo. Assim, o objetivo desse estudo consistiu no desenvolvimento de um modelo animal para o transplante de células hematopoéticas humanas provenientes de células pluripotentes e utilizamos CTH de sangue de cordão umbilical como controle. Para tanto, realizamos a padronização da dose de irradiação subletal nos camundongos NOD / SCID IL2R ? null (NSG) e utilizamos duas concentrações de células, 1x106 e 0,75x106 de células hematopoéticas diferenciadas a partir de CTE e células do cordão umbilical. Os animais que receberam as células do SCU apresentaram uma taxa mais elevada de enxertia em comparação aos que receberam ás células diferenciadas a partir de CTE humanas. Foi confirmado que após quinze dias do transplante, a hematopoese é restabelecida e que células CD45+ humanas estavam presentes, porém em baixas quantidades. Sobretudo, os resultados aqui apresentados enfatizaram o descrito na literatura, porém não ultrapassando a 1,5% de enxertia na medula óssea. Estes dados indicaram que os camundongos NSG proporcionaram um microambiente hematopoético favorável para as CTE humanas porém, essas células precisam ser investigadas no que tange aos fatores que aumentem de sua duração in vivo, otimizando a enxertia. / Hematopoietic stem cell transplantation (HSC) is the most widely used type of cell therapy nowadays. Human bone marrow, mobilized peripheral blood, and stem cells in the umbilical cord (UC) are the only sources of cells used clinically for hematopoietic recovery, but they have limited availability and only a third of patients have a matching donor. An alternative source to supply this demand would be hematopoietic cells derived from pluripotent stem cells. Embryonic stem cells (ESC) are a type of pulp-like cells characterized by their unlimited capacity for self-renewal and differentiation in all specialized cells of the adult individual. The high differentiation capacity of these cells in specific strains by in vitro induction methods makes great promises for the development of new technologies applicable to regenerative medicine and cell therapy. However, it remains to be determined whether hematopoietic stem cells (HTC) generated from pluripotent cells are functional in vivo. Thus, the objective of this study was to develop an animal model for the transplantation of human hematopoietic cells from pluripotent cells and to use HTC in the umbilical cord blood as a control. To do so, we performed standardization of the sublethal irradiation dose on the NOD / SCID IL2R ? null (NSG) mice and used two concentrations of cells, 1x106 and 0.75x106 hematopoietic cells differentiated from ESC and umbilical cord cells. The animals that received UC cells had a higher rate of grafting compared to those that received the differentiated cells from the human ESC. It was confirmed that after fifteen days of transplantation, hematopoiesis restored and that human CD45+ cells were present, but in low amounts. Above all, the results presented here emphasize the described in the literature, but not exceeding 1.5% of grafting in bone marrow. These data indicated that the NSG mice provided a hematopoietic microenvironment favorable to the human ESC, however, these cells need to be investigated with regard to factors that increase their duration in vivo, optimizing grafting.

Die Entwicklung innovativer Therapiekonzepte für die Knochenregeneration erfordert validierte segmentale Knochendefekt-Tiermodelle. Dabei ist das Mausmodell für die präklinische Testung von zentraler Bedeutung, jedoch fehlen in der wissenschaftlichen Literatur bislang Angaben zu validierten, extern stabilisierenden kritischen segmentalen Knochendefektmodellen an der immundefizienten Maus. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und in vivo Evaluierung eines zuverlässigen und einfach zu handhabenden Modells für extern stabilisierte kritische Knochendefekte an der immundefizienten Maus. Dreißig männliche nu/nu-Mäuse (40,7±2,8 g, 95±2,6 d) wurden mittels Isofluraninhalation narkotisiert und anschließend ein externer Fixateur (MouseExFix, RISystem, AO Research Institute Davos, Schweiz) am rechten Femur angebracht. Femorale Knochendefekte der Länge 1 mm (n=10), 2 mm (n=10) und 3 mm (n=10) wurden erzeugt. Der Wundverschluss erfolgte mit Einzelknopfnähten. Röntgenaufnahmen wurden unmittelbar postoperativ und im Folgenden alle zwei Wochen innerhalb des Beobachtungszeitraums von zwölf Wochen angefertigt und im Hinblick auf Knochenregeneration und –fusion ausgewertet. Weiterhin wurden histomorphologische, histomorphometrische, immunhistochemische und µCT-Analysen zur dreidimensionalen und zellulären Beurteilung der Knochenheilung angefertigt. Alle Tiere überlebten die Operation. Sechs Tiere starben innerhalb des Beobachtungszeitraums als Folge von starkem Blutverlust (n=1), Infektion (n=1), Pinlockerung, welche die Euthanasie erforderlich machte (n=2) und durch Komplikationen bei der Anästhesie (n=2). Die µCT-Analyse nach zwölf Wochen zeigte, dass 3/8 der 1 mm-Defekte, 5/8 der 2 mm-Defekte und 8/8 der 3 mm-Defekte eine Pseudarthrose aufwiesen. Das mittlere Defektvolumen stieg signifikant (p<0,001) mit der Größe des Defektes und betrug 0,36±0,42 mm³ (1 mm-Gruppe), 1,4±0,88 mm³ (2 mm-Gruppe), bzw. 2,88±0,28 mm³ (3 mm-Gruppe). Die mittlere Defektgröße verringerte sich entsprechend um 77,6% (1 mm-Gruppe), 56,8% (2 mm-Gruppe), bzw. 28,6% (3 mm-Gruppe). Die histomorphologischen, histomorphometrischen und immunhistochemischen Analysen zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den drei experimentellen Gruppen. Das verwendete MouseExFix-System ist ein zuverlässiges und einfach zu handhabendes Verfahren zur Stabilisierung eines kritischen segmentalen Knochendefekts an der immundefizienten Maus, wenn ein 3 mm-Defekt erzeugt wird. Das im Rahmen der Studie entwickelte und validierte murine extern stabilisierte, segmentale kritische Knochendefektmodell ermöglicht die präklinische Evaluierung von Konzepten zur lokalen Knochenregeneration inklusive der Verwendung allo- und xenogener Zellen. / The development of innovative therapies for bone regeneration requires the use of advanced site-specific bone defect small animal models. In this context, murine models are of major importance as they allow for sufficient sample sizes prior to preclinical testing using larger animals. Owing to the small dimensions of the murine femur only a few custom fabricated fixation devices have been described in the literature so far. The aim of this investigation was to develop and validate a new, externally fixated critical size bone defect model for immunodeficient mice. Thirty male nu/nu mice (40.7 ± 2.8 g, 95 ± 2.6 days old) were anesthetized by isoflurane inhalation and an external fixation device (MouseExFix, RISystem, AO Research Institute Davos, Switzerland) was attached to the right femur. Femoral bone defects of 1 mm (n=10), 2 mm (n=10) and 3 mm (n=10) were created. Wounds were closed without any additional treatment. X-ray films obtained immediately after surgery and every 2 weeks postoperatively during the 12 week postoperative observation period were evaluated for bony regeneration and fusion. Furthermore, histomorphology, histomorphometry, immunohistochemistry and µCT analysis were performed. All of the animals survived the operation. Twenty four out of 30 animals reached the twelfth postoperative week. µCT analyses after twelve weeks showed that 3/8 of the 1 mm defects, 5/8 of the 2 mm defects and 8/8 of the 3 mm defects remained as nonunions. The defect volume was 0.36 ± 0.42 mm³ (1 mm group), 1.40 ± 0.88 mm³ (2 mm group), and 2.88 ± 0.28 mm³ (3 mm group) (p<0.001, between all groups). The defect size decreased by 77.6% (1-mm group), 56.8% (2-mm group) and 28.6% (3-mm group) (p=0.152, between all groups). Our method using the MouseExFix device has proven to be a reliable and easy-to-handle external fixation system for the stabilization of critical-size segmental bone defects in immundeficient mice when 3 mm defects are generated. This mouse model allows for high-throughput translational evaluation of concepts for site-specific bone regeneration including strategies using allogenic and xenogenic cell types.

Aujourd'hui, l'un des modèles de souris humanisées le plus robuste est obtenu en injectant des cellules souches hématopoïétiques humaines (HSC) issues de foie fœtal humain et en implantant du thymus fœtal autologue. Ce modèle, appelé BLT (Bone marrow/Liver/Thymus), s'est révélé capable de supporter une reconstitution, une maturation et une sélection optimales des cellules T. Les souris BLT sont utilisées pour de nombreuses études telles que la compréhension de la biologie du VIH ou plus récemment en médecine régénérative. Grâce à ce modèle, nous avons pu d’une part étudier le rôle des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) lors de l’infection par le VIH mais aussi mieux comprendre la formation in vivo de tératomes lors de l’utilisation d’iPSC. Cependant, l'une des principales limites de cette technique réside dans l'obtention du tissu fœtal. Ici, nous avons décrit un nouveau protocole de souris humanisées greffées avec du thymus humain en utilisant des matériaux plus accessibles: du thymus humain retiré lors d’une chirurgie cardiaque chez des nouveaux-nés ou des enfants, et des HSC de sang de cordon. Des morceaux de ces thymus ont été implantés dans les quadriceps de souris immunodéficientes, après avoir été mis en culture. Ces souris CCST (Cord blood and Cardiac Surgery Thymus) ont permis une prise de greffe importante et un meilleur développement des lymphocytes T humains que les souris humanisées sans thymus. Les lymphocytes T des souris CCST et BLT ont montré une fonction similaire, évaluée par des tests de prolifération ex vivo et par rejet de lignées de cellules leucémiques allogéniques in vivo. Nous avons testé l’intérêt de cette nouvelle stratégie dans le modèle de l’infection au VIH-1, qui représente le modèle type de l’utilité des BLT. Nous avons montré que les souris CCST sont sensibles à l'infection par le VIH-1 par voie muqueuse ou intrapéritonéale, comme l'indique la détection de l'ADN du VIH et des cellules p24 +, similairement aux souris BLT. Les souris CCST ont présenté des réponses de lymphocytes T spécifiques du VIH-1 ex vivo plus efficaces que les BLT. Lors du traitement antirétroviral, les souris CCST, comme les BLT, ont vu leur charge virale diminuer. Ces résultats démontrent que les souris CCST représentent une alternative au modèle de souris BLT classique. Ces thymus, éthiquement plus facile à obtenir, peuvent être utilisés pour générer un grand nombre de souris par rapport aux thymus fœtaux. / Immunodeficient mice engrafted with human immune system provide an exciting in vivo model for a better understanding of its functioning and for development of new therapies. Today, one of the most robust humanized mouse model is achieved by injecting human hematopoietic stem cells (HSC) from fetal liver along with an implantation of autologous fetal thymic tissue. This model, called BLT, was shown to be able to support an optimal T cell reconstitution, maturation and selection. BLT mice are extensively used for many studies such as understanding HIV biology or in regenerative medicine. Indeed, our work used BLT mice on one hand to study the role of plasmacytoid dendritic cells (pDC) during the HIV infection and on the other hand to better understand the formation of teratomes from iPSCs in vivo. However, one of the biggest limitations of this technique is the procurement of the fetal tissue. Here we describe a new protocol to do humanized mice engrafted with human thymus pieces by using more accessible materials: human thymus obtained during cardiac surgery and cord blood HSC. Indeed, thymus is spontaneously removed during cardiac surgery in neonates and young children, thus it is an easy and ethical way to obtain this tissue. Those thymuses pieces were implanted in the quadriceps of a immunodeficient mice, after being put in culture. CCST mice (Cord blood and Cardiac Surgery Thymus) exhibited a significant engraftment of T-cells, compared to humanized mice without thymus. T-cells from both CCST and BLT mice showed a similar function as evaluated by proliferation assays upon PHA stimulation ex vivo and rejection of allogeneic leukemic cells lines in vivo. CCST mice were susceptible to HIV-1 infection via mucosal or intraperitoneal route, as shown by detectable viral load, HIV DNA and p24+ cells, at similar levels to those of BLT mice. Importantly, CCST mice displayed more effective ex vivo HIV-1-specific T-cell responses compared to BLT. Upon antiretroviral treatment, CCST mice, like BLT, were able to diminish the viral load. Our data suggest that CCST mice represent an alternative to the regular BLT mouse model. Those easy-to-access thymuses can be used to generate a large number of mice compared to fetal thymuses.

Die Entwicklung innovativer Therapiekonzepte für die Knochenregeneration erfordert validierte segmentale Knochendefekt-Tiermodelle. Dabei ist das Mausmodell für die präklinische Testung von zentraler Bedeutung, jedoch fehlen in der wissenschaftlichen Literatur bislang Angaben zu validierten, extern stabilisierenden kritischen segmentalen Knochendefektmodellen an der immundefizienten Maus. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und in vivo Evaluierung eines zuverlässigen und einfach zu handhabenden Modells für extern stabilisierte kritische Knochendefekte an der immundefizienten Maus. Dreißig männliche nu/nu-Mäuse (40,7±2,8 g, 95±2,6 d) wurden mittels Isofluraninhalation narkotisiert und anschließend ein externer Fixateur (MouseExFix, RISystem, AO Research Institute Davos, Schweiz) am rechten Femur angebracht. Femorale Knochendefekte der Länge 1 mm (n=10), 2 mm (n=10) und 3 mm (n=10) wurden erzeugt. Der Wundverschluss erfolgte mit Einzelknopfnähten. Röntgenaufnahmen wurden unmittelbar postoperativ und im Folgenden alle zwei Wochen innerhalb des Beobachtungszeitraums von zwölf Wochen angefertigt und im Hinblick auf Knochenregeneration und –fusion ausgewertet. Weiterhin wurden histomorphologische, histomorphometrische, immunhistochemische und µCT-Analysen zur dreidimensionalen und zellulären Beurteilung der Knochenheilung angefertigt. Alle Tiere überlebten die Operation. Sechs Tiere starben innerhalb des Beobachtungszeitraums als Folge von starkem Blutverlust (n=1), Infektion (n=1), Pinlockerung, welche die Euthanasie erforderlich machte (n=2) und durch Komplikationen bei der Anästhesie (n=2). Die µCT-Analyse nach zwölf Wochen zeigte, dass 3/8 der 1 mm-Defekte, 5/8 der 2 mm-Defekte und 8/8 der 3 mm-Defekte eine Pseudarthrose aufwiesen. Das mittlere Defektvolumen stieg signifikant (p<0,001) mit der Größe des Defektes und betrug 0,36±0,42 mm³ (1 mm-Gruppe), 1,4±0,88 mm³ (2 mm-Gruppe), bzw. 2,88±0,28 mm³ (3 mm-Gruppe). Die mittlere Defektgröße verringerte sich entsprechend um 77,6% (1 mm-Gruppe), 56,8% (2 mm-Gruppe), bzw. 28,6% (3 mm-Gruppe). Die histomorphologischen, histomorphometrischen und immunhistochemischen Analysen zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den drei experimentellen Gruppen. Das verwendete MouseExFix-System ist ein zuverlässiges und einfach zu handhabendes Verfahren zur Stabilisierung eines kritischen segmentalen Knochendefekts an der immundefizienten Maus, wenn ein 3 mm-Defekt erzeugt wird. Das im Rahmen der Studie entwickelte und validierte murine extern stabilisierte, segmentale kritische Knochendefektmodell ermöglicht die präklinische Evaluierung von Konzepten zur lokalen Knochenregeneration inklusive der Verwendung allo- und xenogener Zellen.:1 Einleitung 1 1.1 Hintergrund 1 1.2 Das Mausmodell 2 1.3 Übersicht Tierversuche mit Knochendefekten 5 1.4 Frakturheilung 6 1.4.1 Allgemeines 6 1.4.2 Räumliche Gliederung 7 1.4.3 Expression von Proteinen der extrazellulären Matrix 8 1.4.4 Das Vier-Phasen-Modell der Frakturheilung 9 1.4.5 Das anabolisch/ katabolische Modell der Frakturheilung 12 1.4.6 Beeinflussung der Frakturheilung 12 1.4.7 Das Diamantkonzept 14 1.5 Osteosynthesesysteme 14 1.6 Pseudarthrosen 15 1.6.1 Definition 15 1.6.2 Ätiologie 16 1.6.3 Klassifikation 16 1.6.4 Therapie 17 2 Material und Methoden 19 2.1 Versuchstiere 19 2.2 Operationsvorbereitung 19 2.3 Operationsablauf 20 2.4 Postoperatives Vorgehen 27 2.5 Verlaufskontrolle 28 2.6 Entnahme der Präparate 29 2.7 Anfertigung der µCT-Aufnahmen 30 2.8 Anfertigung der histologischen Schnitte 30 2.8.1 Bearbeitung der Femora 30 2.8.2 verwendete Färbungen 31 2.9 Beurteilung der Schnitte 32 2.9.1 Histologische Beurteilung 32 2.9.2 Histomorphometrische Beurteilung 33 2.10 Statistik 33 3 Ergebnisse 34 3.1 Überlebensraten und Gewichtsverlauf 34 3.2 Röntgenauswertung 35 3.3 CT-Auswertung 38 3.4 Histologische Auswertung 41 3.5 Histomorphometrische Auswertung 44 3.5.1 TRAP 44 3.5.2 Osteocalcin 46 3.5.3 Osteopontin 47 3.5.4 Osteonectin 48 4 Diskussion 50 4.1 Diskussion etablierter Modelle für kritische Knochendefekte 50 4.1.1 Diskussion der Konzeption der Modelle 50 4.1.2 Diskussion der durchgeführten Anästhesieverfahren 54 4.1.3 Diskussion der Ergebnisse 55 4.1.4 Diskussion der Defektlängen 56 4.1.5 Diskussion der verschiedenen Osteosynthesesysteme 57 4.1.6 Diskussion der Ausfaller 59 4.2 Anwendung und Nutzen immundefizienter Tiermodelle 60 4.3 Vergleich des tibialen und des femoralen murinen Frakturmodells 63 4.4 Diskussion der Beurteilung der Knochenheilung mittels bildgebender und histologischer Verfahren 63 4.5 Anwendungsmöglichkeiten 65 4.6 Schlussfolgerungen 66 5 Zusammenfassung 67 5.1 In deutscher Sprache 67 5.2 In englischer Sprache 68 6 Literaturverzeichnis 70 7 Anhang 92 7.1 Danksagung 92 7.2 Lebenslauf 93 7.3 Veröffentlichungen 95 7.4 Wertetabellen 96 7.5 Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 109 / The development of innovative therapies for bone regeneration requires the use of advanced site-specific bone defect small animal models. In this context, murine models are of major importance as they allow for sufficient sample sizes prior to preclinical testing using larger animals. Owing to the small dimensions of the murine femur only a few custom fabricated fixation devices have been described in the literature so far. The aim of this investigation was to develop and validate a new, externally fixated critical size bone defect model for immunodeficient mice. Thirty male nu/nu mice (40.7 ± 2.8 g, 95 ± 2.6 days old) were anesthetized by isoflurane inhalation and an external fixation device (MouseExFix, RISystem, AO Research Institute Davos, Switzerland) was attached to the right femur. Femoral bone defects of 1 mm (n=10), 2 mm (n=10) and 3 mm (n=10) were created. Wounds were closed without any additional treatment. X-ray films obtained immediately after surgery and every 2 weeks postoperatively during the 12 week postoperative observation period were evaluated for bony regeneration and fusion. Furthermore, histomorphology, histomorphometry, immunohistochemistry and µCT analysis were performed. All of the animals survived the operation. Twenty four out of 30 animals reached the twelfth postoperative week. µCT analyses after twelve weeks showed that 3/8 of the 1 mm defects, 5/8 of the 2 mm defects and 8/8 of the 3 mm defects remained as nonunions. The defect volume was 0.36 ± 0.42 mm³ (1 mm group), 1.40 ± 0.88 mm³ (2 mm group), and 2.88 ± 0.28 mm³ (3 mm group) (p<0.001, between all groups). The defect size decreased by 77.6% (1-mm group), 56.8% (2-mm group) and 28.6% (3-mm group) (p=0.152, between all groups). Our method using the MouseExFix device has proven to be a reliable and easy-to-handle external fixation system for the stabilization of critical-size segmental bone defects in immundeficient mice when 3 mm defects are generated. This mouse model allows for high-throughput translational evaluation of concepts for site-specific bone regeneration including strategies using allogenic and xenogenic cell types.:1 Einleitung 1 1.1 Hintergrund 1 1.2 Das Mausmodell 2 1.3 Übersicht Tierversuche mit Knochendefekten 5 1.4 Frakturheilung 6 1.4.1 Allgemeines 6 1.4.2 Räumliche Gliederung 7 1.4.3 Expression von Proteinen der extrazellulären Matrix 8 1.4.4 Das Vier-Phasen-Modell der Frakturheilung 9 1.4.5 Das anabolisch/ katabolische Modell der Frakturheilung 12 1.4.6 Beeinflussung der Frakturheilung 12 1.4.7 Das Diamantkonzept 14 1.5 Osteosynthesesysteme 14 1.6 Pseudarthrosen 15 1.6.1 Definition 15 1.6.2 Ätiologie 16 1.6.3 Klassifikation 16 1.6.4 Therapie 17 2 Material und Methoden 19 2.1 Versuchstiere 19 2.2 Operationsvorbereitung 19 2.3 Operationsablauf 20 2.4 Postoperatives Vorgehen 27 2.5 Verlaufskontrolle 28 2.6 Entnahme der Präparate 29 2.7 Anfertigung der µCT-Aufnahmen 30 2.8 Anfertigung der histologischen Schnitte 30 2.8.1 Bearbeitung der Femora 30 2.8.2 verwendete Färbungen 31 2.9 Beurteilung der Schnitte 32 2.9.1 Histologische Beurteilung 32 2.9.2 Histomorphometrische Beurteilung 33 2.10 Statistik 33 3 Ergebnisse 34 3.1 Überlebensraten und Gewichtsverlauf 34 3.2 Röntgenauswertung 35 3.3 CT-Auswertung 38 3.4 Histologische Auswertung 41 3.5 Histomorphometrische Auswertung 44 3.5.1 TRAP 44 3.5.2 Osteocalcin 46 3.5.3 Osteopontin 47 3.5.4 Osteonectin 48 4 Diskussion 50 4.1 Diskussion etablierter Modelle für kritische Knochendefekte 50 4.1.1 Diskussion der Konzeption der Modelle 50 4.1.2 Diskussion der durchgeführten Anästhesieverfahren 54 4.1.3 Diskussion der Ergebnisse 55 4.1.4 Diskussion der Defektlängen 56 4.1.5 Diskussion der verschiedenen Osteosynthesesysteme 57 4.1.6 Diskussion der Ausfaller 59 4.2 Anwendung und Nutzen immundefizienter Tiermodelle 60 4.3 Vergleich des tibialen und des femoralen murinen Frakturmodells 63 4.4 Diskussion der Beurteilung der Knochenheilung mittels bildgebender und histologischer Verfahren 63 4.5 Anwendungsmöglichkeiten 65 4.6 Schlussfolgerungen 66 5 Zusammenfassung 67 5.1 In deutscher Sprache 67 5.2 In englischer Sprache 68 6 Literaturverzeichnis 70 7 Anhang 92 7.1 Danksagung 92 7.2 Lebenslauf 93 7.3 Veröffentlichungen 95 7.4 Wertetabellen 96 7.5 Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 109