Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-12T21:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_MariaCristianeMartinsde_M.pdf: 4631873 bytes, checksum: 3ea11569f1a6cd0e7b608b162b33068a (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As imunoglobulinas (em particular, Imunoglobulina G (IgG)) têm uma aplicação ampla, sendo essenciais em testes de diagnóstico in vitro, em terapia, análises e investigação em diversas áreas. Muitos estudos têm sido realizados visando à purificação de IgG, destacando-se as técnicas de adsorção seletiva, como as cromatografias de troca iônica, negativa e de afinidade. Neste contexto, aplicou-se a cromatografia negativa com diaminas imobilizadas para purificação de IgG a partir do soro e plasma humano em uma única etapa, visando à obtenção de um alto grau de pureza. Os experimentos cromatográficos envolveram cinco etapas: condicionamento, alimentação, lavagem, eluição e regeneração da coluna cromatográfica. Para determinação do melhor ligante para adsorção de impurezas, realizaram-se ensaios com os adsorventes w-aminopropil-agarose, w-aminohexilagarose, w-aminohexil-bisoxirano-agarose, w-aminooctil-agarose, w-aminodecilbisoxirano- agarose, w-aminododecil-bisoxirano-agarose e DEAE-agarose na presença de diferentes sistemas tamponantes. De acordo com eletroforeses SDSPAGE e análises nefelométricas das frações dos picos de proteínas obtidos, a melhor condição utilizada para a purificação de IgG a partir de soro e plasma humano diluído em HEPES 25 mM a pH 6,8 e MOPS pH 7,9, respectivamente, em ?-aminohexil-bisoxirano-agarose, atingindo fator de purificação de 6,8 vezes e pureza superior a 95%. As isotermas de adsorção de albumina, principal impureza do soro e do plasma humano, ajustadas pelo modelo de Langmuir, indicaram alta capacidade de adsorção de albumina dos géis ?-aminohexil-bisoxirano-agarose e ?-aminodecil-bisoxirano-agarose, de 206,6 e 78,6 mg/mL de adsorvente, respectivamente. Os adsorventes ?-aminohexil-bisoxirano-agarose e ?- aminodecil-bisoxirano-agarose mostraram-se mais eficientes para purificação de IgG em termos de rendimento (76,8 e 74,7%, respectivamente) e capacidade dinâmica (4,23 e 4,51 mg de IgG/mL de adsorvente, respectivamente), do que o gel controle DEAE-agarose (51,9% de rendimento e 3,19 mg de IgG/mL de adsorvente). / Abstract: Immunoglobulins, in particular immunoglobulin G (IgG), have a broad application range and are essential to in vitro diagnostic tests, in therapies and researches in several fields. Many studies have been done aiming IgG purification, mainly using techniques of selective adsorption, such as ion exchange chromatography and negative affinity. In this context, the concept of negative chromatography with immobilized diamines was used for IgG purification from human serum and plasma in a single step, aiming to obtain high pure IgG. Chromatographic experiments involved five steps: conditioning, feeding, washing, elution and regeneration of the column. In order to determine the best condition for adsorption of impurities, trial experiments were performed with ?-aminopropylagarose, ?-aminohexyl-agarose, ?-aminooctyl-agarose, ?-aminodecyl-agarose, ?-aminododecyl-agarose and DEAE-agarose using different buffer systems. According to SDS-PAGE and nephelometry analysis, the most selective adsorbent was ?-aminohexyl-bisoxyrane-agarose using HEPES 25 mM pH 6.8 and MOPS pH 7.9 buffers for IgG purification from human serum and plasma, respectively, reaching purification factor of 6.8 times and purity of over 95%. Adsorption isotherms of albumin, main impurity of the human serum and plasma, adjusted by the Langmuir model, showed a high capacity of absorption of albumin by the gels w-aminohexyl-bisoxyrane-agarose and w-aminodecyl-bisoxyrane-agarose, of 206,6 and 78,6 mg/mL of adsorbent, respectively. The absorbents w-aminohexylbisoxyrane- agarose and w-aminodecyl-bisoxyrane-agarose showed more efficient for the purification of IgG regarding the yielding (76,8 and 74,7%, respectively) and dynamic capacity (4,23 and 4,51 mg of IgG/mL of absorbent, respectively), than the control gel DEAE-agarose (51,9% of yield and 3,19 mg of IgG/mL of adsorbent). / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Renata de Oliveira Mattos-Graner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-08T06:03:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nogueira_RucheleDias_D.pdf: 12321915 bytes, checksum: 624bf1e6309c440b0fb9bf9a2ed120f8 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Streptococcus mutans (SM) são os principais patógenos da cárie dental. Neste estudo exploramos a influência do sistema imune de mucosa na infecção inicial pelo SM em crianças altamente expostas a este microrganismo. Cento e dezenove crianças, com idade inicial entre 5 a 13 meses de idade foram analisadas no início do estudo (T0) e após 6 (T6), 12 (T12) e 18 (T18) meses, amostras bucais foram coletadas para determinação dos níveis de infecção por SM, através do cultivo em mitis salivarius ágar com bacitracina. Os níveis de IgA, IgA1 e IgM foram também determinados em amostras de saliva, através de ensaios de ELISA. Um subgrupo de 21 crianças infectadas por SM (entre T0 e T6) foram pareadas a outras 21 crianças da amostra sem níveis detectáveis de SM. As reações entre anticorpos IgA da saliva com antígenos (Ags) de SM foram comparadas entre estes subgrupos, através de ensaios de western blot. A intensidade das bandas reativas foi determinada através da densitometria e expressas como unidades arbitrárias (ua). A reatividade de IgA salivar com peptídeos derivados da seqüência da GbpB, preditos como regiões ligantes à MHC de classe II, foram também avaliados através de multiplex com o Luminex. Os níveis salivares de IgA aumentaram com a idade (de 82,4 a 823,4µg/ml), enquanto que os níveis de IgM mantiveram-se baixos durante todo o estudo (média:4,2-2,8 µg/ml). Os níveis de infecção por SM foram maiores em T6 (média:45 ufc/área) e uma forte resposta de IgA aos Ags de SM pôde ser detectada logo aos 6 meses de idade. A resposta de IgA anti-GbpB foi observada em 38% das 21 crianças infectadas por SM, enquanto que 73% dos pares não infectados apresentavam estes anticorpos (Qui-quadrado, p<0.03). Um pico de resposta de IgA a GbpB ocorreu durante a fase de maior desafio de infecção (T6). Não houve diferenças significativas nos padrões de reatividade de IgA aos diversos peptídeos de GbpB testados, entre os grupos de crianças infectadas e não infectadas por SM. Os resultados indicam que uma resposta complexa de IgA a SM pode ocorrer a partir dos 6 meses e que a especificidade de resposta a Ags envolvidos na virulência podem influenciar na susceptibilidade à infecção por SM. Nenhum dos peptídeos da GbpB correspondeu às intensidades de resposta à GbpB nativa observadas entre os pares de crianças estudados / Abstract: Mutans streptococci (MS) are the main pathogens of dental caries. In this study we explored the influence of the muccosal immune system in the initial colonization by MS in children highly exposed to this microorganism. A total of 119 children, who were of 5 to 13 months of age, were enrolled in this prospective study. MS levels of infection were determined in cultures on mitis salivarius agar with bacitracin at baseline (T0), 6 (T6), 12 (T12) and 18 months (T18)-of follow-up. Saliva samples were also collected at all phases of the study for determination of the levels of antibodies IgA, IgA1 and IgM in ELISA assays. A subset of 21 MS-infected early between T0 and T6 were matched to other 21children, but who were not MS-infected. Patterns of IgA antibody reactivity to MS Ags were compared between these 21 pairs through assays of western blot. Intensities of IgAreactive bands were determined densitometrically and were expressed as arbitrary unit (au). Reactivities of salivary IgA antibodies to peptides derived from the GbpB sequence, which were predicted as having affinity to MHC of class II molecules were evaluated in multiplex with the help of the Luminex technology. Levels of antibody IgA in saliva increased with age (82.4-823.35 µg/ml), while levels of IgM remained at low levels (mean:4.2-2.78 µg/ml). The highest levels of MS infection in the infected group were observed at T6 (mean:45 cfu/plate). Robust responses to SM antigens were detected in children as early as 6 months of age. Only 38% of early-infected children carried IgA-reative GbpB while this antigen was recognized by the majority (73%) of children that were not infected by these microorganisms (chi-square, p<0.03). A peak of IgA response to GbpB occurred during the phase of highest SM infectious challenge (by T6). All the GbpB-derived peptides have shown reactivity with salivary IgA, independently of the status of MS infection. The results indicated that complex salivary IgA responses to MS Ags can occur by 6 months of age and that the patterns of salivary IgA specificities might influence in the susceptibility of initial infections to MS. Neither of the peptides tested corresponded to differences in response to the native protein observed between the pairs of children studied. / Doutorado / Microbiologia e Imunologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Loanda Carvalho S Limongi.pdf: 1004813 bytes, checksum: 09f423fef50cc45223e734df788a0c39 (MD5) Previous issue date: 2009-12-18 / Pleural tuberculosis (TBP) has often spontaneous resolution, even without treatment. However, the lack of proper diagnosis and treatment can lead to the occurrence of pulmonary and/or extra-pulmonary tuberculosis in 65% of the cases, in the five years subsequent. The objective of this study was to evaluate the effectiveness of the recombinant Hsp-X antigen (rHsp-X) in an enzyme immunoassay for determining the presence of TBP in patients with pleural effusion. For this study we used 132 samples of serum and pleural fluid (PF) from patients with pleural effusion. Of these, 97 samples were from TBP patients and 35 patients with diseases other than tuberculosis (NTBP) (28 patients with metastatic cancer, 1 patient with congestive heart failure, 2 patients whit liver failure, 1 patient with systemic lupus erythematosus and 3 patients with parapneumonic effusion). The IgM levels of PF were higher in patients with PTB than NTBP, the sensitivity and specificity of the ELISA for the PF was 42% and 83%, respectively. Testing for IgG from the serum and the PF against the recombinant antigen Hsp-X were not effective in discriminating TB patients from other diseases, the sensitivity was found to be 13% and 16% using serum and LP, respectively, with the same specificity of 83%. TBP patients presented higher levels of IgA specific for the rHSP-X than NTBP, the IgA ELISA using PF presented better sensitivity (65%) than using serum (39%), while the IgA ELISA for both types of samples presented the same specificity (83%). In conclusion, the recognition of Mycobacterium tuberculosis rHsp-X by IgA antibodies from the PF of patients with TBP reveals its possible role in the development of a diagnostic test for additional cases of TBP. Further studies must be conducted to confirm this hypothesis. / A tuberculose pleural (TBP) frequentemente tem resolução espontânea, mesmo sem tratamento. No entanto, a ausência de diagnóstico e tratamento pode levar, nos cinco anos subseqüentes, à ocorrência de tuberculose pulmonar e/ ou extrapulmonar em 65% dos casos. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da utilização do antígeno Hsp-X em um ensaio imunoenzimático para determinação da presença de TBP em indivíduos com derrame pleural. Para o estudo foram utilizadas 132 amostras de soro e líquido pleural (LP) de pacientes com derrame pleural. Destas, 97 amostras eram de pacientes TBP e 35 de pacientes com outras doenças não tuberculosas (NTBP) (28 pacientes por câncer metastático, 1 pacientes por insuficiência cardíaca congestiva, 2 paciente por insuficiência hepática, 1 paciente por lúpus eritematoso sistêmico e 3 pacientes por derrames parapneumônicos). Os níveis de IgM do LP foram mais elevados nos pacientes com TBP do que os NTBP, a sensibilidade do ELISA para do LP de 42%, para a especificidade de 83%. Os ensaios para pesquisa de IgG, do soro e do LP, contra o antígeno Hsp-X não foram eficazes em discriminar pacientes com TBP de outras doenças, a sensibilidade encontrada foi de 13% e 16%, utilizando o soro e o LP, respectivamente, para a mesma especificidade de 83%. A densidade óptica dos ensaios para pesquisa de IgA, específicos para o antígeno rHsp-X, foi mais elevada nos pacientes TBP do que os NTBP, o ELISA com a IgA do LP foi melhor que o ELISA do soro, a sensibilidade foi de 65% e 39%, respectivamente, para a mesma especificidade de 83%. Concluímos que o reconhecimento de Hsp-X recombinante de Mycobacterium tuberculosis pelos anticorpos IgA do LP de pacientes com TBP indicam que esse antígeno poderá ser utilizado para o desenvolvimento de um teste de diagnóstico complementar para casos de TBP. Estudos adicionais precisam ser realizados para confirmar tal hipótese.

Orientador: José Martins Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T18:28:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mortatti_ArnaldoLuis_D.pdf: 918873 bytes, checksum: 440db6a525f044a8293d5eae55ee837b (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A presente pesquisa examinou o efeito de 20 dias de treinamento e competição em variáveis endócrinas e da mucosa, além de ocorrências de infecção no trato respiratório superior (ITRS) ao longo do principal campeonato nacional de futebol na categoria sub- 19. Foram observados sintomas de ITRS em jovens jogadores do sexo masculino (n=12), durante o período de 20 dias em que jogaram sete partidas. Amostras de saliva foram coletadas nas manhãs dos jogos para análise de IgA e cortisol, enquanto que a escala de percepção subjetiva do esforço (PSE) foi observada ao final de cada jogo. Em comparação com o primeiro jogo, foi observado um aumento significativo de PSE nas partidas de 4 a 7 (p < 0.05). Os aumentos significativos de incidência de ITRS nos jogos 2 e 6 foram acompanhados por significativos aumentos dos níveis de IgA salivar (S-IgA). Também foram observadas correlações significativas (p < 0.05) entre a incidência de ITRS e a diminuição dos níveis de S-IgA no segundo (r = -0.60) e no sexto (r = -0.65) jogo. As concentrações de cortisol em repouso não mudaram ao longo do período experimental (p > 0.05). Os resultados do estudo sugerem que a diminuição da concentração salivar de IgA pode afetar a imunidade da mucosa, levando a uma maior incidência de ITRS. Tudo indica que o estresse fisiológico e psicológico impostos pela competição e pelo treinamento em um curto período de tempo são os fatores que mais contribuem para essas respostas. Dadas essas descobertas, o monitoramento de IgA salivar em repouso poderia ser um instrumento útil para prever as ocorrências de ITRS em jovens atletas em competições de curta duração / Abstract: The present study examined the effect of 20 days of training and competition, across the main under-19 Brazilian soccer championship, on mucosal and hormonal variables, as well as in upper respiratory tract infection (URTI) occurrences. Young male soccer players (n = 12) were observed for symptoms of URTI across a 20 day period in which seven competitive matches were played. Saliva samples were collected in the morning of each match and analyzed for IgA and cortisol. Ratings of perceived exertion after each match were also obtained. Compared to match 1, a significant increase in match RPE was observed in matches 4 to 7 (p < 0.05). The significant increases in URTI incidence at matches 2 and 6 were accompanied by significant decreases in salivary IgA (S-IgA) levels. Significant (p < 0.05) correlations were also seen between URTI incidence and the decrease in S-IgA levels in match 2 (r = 0.60) and match 6 (r = 0.65). Resting cortisol concentrations did not change across the experimental period (p > 0.05). The results of the present study suggest that decrements in salivary IgA concentration can affect mucosal immunity leading to greater incidence of UTRI. It seems that both the physiological and psychological stressors imposed by competition and training in the short timeframe are major contributing factors to these responses. Given these findings, the monitoring of resting salivary IgA would appear a useful approach for predicting URTI occurrences in young athletes during short-term competitions / Doutorado / Saude da Criança e do Adolescente / Doutor em Ciências da Saúde

Orientador: Sônia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T20:07:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pavan_GiseleLuiza_M.pdf: 8113456 bytes, checksum: 17ffd6547356e32bd63a48ccb9192979 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Imunoglobulinas são anticorpos secretados por células imunitárias em resposta a introdução de um antígeno. A imunoglobulina G (IgG) de origem humana, com alto grau de pureza, tem sido empregada como prescrição terapêutica para inúmeros casos de doenças malignas, infecciosas, auto-imunes e inflamatórias. Normalmente, a IgG é purificada através da precipitação com etanol seguida de cromatografia de afinidade com proteína A ou G imobilizada, no entanto, por apresentar alto custo, se faz necessário o desenvolvimento de técnicas de afinidade alternativas. Membranas, nas quais podem ser imobilizados os ligantes de afinidade, tornam-se uma alternativa aos géis tradicionais apresentando maior capacidade hidrodinâmica. Neste contexto, estudou-se o efeito da remoção do sal em diferentes sistemas tamponantes na purificação de IgG a partir do soro humano por cromatografia de afinidade com íons imobilizados (IMAC), para o módulo de membranas de fibras ocas de PEVA-CM-Asp- Me2+, para os íons metálicos níquel e cobalto. De acordo com eletroforeses SDS-PAGE e análises de nefelometria das frações dos picos de proteína obtidos, a melhor condição utilizada para a purificação de IgG para os adsorventes PEVA-CM-Asp-Ni2+ e PEVA-CM-Asp-Co2+, foi em presença do sistema tamponante fosfato de sódio 25 mmol L-1 e imidazol 2 mmol L-1 a pH 7,0 utilizando o aumento da concentração de imidazol como estratégia de eluição, alcançando pureza superior a 93% para ambos íons metálicos. Determinada a melhor condição de purificação, por meio das isotermas de adsorção, foi determinada a capacidade máxima de adsorção e a constante de dissociação dos complexos CM-Asp-Ni2+-IgG e CM-Asp-Co2+-IgG que, de acordo com o ajuste dos parâmetros pelo modelo de Langmuir e Langmuir-Freundlich, demonstraram boa capacidade de adsorção e constantes de dissociação características de sistemas utilizando ligantes pseudobioespecíficos. Para as filtrações em módulo de fibras ocas, construído em nosso laboratório, determinaram-se as curvas de ruptura, sendo que os resultados obtidos para as membranas finamente cortadas foram melhores que os obtidos para os de filtração em módulo de fibras ocas / Abstract: Immunoglobulins are secreted by immune cells in response to the introduction of an antigen. Immunoglobulin G (IgG) obtained from human sources with high purity has been used as therapeutic prescription for many cases of malicious, infectious, autoimmune and inflammatory diseases. Typically, IgG is purified by precipitation with ethanol followed by affinity chromatography with immobilized protein A or G, however, due to its high cost, it is necessary to develop alternative techniques based on affinity. Affinity membranes, which may be immobilized on the affinity ligands, show a higher hydrodynamic capacity than typical gels. In this context, the effect of salt was studied in different buffer systems in the purification of IgG from human serum by Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography (IMAC) for the module PEVA-CM-Asp-Me2+ using ions Ni2+ and Co2+. According to SDS-PAGE and nephelometric analysis fractions of protein peaks obtained, the best condition used for purification of IgG to the adsorbents PEVA-CM-Asp-Ni2+ and PEVA-CM-Asp-Co2+ was in the presence of sodium phosphate buffer system 25 mmol L-1 and 2 mmol L-1 imidazole at pH 7.0 using increasing concentration of imidazole as elution strategy, achieving a purity higher than 93% for both metal ions. The maximum adsorption capacity and dissociation constant of complexes CM-Asp-Ni2+-IgG and CM-Asp-Co2+-IgG by adsorption isotherms were determined on the best condition of purification and the adjustment of parameters by the Langmuir and Langmuir-Freundlich models, it demonstrated good adsorption capacity and dissociation constants characteristics of systems using pseudobioespecific ligands. For filtration in hollow fiber module, constructed in our laboratory, breakthrough curves were determined; also for the best condition of purification, and the results for finely chopped membranes were better than those obtained for the filtration module and hollow fibers / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-27T12:23:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carmignotto_GabrielaPannunzio_M.pdf: 6143089 bytes, checksum: aa61b4762764a38220fc51226e410a80 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os fragmentos Fab de imunoglobulina G são utilizados principalmente em testes diagnósticos e terapias. Por apresentarem tamanho reduzido, os fragmentos Fab possuem maior facilidade de penetração em tecidos e maior velocidade de circulação no plasma quando comparados à IgG intacta. A purificação dos fragmentos Fab é realizada geralmente por cromatografia de afinidade utilizando os ligantes bioespecíficos proteína A, proteína G e proteína L. Entretanto, esses ligantes apresentam algumas desvantagens, entre elas seu elevado custo e a necessidade de eluição em condições drásticas. Como alternativa, muitos estudos têm sido realizados empregando ligantes pseudobioespecíficos e de interação mista visando o desenvolvimento de novas estratégias que proporcionem a purificação dos fragmentos Fab. Neste contexto, este trabalho tem por objetivo avaliar a seletividade das poliaminas ?-aminohexil e poli(etilenoimina) imobilizadas em gel de agarose na separação de fragmentos Fab humano a partir de uma solução de IgG humana clivada enzimaticamente, empregando diferentes sistemas tamponantes. A recuperação seletiva dos fragmentos Fab foi avaliada por eletroforese SDS-PAGE, Western blot e imunodifusão radial. Os resultados indicaram que nas cromatografias realizadas em gel ?-aminohexil-agarose em Tris-HCl a pH 8,0, os fragmentos Fab foram recuperados nas frações não retidas, com valores calculados de pureza de 97% e recuperação de 100%. Nas cromatografias realizadas em gel PEI-agarose empregando o tampão Tris-HCl nos valores de pH de 7,5 e 8,0, a pureza obtida foi de 96% e a recuperação foi de 94% e 93%, respectivamente. As curvas de ruptura para os adsorventes foram determinadas e os resultados obtidos indicaram melhor recuperação do fragmento Fab com alta pureza no flowthrough para o ligante ?-aminohexil (2,7 mg) quando comparado ao ligante PEI (0,8 mg). A isoterma de adsorção de fragmentos Fc para o adsorvente ?-aminohexil-agarose foi determinada e os parâmetros capacidade de adsorção de 44,32 mg.mL-1 de gel e constante de dissociação de 1,11.10-5 mol.L-1 foram obtidos por ajuste destes parâmetros segundo o modelo de Langmuir-Freundlich. O valor de n obtido foi igual a 1,68, indicando cooperatividade positiva na adsorção dos fragmentos Fc e IgG não clivada. Os resultados mostraram que as poliaminas ?-aminohexil e PEI apresentaram potencial como ligantes para a purificação de fragmentos Fab / Abstract: Fab fragments from immunoglobulin G are considered an important tool for the therapy and diagnose of diseases. Their reduced molecular size is an advantage over the intact IgG allowing faster tissue penetration and circulation in the plasm. Fab fragments are often purified by affinity chromatography using biospecifics ligands, such as protein A, protein G, and protein L. However, the use of those ligands is hindered by their high costs and elution in drastic conditions. Several studies have been performed for the development of new techniques to improve the chromatographic purification of Fab fragment, e.g., using pseudobiospecifics or mix-mode ligands. In this context, we have evaluated the efficiencies of polyamines ?-aminohexyl and poly(ethyleneimine) (PEI) ligands immobilized in agarose gel aiming the purification of human Fab fragments. Our chromatographic studies were conducted feeding cleaved human IgG solution into the aforementioned adsorbents using different adsorption buffers and conditions. The selectivity towards Fab fragments was evaluated using SDS-PAGE, Western blot, and radial immunodiffusion. The chromatography performed with ?-aminohexyl-agarose using Tris-HCl buffer pH 8.0 recovered 100% of the Fab fragments with 97% of purity. Studies done with adsorbent PEI-agarose using Tris-HCl pH 7.5 and 8.0 as adsorption buffers recovered 94% and 93% of Fab fragments, respectively, with 97% of purity. Breakthrough curves experiments showed that the ?-aminohexyl ligand was superior than PEI ligand in terms of recovering Fab fragment with high purity in flowthrough (2.7 mg against 0.8 mg, respectively). The adsorption isotherm of ?-aminohexil-agarose adsorbent was determined adjusted by the Langmuir-Freundlich model as well (Qm: 44.32 mg.mL-1 of gel; Kd: 1.11.10-5 mol.L-1). Additionally, Fc fragments and IgG binding showed positive cooperativity (n=1.68). All these results indicate that ?-aminohexyl and PEI polyamines are potential ligands for the purification of Fab fragments and can possibly improve the existing techniques employed for this purpose / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestra em Engenharia Química

Objetivos: Determinar a reatividade dos soros e determinação dos isotipos IgG e IgE a proteínas de sementes da dieta de crianças com alergia ao leite de vaca IgE mediada. Métodos: Foram avaliados soros de três grupos de crianças: alérgicas ao leite de vaca IgE mediada, crianças tolerantes ao leite e um grupo controle com crianças não atópicas. Foram usados extratos protéicos de diferentes tipos de sementes utilizando o teste de ELISA para análise da reatividade dos isotipos IgG e IgE. Resultados: Comparando as concentrações séricas de IgG dos diferentes grupos, observou-se concentrações mais elevadas e estatisticamente significante no grupo alérgico em relação aos grupos tolerante e controle, exceto para as sementes de soja e feijão roxinho. Em relação ao isotipo IgE observou-se os mesmos padrões de reatividade mostradas nas analises para IgG, com diferença significante do grupo alérgico em relação ao controle, exceto para milho. Observou-se que para a soja houve grande dispersão das concentrações séricas tanto no grupo alérgico quanto no tolerante, em valores superiores ao do grupo controle. Conclusão: A comparação entre os diversos grupos avaliados mostra que pacientes alérgicos ao leite e os tolerantes apresentam concentrações mais elevadas de IgG e IgE a outros alimentos que as crianças do grupo controle, o que pode sugerir possível alteração de permeabilidade da mucosa intestinal nestes grupos, mesmo na ausência de sintomatologia gastrintestinal / Objective: To determine the reactivity of serum and determination of IgG and IgE isotypes to seed proteins included in the diet of children with cow\'s milk allergy IgE mediated. Methods: We evaluated sera from three groups of children: cow\'s milk allergic patients, tolerant children and a control group with non-atopic children. It was used protein extracts from different types of seeds using an ELISA assay to analyze the reactivity of IgG and IgE isotypes. Results: Comparing the IgG serum from different groups, it was observed higher concentrations and statistically significant in the allergic group compared to the tolerant and control groups, except for soybeans and kidney beans. To the IgE isotype it was observed the same patterns of reactivity shown in the analysis for IgG, with significant difference in the allergic group compared to control, except for corn. It was observed that for soybeans there were values of serum, both in the allergic and tolerant group higher than in the control group. Conclusion: Our study showed that the allergic and tolerant groups of CMA patients presented higher IgG and IgE concentrations to many seeds than the control group. These findings may suggest possible changes in permeability intestinal mucosa in these groups

Objetivos: Determinar a reatividade dos soros e determinação dos isotipos IgG e IgE a proteínas de sementes da dieta de crianças com alergia ao leite de vaca IgE mediada. Métodos: Foram avaliados soros de três grupos de crianças: alérgicas ao leite de vaca IgE mediada, crianças tolerantes ao leite e um grupo controle com crianças não atópicas. Foram usados extratos protéicos de diferentes tipos de sementes utilizando o teste de ELISA para análise da reatividade dos isotipos IgG e IgE. Resultados: Comparando as concentrações séricas de IgG dos diferentes grupos, observou-se concentrações mais elevadas e estatisticamente significante no grupo alérgico em relação aos grupos tolerante e controle, exceto para as sementes de soja e feijão roxinho. Em relação ao isotipo IgE observou-se os mesmos padrões de reatividade mostradas nas analises para IgG, com diferença significante do grupo alérgico em relação ao controle, exceto para milho. Observou-se que para a soja houve grande dispersão das concentrações séricas tanto no grupo alérgico quanto no tolerante, em valores superiores ao do grupo controle. Conclusão: A comparação entre os diversos grupos avaliados mostra que pacientes alérgicos ao leite e os tolerantes apresentam concentrações mais elevadas de IgG e IgE a outros alimentos que as crianças do grupo controle, o que pode sugerir possível alteração de permeabilidade da mucosa intestinal nestes grupos, mesmo na ausência de sintomatologia gastrintestinal / Objective: To determine the reactivity of serum and determination of IgG and IgE isotypes to seed proteins included in the diet of children with cow\'s milk allergy IgE mediated. Methods: We evaluated sera from three groups of children: cow\'s milk allergic patients, tolerant children and a control group with non-atopic children. It was used protein extracts from different types of seeds using an ELISA assay to analyze the reactivity of IgG and IgE isotypes. Results: Comparing the IgG serum from different groups, it was observed higher concentrations and statistically significant in the allergic group compared to the tolerant and control groups, except for soybeans and kidney beans. To the IgE isotype it was observed the same patterns of reactivity shown in the analysis for IgG, with significant difference in the allergic group compared to control, except for corn. It was observed that for soybeans there were values of serum, both in the allergic and tolerant group higher than in the control group. Conclusion: Our study showed that the allergic and tolerant groups of CMA patients presented higher IgG and IgE concentrations to many seeds than the control group. These findings may suggest possible changes in permeability intestinal mucosa in these groups

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:51:05Z : No. of bitstreams: 1 rocha_tg_me_jabo.pdf: 837046 bytes, checksum: f72346486eb135d1df17c2bfd41fd6ee (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo do estudo foi avaliar a transferência de imunidade passiva (TIP) de vacas Canchim aos seus bezerros. Um grupo experimental foi constituído por 13 vacas primíparas e seus bezerros, e o outro por 13 vacas pluríparas e seus bezerros. Foram coletadas amostras de sangue venoso dos bezerros e secreções lácteas das vacas até 1 hora e 1, 2, 7, 15 e 30 dias após o nascimento/parto. No hemograma, notaram-se alterações características do período neonatal, como redução na contagem de hemácias, teor de hemoglobina e volume globular após a ingestão do colostro, além de aumento na contagem de linfócitos e redução da contagem de neutrófilos segmentados. Os exames bioquímicos séricos revelaram aumento nas atividades de GGT (até 3.746 U/L) e ALP (até 1.030 U/L) e nos teores de proteína total (até 7,77 g/dL), globulinas (até 6,01 g/dL), IgA (até 322 mg/dL) e IgG (até 2.918 mg/dL) após a ingestão do colostro, seguidos por redução gradual nestes parâmetros até os 30 dias de idade. As avaliações bioquímicas das secreções lácteas revelaram alta concentração de todos os componentes colostrais analisados, com redução gradual nos seus teores no decorrer do período experimental, à exceção dos minerais, cujas concentrações oscilaram pouco entre os momentos. A TIP foi eficiente em ambos os grupos de bezerros, e a qualidade das secreções lácteas, embora diferentes entre vacas primíparas e pluríparas, não interferiu na passagem de imunoglobulinas da vaca para o bezerro. / The aim of this study was to evaluate the passive immunity transfer from Canchim cows to its calves. One experimental group comprised 13 primiparous cows and its calves and the other group, 13 multiparous cows and its calves. Samples of calves’ venous blood and cow`s lacteal secretions were collected until 1 hour and 1, 2, 7, 15 and 30 days after birth/parturition. In the hemogram, characteristic alterations of this period, such as reduction in the erytocyte count, hemoglobin concentration and corpuscular volume after colostrum intake and rise in the lymphocyte count and reduction in the neutrophil count were noticed. The serum biochemistry revealed augmentation in the GGT (up to 3,746 U/L) and ALP (up to 1,030 U/L) activities and in the total protein (up to 7.77 g/dL), globulin (up to 6.01 g/dL), IgA (up to 322 mg/dL) and IgG (up to 2,918 mg/dL) concentrations after colostrum intake, followed by a gradual reduction in these parameters until 30 days of age. The biochemical evaluation of the lacteal secretions revealed high concentrations of all the colostral components analysed, with gradual reduction in their concentrations along the experimental period, except for the minerals, which showed little oscillation between the moments. The passive immunity transfer was efficient in both groups of calves, and the quality of the lacteal secretions, although different between primiparous and multiparous cows, did not interfere in the transference of immunoglobulins from the cows to the calves.

Made available in DSpace on 2011-05-04T12:36:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Considerando a carga e gravidade da Síndrome da Rubéola Congênita (SRC), uma campanha nacional de vacinação de mulheres com idade entre 12 e 39 anos foi realizada no Brasil em 2001-2002 com a meta de imunizar mais de 30 milhões de mulheres. A possibilidade de vacinar mulheres grávidas motivou a iniciativa de acompanhar gestantes vacinadas inadvertidamente (GVI) contra rubéola. Os objetivos do estudo foram descrever o estado imunológico das mulheres, detectar infecção congênita pelo vírus vacinal (ICR) e estimar o risco de SRC e ICR associado ao vírus vacinal. Realizou-se um estudo prospectivo não controlado no qual as taxas de SRC e ICR vacinais foram comparadas a dados históricos. O estudo foi conduzido em 7 Estados:Rio de Janeiro, São Paulo, Pernambuco, Minas Gerais, Bahia, Rio Grande do Sul e Goiás. Métodos laboratoriais incluíram teste sorológico rubéola-específico para IgM e IgG, PCR para detecção viral e seqüenciamento genômico para diferenciação viral. Uma GVI suscetível foi definida como aquela testada para rubéola até 30 dias após a vacinação e apresentou IgM positivo e IgG negativo. SRC associada à vacinação foi definida pela presença dos critérios da Organização Mundial da Saúde para a SRC em recém-nascidos de GVI suscetível, apresentando IgG+ e com vírus vacinal identificado. De um total de 16.435.776 mulheres vacinadas, 20.395 estavam grávidas no momento da vacinação. Destas, 2.330 (11,4 por cento) foram consideradas suscetíveis à rubéola. No acompanhamento de 1.797 recém-nascidos foram identificados 63 (3,5 por cento) IgM positivos configurando ICR. Os resultados das 2230 gestações em 5 Estados incluíram 80 (3,4 por cento) abortos e 11 (0,5 por cento) natimortos. Dados clínicos de 47 dos 63 casos de IRC mostraram 5 recém-nascidos com baixo peso, 4 prematuros, 1 comunicação inter-atrial e 1 sopro cardíaco aos 35 dias de vida, os quais não são compatíveis com SRC. A taxa de ICR foi de 3,5 por cento e nenhum caso de SRC foi detectado. Nossos dados reforçam as recomendações de (1) manter a contra-indicação de vacinação na gravidez e (2) não interromper a gravidez em caso de vacinação inadvertida. / Considering the burden and severity of Congenital Rubella Syndrome (CRS), a countrywide vaccination campaign was conducted in Brazil in 2001 and 2002 with the goal of immunizing over 30 million women aged 12 to 39 years. The possibility of vaccinating women unaware of their pregnancy prompted an initiative to identify and follow-up pregnant women inadvertently vaccinated (PWIV) against rubella. The objectives of this study were: to describe the immunological status of these women and ascertain vaccine virus infection in neonates born to women susceptible to rubella infection at the time of vaccination, and to estimate the risk of Congenital Rubella Infection (CRI) and CRS in neonates associated with the vaccine virus. This was a prospective uncontrolled study, in which rates of CRI and CRS due to the vaccine were compared with data from historic control group. The study was conducted in seven states of the country: Rio de Janeiro, São Paulo, Pernambuco, Minas Gerais, Bahia, Rio Grande do Sul, and Goiás. Laboratory methods included serum enzyme immune assay (EIA) for rubella IgM and IgG detection, PCR for viral detection and genomic sequencing for viral differentiation. A susceptible PWIV was defined as one tested for rubella within 30 days after vaccination and presented positive IgM and negative IgG. CRI associated with vaccination was defined as a newborn to a susceptible PWIV presenting with positive rubella IgM and having the vaccine virus identified but without CRS syndrome. CRS associated with vaccination was defined as a newborn to a susceptible PWIV who fulfilled the WHO criteria for CRS syndrome, presenting with positive rubella IgM and having the vaccine virus identified. From a total of 16,435,776 women, 20,395 were pregnant at the time of vaccination. Among these, 2,330 (11.4%) were considered susceptible at vaccination. The follow-up of 1,797 (77.1%) newborns disclosed 63 (3.5%) IgM positive, which was considered vaccine-associated CRI. Outcomes of 2,230 pregnancies in 5 states include 80 abortions (3.4%), and 11 stillborns (0.5%). Clinical data from 47 of the 63 CRI cases (75%) disclosed: 5 low birth weight, 4 preterm, 1 inter-atrium communication, and 1 cardiac murmur at 35 days of life, which are not compatible with CRS definitions. The rate of CRI was 3.5% and no CRS cases were detected. Our data support the recommendation (1) that pregnancy should remain a contraindication to vaccination and precautions should be taken to avoid vaccination within 28 days of vaccination; and (2) that in case vaccination occurs within 28 days of pregnancy, interruption of pregnancy should not be conducted.