La thérapie antirétrovirale (ART) a permis d’augmenter l’espérance de vie et sa qualité chez les individus infectés par le VIH-1. Toutefois, l’inflammation chronique persiste et est associée à un excès du « B-cell activating factor » (BAFF). Cette cytokine est un facteur clé de la survie et la différenciation des lymphocytes B, en particulier pour ceux dits de la zone marginale (MZ) qui sont des populations B dites innées possédant un « B-cell receptor » (BCR) polyréactif. Dans le contexte de l’infection au VIH-1, l’excès de BAFF a été associé avec la dérégulation du compartiment B, l’hyperglobulinémie, ainsi que le bris de tolérance et l’apparition de manifestations auto-immunes. De plus, nous avons observé une augmentation de la fréquence d’une population présentant à la fois des caractéristiques de cellules B MZ et transitionnelles immatures (TI) que nous avons nommée « précurseurs des MZ » (MZp) dans le sang des individus infectés. Ces MZp partagent également certains marqueurs phénotypiques avec plusieurs populations B régulatrices (Breg) identifiées chez l’humain. Les objectifs de ce travail sont de 1) caractériser le potentiel Breg des MZp par l’analyse de leur transcriptome et par cytométrie en flux, puis 2) d’étudier l’impact de l’infection au VIH-1 et d’un excès de BAFF sur le potentiel Breg des MZp sanguins d’individus de la cohorte de la primo-infection (PHI) du réseau FRQS, et 3) d’étudier l’impact de l’infection au VIH-1 et d’un excès de BAFF sur la production d’anticorps spécifiques au VIH-1 et la possible contribution des MZp à l’hyperglobulinémie chez ces individus. Dans un premier temps, nos résultats démontrent que les MZp d’individus non infectés possèdent un important phénotype Breg caractérisé par l’expression des molécules régulatrices NR4As, CD83, CD39, CD73 et l’IL-10. Les MZp ont également une fonction régulatrice impliquant CD83 et PD-L1. Dans un deuxième temps, nos résultats démontrent que dans le contexte du VIH-1, ce potentiel est complètement altéré vu la diminution d’expression de ces molécules et par la perte de la fonction régulatrice, et qui est directement affectée par un excès de BAFF. Enfin, nous démontrons que les MZp des individus infectés ont un profil associé à l’épuisement et que les gènes impliqués dans l’activation menant à la production d’anticorps sont augmentés, au détriment de ceux associés à la régulation. De façon intéressante, les MZp provenant du sang d’individus infectés expriment à la hausse des transcrits de gènes IGHV impliqués dans la génération d’anticorps neutralisants du VIH-1. De plus, nous démontrons que la quantité et la qualité des IgG spécifiques au virus sont en lien avec le statut de progression de l’infection et le niveau des taux de BAFF qui y est associés. Ainsi, basé sur nos résultats, il serait possible d’envisager une étude avec des avenues thérapeutiques existantes, ciblant BAFF ou l’expression des NR4As, pour tenter de diminuer les niveaux de BAFF ou restaurer le potentiel Breg des MZp respectivement. De telles avenues, en combinaison avec ART, pourraient être intéressantes dans le but de diminuer l’inflammation chronique et restaurer l’immunocompétence chez ces individus. / Antiretroviral therapy (ART) has increased life quality and longevity of HIV-infected individuals. However, chronic inflammation persists and is associated with increased B-cell activating factor (BAFF). BAFF is a key survival and differentiation factor for B-cells, especially for marginal zone B-cells (MZ). MZ are innate-like B-cells that are known for their quick antibody responses and polyreactive B-cell receptor (BCR). In the context of HIV-1 infection, BAFF is found in excess in the blood of infected individuals and is associated with the dysregulation of the B-cell compartment, hyperglobulinemia, breach of tolerance and autoimmune manifestations. We reported an increase in the frequency of precursor-like MZ (MZp) B-cells in the blood of HIV-infected individuals. Interestingly, these MZp possess a phenotype that is similar to certain Breg populations identified in human. The objective of this work is to first characterize the Breg potential of MZp from HIV-uninfected individuals by RNAseq analyses and flow cytometry, and second to study the impact of HIV-1 infection and excess BAFF on the dysregulation of the Breg potential of MZp from blood samples of individuals from the primo-infection (PHI) cohort of the FRQS. Our third objective is to study the impact of HIV-infection and excess BAFF on HIV-1 specific antibodies and better understand the contribution of MZp to hyperglobulinemia in HIV-1 infected individuals. Our results showed that MZp from HIV-uninfected individuals possess a stong Breg phenotype characterized by high expression of regulatory molecules such as NR4As, CD83, CD39, CD73 and IL-10. They also have an important Breg function that involves CD83 and PD-L1. We also demonstrate that HIV-1 infection impairs the Breg potential of MZp by downregulating the expression of regulatory markers and by altering their function, which high BAFF levels can directly affect. Also, MZp from HIV-infected individuals present an exhausted profile and an increased expression of genes involved in immunoglobulin (Ig) production. Interestingly, MZp from the blood of HIV-infected individuals show increased expression of IGHV gene transcripts associated with broadly neutralizing antibodies. We find that the quantity and quality of HIV-Env specific IgG is linked with disease progression status and associated levels of BAFF. Our results suggest that existing therapeutic strategies targeting BAFF or NR4As expression could be contemplated in order to try reducing BAFF levels or for restoring Breg potential, respectively. As such, such avenues could be envisaged as adjunct to ART to lower the inflammatory burden and restore immune competence of HIV-infected individuals.

La reconnaissance du peptide lié au complexe majeur d’histocompatibilité (pCMH) par les cellules T CD8+ et leur récepteur spécifique (TCR) est une étape cruciale dans l’établissement d’une réponse immunitaire protectrice adéquate et de longue durée. L’engagement du TCR engendre une cascade d’évènements de signalisation qui contrôle la prolifération, la différenciation et les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8+ (LT8). Différentes études suggèrent un rôle crucial du zinc dans la biologie des LT8, particulièrement l’observation d’un influx de zinc suivant l’engagement du TCR. De plus, la multitude de transporteurs contrôlant homéostasie du zinc au sein des LT8, couplé aux multiples rôles de cet ion dans les processus cellulaires nous a amené à concentrer notre recherche sur le rôle du zinc dans les cellules T CD8+, qui à ce jour n’est que peu décrit. ZIP13, un des 14 transporteurs contrôlant l’homéostasie du zinc chez les LT8 murins, régule l’activation, la prolifération et la différenciation de ces cellules. En effet, une diminution de l’expression de ZIP13 (ZIP13-KD) en utilisant un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) entraîne une activation précoce exacerbée des LT8 se traduisant par une plus grande prolifération. Ceci a été démontré in vitro dans des lignées d’hybridomes CD8+, mais également chez les LT8 primaires murins (OT-I). De plus, cette hyperactivation est suivie par une perte substantielle des cellules, démontrant un rôle pour ZIP13 de régulateur positif de la survie des cellules T CD8+. L’étude d’une modulation de l’expression de ZIP13 chez les cellules primaires OT-I in vivo dans un modèle d’infection aiguë à Listeria monocytogenes souligne des rôles additionnels de ce gène dans la différenciation des populations effectrices des LT8. Les LT8 ZIP13-KD montrent un biais de différenciation vers la population de cellules effectrices précoces (EEC) au détriment des autres populations effectrices, ainsi qu’une diminution de Ly6C dans les organes lymphoïdes secondaires (SLO). Au site de l’infection, les cellules ZIP13-KD sont enrichies en précurseur de cellules T CD8+ résidentes mémoires (pré-Trm). ZIP13 joue également un rôle dans la formation de la mémoire immunologique puisque les cellules ZIP13-KD ne forment pas de cellules T CD8+ centrales mémoires (Tcm) dans les ganglions lymphatiques. Ces observations sont, corrélées avec une diminution drastique du marqueur de surface CD62L. Ceci se traduit par des cellules OT-I ZIP13-KD formant une mémoire immunologique uniquement composée LT8 effecteurs mémoires (Tem) et de LT8 résidents mémoires (Trm). Finalement, des analyses transcriptomiques des OT-I ZIP13-KD au stade effecteur de la réponse à une infection à Lm-OVA identifient des signatures de gènes associées aux LT8 épuisés et aux cellules Tc17. Nos résultats soulignent l’importance d’une régulation stricte et précise de l’homéostasie du zinc dans les cellules T CD8+ par des transporteurs spécifiques pour une réponse immunitaire adéquate. ZIP13 est le premier transporteur étudié dans le contexte d’une infection aiguë et identifié comme crucial pour la différenciation des populations effectrices ainsi que la formation de la mémoire immunitaire, ajoutant de l’importance à la régulation du zinc dans la biologie des LT8. Une connaissance précise de l’homéostasie spatiotemporelle du zinc dans les LT8 identifierait de nouveaux mécanismes de régulation de ces cellules qui pourrait mener potentiellement au développement de nouveaux outils pour des immunothérapies à base de cellules T génétiquement modifiées. / CD8+ T cell activation via the recognition of peptide-loaded major histocompatibility complex (pMHC) by the T cell receptor (TCR) is crucial for the establishment of a long lasting and protective immune response. TCR triggering induces a cascade of signaling events controlling T cell effector function and differentiation. The multitude of genes controlling zinc homeostasis in T cells, and the observation of an influx of zinc following TCR activation point towards a link between the regulation of zinc homeostasis and CD8+ T cell biology. This growing body of evidence led us to focus our research on zinc homeostasis in T cells, which remains poorly understood. With this study, we have shown that ZIP13, one of the many transporters controlling zinc homeostasis, significantly regulates T cell activation and differentiation following activation. Knockdown (KD) of ZIP13 by shRNA led to a substantial increase in early activation, both in murine CD8+ T cell lines and primary mouse OT-I cells in vitro. Subsequently, this increase in T cell activation is followed by a massive loss of these cells days after activation, highlighting an addition role for ZIP13 in T cell survival. Study of ZIP13 in primary CD8+ T cells in an in vivo acute infection model of Listeria monocytogenes highlights new roles of ZIP13 in the control of effector T cell differentiation. ZIP13-KD in CD8+ T cells alter the normal effector cell differentiation pattern; favoring the early effector cells (EEC) subset and induces a decrease in the surface marker Ly6C in secondary lymphoid organs. At the site of infection, ZIP13-KD CD8+ T cells are enriched in resident memory T cells precursor (pre-Trm). ZIP13 has also an impact on memory T cell formation, since ZIP13-KD cells are lacking the central memory population (Tcm), through the drastic decrease of the surface marker CD62L. This results in ZIP13-KD cells at the memory stage that are mostly composed of effector memory (Tem) and resident memory (Trm) cells. Finally, transcriptomic analyses of WT CD8+ T cells and ZIP13-KD CD8+ T cells at the effector stage demonstrates ZIP13’s role in driving an exhausted T cell and Tc17 cell gene expression signature. Taken together, our results point to the importance of a strict and fine-tuned regulation of zinc homeostasis in T cells through specific zinc transporters for an effective immune response. ZIP13 is the first zinc transporter reported as essential for T cell differentiation and memory formation, adding weight to the importance of zinc regulation in CD8+ immune responses. Having a clear picture of zinc homeostasis in CD8+ T cells would reveal new mechanisms regulating the activity of these cells that could potentially lead to the development of new tools for T cell-based immunotherapy.

La thérapie par cellules T à récepteur d'antigène chimérique (CAR) a produit d'incroyables réponses cliniques contre plusieurs tumeurs malignes, mais elle laisse une marge de manœuvre pour l'échappement de l'antigène. Une nouvelle approche pour surmonter ce problème consisterait à combiner la capacité des CAR à cibler les tumeurs avec la capacité des cellules dendritiques (CD) à amorcer les cellules T afin de générer une thérapie cellulaire qui favorise la propagation de l'épitope plutôt que la destruction directe de la cible. J'ai donc émis l'hypothèse que les cellules dendritiques exprimant les CAR (CAR-CD) peuvent renforcer l'amorçage des cellules T contre les cibles tumorales afin de produire un contrôle adaptatif des tumeurs médié par les cellules T. En utilisant des CD dérivées de la moelle osseuse murine, j'ai d'abord développé un nouveau protocole pour générer des CD. En ajoutant de l'IFNα aux cultures de DC GM-CSF, j'ai généré des CD qui expriment des niveaux plus élevés de molécules stimulant les cellules T et qui induisent une plus forte prolifération des cellules T CD8+ in-vitro par rapport aux CD générées avec le GM-CSF seul. In vivo, ces CD favorisent des réponses effectrices plus fortes, les cellules T CD8+ résultantes exprimant des niveaux plus élevés de marqueurs effectrices, notamment KLRG1 et TIM3, mais des niveaux plus faibles de molécules inhibitrices, notamment PD-1 et CD73. L'expression d'un CAR dans ces DC leur permet de tuer directement des cibles tumorales et d'acquérir des antigènes tumoraux. Plus important encore, ces CAR-CD sont en synergie avec les cellules T CD8+ pour contrôler les cellules tumorales in-vitro, en améliorant la prolifération et la capacité de destruction des cellules T. Chez la souris, les CAR-CD agissent comme un vaccin in vivo en favorisant la génération de réponses de cellules T spécifiques de la tumeur lorsqu'elles sont injectées par voie intratumorale, ce qui permet d'améliorer le contrôle de la tumeur. / Chimeric Antigen Receptor (CAR) T cell therapy has produced unbelievable clinical responses against several malignancies however, this therapy leaves room for antigen escape. One novel approach to overcome this would be to combine the tumor targeting ability of CARs with the T cell priming capacity of dendritic cells (DCs) to generate a cell therapy that provokes endogenous adaptive immunity through epitope spreading rather than just direct target killing. Therefore, I hypothesized that CAR expressing DCs (CAR-DCs) can enhance T cell priming against tumor targets to produce adaptive T cell mediated tumor control. Using murine bone marrow derived DCs, I first developed a new protocol for generating DCs using IFNα. The addition of IFNα to GM-CSF DC cultures generated DCs that express higher levels of T cell stimulatory molecules and induce stronger CD8+ T cell proliferation in-vitro compared to DCs generated with GM-CSF alone. In-vivo, these DCs promote stronger effector responses with the resulting CD8+ T cells expressing higher levels of effector markers including KLRG1 and TIM3 but lower levels of inhibitory molecules including PD-1 and CD73. The expression of a CAR in these DCs allowed them to directly kill tumor targets and acquire tumor antigens. More importantly, these CAR-DCs synergized with CD8+ T cells to control tumor cells in-vitro, enhancing the proliferation and killing capacity of the T cells. In mice, CAR-DCs act as an in-vivo vaccine promoting the generation of tumor specific T cell responses when injected intratumorally, producing enhanced tumor control.

Les interactions neuro-immunitaires entre les systèmes sensoriels et immunitaires ont été abondamment étudiées; cependant, leur rôle dans la régulation des cancers est encore mal connu. Les interactions croisées entre les cytokines, les facteurs de croissance et les neuropeptides peuvent promouvoir la progression des tumeurs. Les neuropeptides libérés par les nocicepteurs peuvent affecter la polarisation, la chimiotaxie et l'activité du système immunitaire acquis. Étant donné que les neurones sensoriels libèrent localement des neuropeptides qui modulent l'activité des lymphocytes, nous faisons l'hypothèse que les nocicepteurs sécrètent des neuropeptides qui induisent l'épuisement des cellules T CD8 et la croissance tumorale. L’épuisement des lymphocytes T CD8 est un phénomène observé dans le cadre d’infections chroniques et de cancers. Elle est définie comme une perte de la fonction effectrice des lymphocytes T CD8 (diminution de la production d'IFN-γ, de TNF-α et d'IL-2) ainsi qu'une expression élevée de récepteurs inhibiteurs tels que PD-1 (protéine 1 de mort cellulaire programmée), LAG-3 (gène 3 d'activation des lymphocytes) et TIM-3 (protéine 3 d'immunoglobuline des lymphocytes T et de contenant du domaine mucine). Nous avons utilisé le modèle murin de mélanome pour tester cette hypothèse et avons observé que les cellules malignes de cancer de la peau B16F10 interagissent avec les nocicepteurs pour promouvoir la croissance des neurites, la sensibilité aux ligands activateurs et la libération de neuropeptides. En conséquence, le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP), qui est libéré par les nocicepteurs, augmente directement l'épuisement des cellules T CD8 et réduit leur capacité à éliminer les cellules du mélanome. L'ablation génétique des neurones sensoriels, leur inhibition pharmacologique ou le blocage du récepteur au CGRP (RAMP1) suffisent à limiter l'épuisement des lymphocytes infiltrés dans la tumeur et la croissance tumorale. De plus, l'injection de CGRP recombinant dans des souris dépourvues de neurones sensoriels réduit l'épuisement des cellules T CD8. Les cellules T CD8 RAMP1-/- montrent aussi moins d'épuisement que leurs homologues sauvages lorsqu'elles sont co-transplantées dans des souris immunodéficientes Rag1-/- portant une tumeur. En résumé, réduire la libération de CGRP en bloquant localement les nocicepteurs associés à la tumeur limite les effets immunomodulateurs de CGRP sur les cellules T cytotoxiques CD8 et représente une stratégie d'intérêt pour protéger l'immunité antitumorale. / Neuroimmune crosstalk between the nervous and the immune systems has been widely studied; however, their modulating roles are largely unknown in cancer. Bilateral interactions of cytokines, growth factors and neuropeptides may support tumor progression. Nociceptor-released neuropeptides can affect polarization, chemotaxis and adaptive immune system activity. Since sensory neurons locally release neuropeptides that modulate the activities of lymphocytes, we hypothesized that nociceptors might secrete neuropeptides leading to CD8+ T-cell exhaustion and tumor growth. CD8 T cell exhaustion is a phenomenon observed in the context of chronic infections and cancer. It is defined as loss of effector function of CD8 T cells (decreasing the production of IFN-γ, TNF-α, and IL-2) as well as high expression of inhibitory receptors such as PD-1 (programmed cell death protein 1), LAG-3 (lymphocyte-activation gene 3), and TIM-3 (T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3). We used the mouse model of melanoma cancer to test this hypothesis and found that malignant B16F10 skin cancer cells interacted with nociceptors to expand neurite outgrowth, responsiveness to noxious ligands, and neuropeptide release. Consecutively, neuropeptide calcitonin gene-related peptide (CGRP), which is released by nociceptors, directly increased the exhaustion of cytotoxic CD8+ T cells and reduced their ability to eliminate melanoma cells. Genetic ablation of sensory neurons, local pharmacological silencing, and antagonism of the CGRP receptor (RAMP1) were all able to limit the exhaustion of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) and tumor growth. Moreover, treatment with recombinant CGRP in sensory neuron- depleted mice reduced the exhaustion of CD8+ T cells. Compared with wild-type cells, RAMP1-/- CD8+ T cells were rescued to go under exhaustion when co-transplanted into tumor-bearing Rag1-/- deficient mice. In summary, reducing CGRP release by local silencing of tumor-associated nociceptors, limits the immunomodulatory effects of CGRP on cytotoxic CD8+ T cells and represents an ideal strategy to protect anti-tumor immunity.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SRRP) est une maladie virale d'une importance économique considérable, caractérisée par des signes d'hyperthermie et d'anorexie, accompagnés de problèmes reproducteurs chez les truies de toutes parités, et de problèmes respiratoires chez les porcs de tous âges. Le SRRP est apparu dans plusieurs États américains ainsi qu'au Canada au cours de l'année 1987. La maladie fut rapportée en Allemagne vers la fin de l'année 1990 et se propagea rapidement en Europe occidentale. Dès 1994, la présence de l'infection avait été officiellement reconnue dans les élevages de porc de plus de 16 pays d'Amérique, d'Europe et d'Asie. La sévérité des signes cliniques est très variable selon le statut immunitaire des animaux et les souches virales en cause : il peut s'agir d'une atteinte asymptomatique, d'une infection chronique se manifestant par une baisse de la productivité (retard de croissance, problèmes d'infertilité), ou d'une atteinte plus manifeste où les problèmes respiratoires peuvent être responsables de mortalités, de hauts taux de condamnation à l'abattage et d'un nombre très accru d'avortements tardifs ou de pertes majeures de jeunes porcelets.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Actinobacillus pleuropneumoniae est un pathogène strict des voies respiratoires du porc et l'agent causal d'une pleuropneumonie. Plusieurs facteurs de virulence déjà connus sont impliqués dans ce processus infectieux. Récemment, nous avons démontré la liaison de l'hémoglobine porcine au lipopolysaccharide (LPS) d'A. pleuropneumoniae. Nous avons également mis en évidence qu'A. pleuropneumoniae pouvait utiliser l'hémoglobine comme seule source de fer pour sa croissance. Par contre, aucune information n'est présentement disponible concernant le système d'acquisition en fer provenant de l'hémoglobine porcine. Certains chercheurs ont identifié la liaison entre le LPS de certaines bactéries et l'hémoglobine humaine. De plus, des protéines liant l'hémoglobine ont été mises en évidence chez certaines bactéries. L'intérêt premier des études décrites dans cette thèse était de caractériser les molécules impliquées dans la liaison de l'hémoglobine porcine chez A. pleuropneumoniae. Le premier objectif de ce travail consistait à étudier l'effet de la liaison de l'hémoglobine porcine sur les propriétés biologiques et physiques du LPS d'A . pleuropneumoniae. Tout d'abord, la liaison de l'hémoglobine porcine à la surface de la cellule entière d'A. pleuropneumoniae a été mise en évidence par microscopie électronique à transmission (MET) et par spectroscopie. Puis il a été observé par cytométrie en flux que cette liaison ne modifiait pas l'accessibilité des anticorps aux antigènes de surface 0 et K. Ensuite, la liaison de l'hémoglobine porcine au lipide A de la molécule de LPS a été confirmée par le déplacement de la sonde fluorescente dansylcadavérine. Des analyses en MET ont mis en évidence que l'hémoglobine porcine fragmentait le LPS et diminuait ainsi sa vélocité de sédimentation sur un gradient de sucrose. Des tests sur lysats d'amébocytes du Limulus (ou LAL) ont révélé que l'hémoglobine diminuait l'activité biologique du LPS et réduisait également son habileté à stimuler la production d'oxide nitrique par les macrophages murins. Le deuxième objectif de notre étude consistait à élaborer une méthodologie nous permettant de quantifier la liaison de l'hémoglobine porcine à la surface d'A. pleuropneumoniae dans le but de comparer différentes souches et différentes conditions de croissance. L'activité liant l'hémoglobine a été évaluée chez A. pleuropneumoniae par cytométrie en flux à l'aide d'hémoglobine porcine marquée à la fluorescéine. L'activité liant l'hémoglobine a été démontrée chez des souches représentatives d'A . pleuropneumoniae appartenant aux sérotypes 1 et 2. En comparant l'activité liant l'hémoglobine chez A. pleuropneumoniae sérotype 1 souche 4074 dans différentes conditions de croissance, il a été démontré que la restriction en fer augmentait l'expression des récepteurs d'hémoglobine. Ceci implique que l'activité liant l'hémoglobine semble, en partie, répressible par le fer. Ces résultats nous indiquaient que, en plus des LPS, des protéines de la membrane externe (OMPs) régulées par le fer pourraient possiblement être impliquées dans l'activité liant l'hémoglobine. De plus, des mutants isogéniques LPS et un mutant acapsulé d A. pleuropneumoniae serotype 1 ont été testés par cytométrie en flux afin de comprendre le rôle des polysaccharides de surface dans l'activité liant l'hémoglobine. Les expériences menées avec le mutant acapsulé ont indiqué que les molécules de surface possédant une activité liant l'hémoglobine étaient plus exposées à la surface cellulaire en absence du polysaccharide capsulaire. Cependant, l'activité liant l'hémoglobine des mutants LPS analysés dans cette étude était semblable à celle de la souche mère. Le profil des protéines de la membrane externe d'A. pleuropneumoniae sérotype 1 obtenu dans des conditions suffisantes ou restreintes en fer a été également évalué sur gel de polyacrylamide. Des OMPs régulées par le fer ont été observées suggérant qu'une ou plusieurs de ces OMPs pourraient jouer un rôle dans l'activité liant l'hémoglobine détectée par cytométrie en flux. Le troisième objectif de notre étude était d'identifier et de caractériser un ou des récepteurs protéiques impliqués dans la liaison de l'hémoglobine porcine. Les souches de référence représentant les 12 sérotypes d'A. pleuropneumoniae ont été examinées pour tester leur habileté à utiliser différentes sources de fer pour leur croissance. Dans un test de promotion, toutes les souches ont utilisé soit l'hémoglobine porcine ou l'hémine porcine. Cette acquisition ne semblait pas spécifique d'espèce étant donné que les souches d'A. pleuropneumoniae ont également utilisé l'hémoglobine bovine ou l'hémine bovine comme seule source de fer pour croître. En utilisant une procédure de purification par affinité à l'aide d'hémine- ou d'hémoglobine-agarose, une OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine a été isolée chez A. pleuropneumoniae sérotype 1 souche 4074 après croissance dans des conditions de restriction en fer. Des OMPs mineures de 47 et 36 kDa liant l'hémine ou l'hémoglobine ont également été identifiées. Une étude portant sur les souches de référence des 12 sérotypes d'A. pleuropneumoniae après croissance dans des conditions de restriction en fer a révélé que toutes les souches, excepté celles des sérotypes 3, 6, 7, et 10 synthétisaient l'OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine. Cette étude a également démontré que l'OMP mineure de 47 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine était conservée chez toutes les souches testées représentant les 12 sérotypes; l'OMP mineure de 36 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine a été isolée chez toutes les souches testées sauf chez la souche 8329/85 représentant le sérotype 12. Le marquage de la cellule entière d'A. pleuropneumoniae au palmitate radioactif a indiqué que l'OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine n'était pas de nature lipoprotéique. Cependant, les OMPs mineures de 47 et 36 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine pourraient être des lipoprotéines étant donné que des bandes d'approximativement 47 et 36 kDa ont été observées suite au marquage. Malgré plusieurs essais, il n'a pas été possible de déterminer la séquence N-terminale en acides aminés de l'OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine. Afin de prouver que l'OMP majeure de 75 kDa purifiée par hémine-agarose ou hémoglobine-agarose étaient identiques et dans le but d'obtenir une séquence nous permettant de synthétiser un oligonucléotide, ces protéines ont été analysées par un spectromètre de masse couplé à un HPLC et à un séquenceur Edman. Ces analyses ont révélé des peptides communs entre l'OMP purifiée par hémineagarose et l'OMP purifiée par hémoglobine-agarose. Ces résultats suggèrent fortement que ces peptides proviendraient de la même protéine. L'ensemble de nos résultats suggèrent donc que l'OMP majeure de 75 kDa et les OMPs mineures de 36 et 47 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine chez A. pleuropneumoniae pourraient être impliquées dans le système d'acquisition en fer provenant de l'hémine ou de l'hémoglobine porcine.

Introduction. Après 40 ans de recherche, l’éradication de la pandémie mondiale à VIH n’est pas encore à notre portée. Si le Canada a connu une raréfaction des cas de transmissions verticales, en 2019 on compte plus de 1,8 million d’enfants infectés par le VIH. Durant l’infection à VIH, la thérapie antirétrovirale (TAR) et les réponses immunitaires à médiation cellulaire, y compris celles véhiculées par les lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (CTL), jouent aussi un rôle important dans la limitation de la réplication virale. L’atteinte et le maintien d’une suppression virale soutenue (SVS) sous l’effet de la TAR sont associés à une limitation de taille du réservoir cellulaire du VIH pédiatrique. Si l’on possède beaucoup d’informations sur le développement et l’évolution des réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigées contre le VIH chez l’adulte, ce n’est pas le cas au niveau pédiatrique. Cette thèse avait pour but de caractériser la complexité phénotypique et fonctionnelle de la réponse antivirale des cellules CD8+ chez les enfants et les adolescents infectés par le VIH-1. Objectifs : Caractériser les réponses anti-VIH-1 à médiation cellulaire chez les enfants et les adolescents infectés. Mesurer la réponse immunitaire dirigée spécifiquement contre la protéine Gag du VIH-1. Nous avons aussi étudié l’expression des marqueurs d’épuisement des cellules T chez l’enfant et l’adolescent infectés verticalement, ainsi que le transcriptome des cellules T CD8+ effectrices mémoires. Résultats : Les enfants et les adolescents sont capables de développer des réponses à médiation cellulaire dirigées spécifiquement contre le VIH-1, et cela malgré une longue période sous TAR. Les réponses observées sont influencées par l’âge et la proportion de vie cumulative sous SVS (cPLUS). Les réponses IFN- spécifiques au VIH sont augmentées avec l'âge en termes d'amplitude et de spectre de reconnaissance antigénique et sont diminuée avec une cPLUS plus faible, ce qui pourrait refléter une exposition moindre aux antigènes du VIH. Les mécanismes de l'expansion quantitative des réponses des lymphocytes T sont différents de ceux qui conduisent à l'élargissement du spectre de reconnaissance des antigènes viraux par les lymphocytes T de l’hôte. L’âge et la cPLUS exerçaient une influence sur l’expression des récepteurs inhibiteurs, ce qui pourrait contribuer à la difficulté d’atteindre et de maintenir une SVS ainsi que la progression plus rapide de l’infection chez les enfants vivant avec le VIH. Comparativement aux lymphocytes T CD4+, des fréquences plus élevées de lymphocytes T CD8+ exprimaient des récepteurs inhibiteurs et exprimaient un plus grand nombre de récepteurs différents. Cette tendance était influencée par l'âge. Cela indique que les lymphocytes T CD8+ sont plus épuisés que les lymphocytes T CD4+, ce qui pourrait contribuer à la persistance du VIH de l'enfance à l'âge adulte sous TAR. Cependant, les corrélations des fréquences de cellules exprimant des récepteurs inhibiteurs avec l'ampleur des réponses immunitaires à médiation cellulaire spécifiques au VIH suggèrent fortement que ces cellules n'étaient pas fonctionnellement épuisées. L’âge et la cPLUS exerçaient une influence déterminante sur l’expression de certains gènes. L’exploitation de technologies récentes pour l’étude du transcriptome des cellules T CD8+ mémoires au niveau unicellulaire nous ont permis d’obtenir une grande quantité de données à partir qu’un faible échantillon de cellules. Les participants avec une longue cPLUS avaient une fréquence plus grande de cellules exprimant CD69 et exprimant des gènes stimulés par l'interféron (ISG). Cependant, chez ces patients, on observait également une expression moindre des gènes associés à l’épuisement. Conclusion. Nous avons apporté des réponses quant aux mécanismes de la réponse immunitaire pédiatrique, mais aussi d’identifier les facteurs qui peuvent l’influencer. Cependant, l’écriture de la thèse a révélé une carence importante dans la compréhension des mécanismes de l’immunité au niveau pédiatrique au niveau de la littérature. Pour dépasser les limites des études pédiatriques, il existe un besoin constant de mettre en place des techniques de suivi immunitaire réalisables sur de petits échantillons biologiques. / Introduction. After 40 years of research, the eradication of the global HIV pandemic is not yet within our reach. While Canada has experienced a decline in cases of vertical transmission, in 2019 there were more than 1.8 million children infected with HIV. During HIV infection, antiretroviral therapy (ART) and cell-mediated immune responses, including those mediated by CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL), also play an important role in limiting viral replication. The achievement and maintenance of sustained viral suppression (SVS) under the effect of ART are associated with a limitation in the size of the cellular reservoir of HIV at the pediatric level. While there is a lot of information on the development and evolution of cell-mediated immune responses against HIV, this is not the case at the pediatric level. This thesis aimed to characterize the phenotypic and functional complexity of the antiviral response of CD8+ cells in children and adolescents infected with HIV-1. Objectives: To characterize cell-mediated anti-HIV-1 responses in infected children and adolescents. To measure the immune response directed specifically against the Gag protein of HIV-1. To study the expression of T cell exhaustion markers in vertically infected children and adolescents, as well as the transcriptome of effector memory CD8+ T cells. Results: Children and adolescents are able to develop cell-mediated responses specifically directed against HIV, despite SVS under ART. The immune responses observed are influenced by age and the proportion of cumulative life on SVS (cPLUS). HIV-specific IFN- responses are increased with age in terms of amplitude and antigen recognition spectrum and are decreased with lower cPLUS, which may reflect shorter exposure to HIV antigens. Two distinct mechanisms of T cell responses were observed. On one hand quantitative expansion of T cell responses and on the other hand the broadening of the T cells spectrum of viral antigens recognition. Age and cPLUS exerted an influence on the expression of inhibitory receptors, which could contribute to the difficulty of achieving and maintaining SVS as well as the more rapid progression of infection in children living with HIV. Compared to CD4+ T cells, higher frequencies of CD8+ T cells expressed inhibitory receptors and expressed more different type of receptors. This trend was influenced by age. This indicates that CD8+ T cells are more depleted than CD4+ T cells, which may contribute to the persistence of HIV from childhood to adulthood on ART. However, correlations of frequencies of cells expressing inhibitory receptors with the magnitude of HIV-specific cell-mediated immune responses strongly suggest that these cells were not functionally exhausted but rather recently activated. Age and cPLUS exerted a determining influence on the expression of certain genes. The exploitation of recent technologies for the study of the transcriptome of memory CD8+ T cells at the single-cell level has enabled us to obtain a large amount of data from only a small biological sample. Participants with long cPLUS had a higher frequency of cells expressing CD69 and ISGs. However, in these patients, there was also a lower expression of genes associated with exhaustion. Conclusion. We have provided answers as to the mechanisms of the pediatric immune response but also identify the factors that can influence it. However, the writing of the thesis revealed an important deficiency in the understanding of the immunity mechanisms at the pediatric level in current literature. To overcome limits in pediatric studies, there is a constant need to set up immune monitoring techniques that can be performed on small biological samples Keywords: HIV, perinatal infection, inhibitory receptors, immune response, sustained viral suppression.

Malgré la présence d’un traitement très efficace disponible pour les personnes vivant avec le virus de l’immunodéficience humaine (PVVIH) qui permet à celles-ci d’avoir une espérance de vie presque normale, une inflammation chronique demeure toujours, et celle-ci est la cause du développement prématuré de comorbidités associées au vieillissement, comme des maladies cardiovasculaires (MCV) telles que l’athérosclérose. Cette inflammation chronique se traduit entre autres par un excès de la molécule « B-cell activating factor » (BAFF), un facteur de survie et différenciation des lymphocytes B. L’excès de BAFF dans le contexte du VIH est associé notamment avec la dérégulation du compartiment des lymphocytes B, l’hyperglobulinémie, le bris de tolérance et certaines manifestations autoimmunes. De façon importante, nous avons caractérisé l’augmentation des fréquences des cellules B de la zone marginale de type précurseurs (MZp), une population innée dont la sélection implique BAFF, et qui chez les individus non-infectés a démontré une forte capacité régulatrice et anti-inflammatoire. L’objectif de ce travail était, dans un premier temps, d’identifier, à l’aide d’analyses transcriptomique et par cytométrie en flux, le phénotype des MZp provenant du sang des PVVIH. Dans un second temps, l’objectif de ce travail était d’étudier la corrélation entre les niveaux de BAFF et de son analogue « A proliferation-inducing ligand » (APRIL) avec la dérégulation des MZp ainsi que des marqueurs classiques du développement de MCV dans les spécimens sanguins provenant d’individus de la Cohorte Canadienne VIH et Vieillissement. Nos résultats démontrent une altération dans le phénotype B régulateur (Breg) des MZp, traduit par une baisse d’expression des récepteurs nucléaires NR4A1, NR4A2 et NR4A3, ainsi qu’une baisse de leur fonction régulatrice. Cette baisse d’expression et de fonction semble être directement en lien avec l’excès de BAFF dans le contexte du VIH. De plus, nous démontrons que BAFF corrèle avec plusieurs facteurs de risque pour le développement des MCV, tandis qu’APRIL corrèle négativement avec ceux-ci. De façon intéressante, APRIL est capable de moduler positivement l’expression des NR4As par les MZp in vitro. Nos résultats suggèrent que des stratégies permettant de moduler les niveaux de BAFF et/ou APRIL pourraient être envisagées afin de réduire le fardeau inflammatoire chez les PVVIH et restaurer l’immunocompétence des MZp. / Despite the existence of a very efficient treatment that allows people living with the human immunodeficiency virus (PLHIV) to live a relatively normal life, chronic inflammation persists and is the cause of the premature development of age-associated comorbidities, such as cardiovascular diseases (CVD) like atherosclerosis. This chronic inflammation involves an excess of “B-cell activation factor” (BAFF), a survival and differentiation factor for B-cells, especially for Marginal Zone B-cells (MZ), which are innate type B-cells that depend on BAFF for their selection. The excess of BAFF is associated with B-cell deregulations, breakage of tolerance and certain auto-immune manifestations. Notably, we have reported that frequencies of precursor MZ B-cells (MZp) were increased in the blood of HIV-1 infected individuals. As such, we have recently shown that in uninfected individuals, MZp possess strong regulatory and anti-inflammatory capacities. The objective of this work was to first, identify, based on transcriptomic and flow-cytometry analyses, the gene and molecular phenotype of MZ populations from the blood of PLHIV, and secondly, to study the correlation between levels of BAFF and its analogue, “A proliferation-inducing ligand” (APRIL) with MZ deregulation and classical CVD markers in blood samples from individuals of the Canadian HIV and Aging Cohort Study. Our results show an alteration in the regulatory B-cell (Breg) phenotype of MZp, related to a downregulation of the nuclear receptors NR4A1, NR4A2 and NR4A3. Furthermore, we find a reduction of the regulatory function of blood MZp. This diminished expression and function seems to be linked to the excess of BAFF in the HIV context. Furthermore, we demonstrate that BAFF correlates with several risk factors for atherosclerosis development, while APRIL negatively correlate with these factors. Interestingly, APRIL positively modulates the expression of NR4As by MZp in vitro. Our results suggest that BAFF and/or APRIL modulation strategies could be envisaged to lower the inflammatory burden in people living with HIV and restore MZp immunocompetence.

L’activation des lymphocytes T (LT) CD8 naïfs mène à leur différenciation en deux sous-populations d'effecteurs, les SLEC (short-lived effector cells) et MPEC (memory precursor effector cells). Après contrôle de l’infection, les SLEC meurent par apoptose tandis que les MPEC deviennent des cellules mémoires qui protègent contre la réinfection. Peu de choses sont connues sur le rôle des mécanismes post-traductionnels, tel que la déubiquitination lors de la différenciation des LT CD8+. La déubiquitinase (DUB) BAP1 joue un rôle clé dans la différenciation thymique et dans le maintien des populations de LT matures. Elle interagit avec plusieurs partenaires comme YY1 et EZH2 dans des cellules autres que les LT. Certains de ces partenaires ont des rôles importants dans la biologie des LT CD8 notamment en contexte infectieux suggérant que BAP1 régule la réponse des LT CD8+ lors d’une infection. Afin de tester cela, des LT CD8 OT-I spécifiques pour le peptide ovalbumine dans lesquelles BAP1 a été surexprimé ont été transférés dans des souris infectées avec la bactérie Listeria monocytogenes codant pour l’ovalbumine (LM-OVA). Nos résultats au pic de la réponse démontrent un défaut de l’expansion clonale des LT CD8+, de la différenciation en SLEC et une augmentation de la différenciation en MPEC. Nous observons aussi une augmentation de la différenciation en LT centrale mémoire (TCM) au stade mémoire. Finalement, nous évaluerons aussi l’impact de la délétion de Bap1 dans la réponse des LT CD8+. Cela contribuera à une meilleure compréhension du rôle de l’ubiquitination dans la biologie des LT CD8+ dont l’importance est centrale dans la réponse face aux infections et au cancer. / Following antigen recognition, naive CD8+ T cells expand massively and differentiate into effector cells. After pathogen clearance, the short-lived effector cells (SLECs) die while memory precursor effector cells (MPECS) persist and differentiate into memory T cells to confer long-term protection against reinfection. The transcriptional network controlling the SLEC/MPEC differentiation is well characterized but little is known about the role of posttranslational modifications, such as deubiquitination, in this process. The deubiquitinase BAP1 interacts with multiple partners including YY1 and EZH2 that are important for CD8+ T cell response. BAP1 has been shown to participate in thymic differentiation and in the maintenance of mature peripheral T cells. However, the function of BAP1 during CD8+ T cell response to infection is unknow. To address this, we overexpressed BAP1 wild type (WT) in ovalbumin-specific (OT-I) CD8+ T cells by retroviral transduction and analysed their response after adoptive transfer into mice infected with Listeria monocytogenes encoding ovalbumin. The overexpression of BAP1 WT severely reduced CD8+ T cell expansion, SLEC differentiation and functionality. It also induces enhanced MPEC differentiation. In fact, we observed an increase in central memory CD8 T cell (TCM) differentiation 30 days following infection. Finally, we confirmed the presence of key partners of BAP1 complex in activated and naïve CD8+ T cells. As next steps, we will analyse the impact of BAP1-deficiency in CD8+ T cell response to infection. This will contribute to a better understanding of the role of deubiquitination in CD8+ T cell response

CD2 is a transmembrane molecule and a “non-canonical” member of the signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) family of receptors that is expressed on T cells and NK cells. Its ligands, mouse CD48 and human CD58, are widely expressed on hematopoietic cells including antigen-presenting cells (APCs) and T cells. Previous studies indicated that CD2 promotes T-cell receptor (TCR) signaling when it is engaged by its ligands displayed on APCs. However, the supporting experimental data were rather controversial, and there is no general agreement about the role of CD2 in T cell activation. To study the function of CD2 and its ligands in T cells, we examined T cell functions in newly generated mouse strains lacking CD2 or CD48 in the C57BL/6 background. Compared to wild-type (WT) mice, T cells from CD2-deficient (“knock-out”; KO) mice had severe activation defects. Surprisingly, expression of CD48 on T cells, not on APCs, was also necessary for optimal T cell responses. We found evidence of CD2 interacted with CD48 in cis on T cells and observed their co-localization by confocal microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET). The only exception was CD2-dependent cytotoxicity, which required CD48 both on T cells and on APCs. Mechanistic studies using mass spectrometry and structure-function analyses revealed that the cis interactions between CD2 and CD48 on T cells boosted TCR signaling, an effect that correlated with the capacity of CD2 to recruit the kinase Lck. Similarly, our further study revealed that the cis interactions between CD2 and CD58 on human T cells were also necessary for maximal TCR signaling and T cell activation. Taken together, our studies provide clear evidence that cis interactions between CD2 and its ligands on T cells are important in TCR signaling and T cell activation. Modulation of these cis interactions can be a promising approach to suppress or enhance T cell activation in a therapeutic setting. / CD2 est une molécule transmembranaire et un membre “ non-canonique ” de la famille de la famille SLAM (« signaling lymphocyte activation molecule ») exprimée à la surface des lymphocytes T et des cellules NK (« natural killer »). Les ligands de CD2, CD48 chez la souris et CD58 chez l’humain, sont exprimés de manière ubiquitaire sur les cellules hématopoïétiques, y compris sur les cellules présentatrices d’antigène (CPA) et lymphocytes T. Des études antérieures ont indiqué que CD2 est impliqué dans la signalisation des récepteurs TCR (« T-cell receptor ») en réponse à son engagement par CD48 sur le CPA; cependant, les données expérimentales qui supportent ce modèle sont plutôt contradictoires et aucun accord n’a été trouvé sur les rôle de CD2 dans l’activation de lymphocytes T. Pour étudier la fonction de CD2 et ses ligands, nous avons examiné les fonctions des lymphocytes T chez des souches de souris dépourvues de CD2 ou CD48 nouvellement générées à partir du “fond génétique” C57BL/6. Par rapport aux souris de type sauvage (WT; « wild-type »), les lymphocytes T de souris CD2-déficientes (« knock-out »; KO) présentent des sévères défauts d’activation. Il est intéressant de noter que l’expression de CD48 sur les lymphocytes T, mais non sur les CPA, était aussi nécessaire pour les réponses des lymphocytes T. Nous avons également démontré que CD2 interagit en cis avec CD48 sur les cellules T et avons observé leur co-localisation par microscopie confocale et FRET (« fluorescence resonance energy transfer) ». La seule exception était la cytotoxicité CD2- dépendante, qui nécessitait l’expression de CD48 à la fois sur les lymphocytes T et sur les CPA. L’étude des mécanismes par la spectrométrie de masse et les analyses structurefonction ont démontré que les interactions en cis entre CD2 et CD48 permettent de stimuler la signalisation du TCR, ce qui corrèle avec la capacité de CD2 à recruter la kinase Lck. De manière similaire, notre étude plus approfondie a démontré que les interactions en cis entre CD2 et CD58 sur les lymphocytes T humains sont nécessaires pour la signalisation maximale du TCR et l’activation cellulaire T. L’ensemble de nos études ont mis en évidence que les interactions en cis entre CD2 et ses ligands sur les lymphocytes T jouent un rôle important dans la signalisation du TCR et l’activation de ces cellules. La modulation de ces interaction en cis pourrait être une approche potentielle pour augmenter ou interférer avec l’activation des lymphocytes T dans un contexte thérapeutique.