Follicular antral oxygen tension is thought to influence subsequent oocyte developmental competence. Despite this, in vitro maturation (IVM) is routinely performed in either 5 or 20% oxygen and while low oxygen has been shown to be beneficial to embryo development in many species, the effects of altering oxygen concentration during IVM have not been adequately investigated. Here we investigated the effects of a range of oxygen concentrations (2, 5, 10 & 20% oxygen) during IVM of mouse oocytes on a range of oocyte and embryonic parameters as well as fetal/placental outcome measures and cumulus cell gene expression. While common short term measures of oocyte developmental competence such as maturation, fertilisation, and embryonic development rates were not affected over the range of oxygen levels used, more in depth investigations found several striking differences. Following IVM at 5% oxygen, the oocyte mitochondria were found to have altered patterns of both membrane potential (a measure of mitochondrial activity) and distribution suggesting altered oocyte metabolism. Following IVF, the cellular make up of embryos was investigated. In blastocysts derived from low IVM oxygen (2%) there was found to be an increased number of trophectoderm cells, an increased level of apoptosis (although this was not of sufficient magnitude to account for the cell number difference) and more cells positive for both Cdx2 and Oct4 (markers of trophectoderm and inner cell mass cell types respectively) suggesting a less differentiated cell type. Furthermore, following embryo transfer, the ability of the embryos to implant or develop was not altered by IVM oxygen concentration; however, fetal and placental weights were reduced in the 5% oxygen group. Cumulus cell gene expression was also examined and was found to be altered both across IVM oxygen treatment groups and when compared to cells isolated from in vivo derived complexes. This change in gene expression elucidates some of the many ways in which oxygen concentration during IVM may be affecting the cumulus-oocyte complex (COC) and its future development. Together, this data highlights the importance of looking past common outcome measures when determining the effects of IVM culture conditions. The results of this study also suggest that while IVM oxygen concentration contributes to the perturbing nature of current IVM systems, it is only one of many constituents that require proper investigation, understanding and optimisation. / http://proxy.library.adelaide.edu.au/login?url= http://library.adelaide.edu.au/cgi-bin/Pwebrecon.cgi?BBID=1368831 / Thesis (Ph.D.) -- University of Adelaide, School of Paediatrics and Reproductive Health, 2009

Prenatal mortality in the swine ranges from 30%~40%. Little is known about genes that involve in the preovulation events that the initiation of swine oocyte development. The main objective of this study was to utilize suppression subtractive hybridization¡]SSH¡^to delineate the differential gene expression between in vitro culture mature and antral-follicle oocytes of swine development. The knowledge of genes and their accumulated mRNA is essential to better understand the mechanisms involved in the oocyte maturation and the survival of the in vitro produced embryos. Porcine ovaries obtained from the slaughterhouse were used to collect oocytes from follicle with a diameter ≥ 3 mm. After in vitro mature for two days, oocytes with first polar body were subjected to as the testers and were lysed for mRNA extraction. Pools of 26 denuded oocytes without culture were submitted to suppressive subtraction hybridization (SSH) as the drivers. Forward and reverse subtractions were performed to identify candidate genes differentially expressed between in vitro culture mature and primordial-follicle oocytes. A total of one hundred and thirty-five differential expressed plasmid clones were sequenced, and each was analyzed by BLAST programs. Of these transcripts, 40 clones were subjected to differential screening by a dot blot cDNA array. We identified three genes like zona pellucida glycoprotein (ZP1), 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase (ACS), and death associated protein 5¡]DAP 5¡^while other numerous clones remain novel. The in vivo functions of the genes remain further investigation.

The newly discovered oocyte-derived growth factor BMP15, like GDF9, is a member of the transforming growth factor-£] (TGF-£]) superfamily. To our knowledge, however, the expression and function of BMP15 in ovarian tissues has not yet been studied in the pig. We asked whether the relative abundance (RA) of BMP15 mRNA changes in oocytes and follicular cells during pre-ovulatory period or culture of cumulus-oocyte-complexs (COCs) in vitro. Denuded oocytes, cumulus cells and COCs were isolated from growing and pre-ovulatory follicles. Total RNA was extracted from the cells, and reverse transcriptase polymerase chain (RT-PCR) was carried out using specific oligo-nucleotide primers. Expansion of COCs was firstly observed at 18 h, when this period we found BMP15 mRNA expression obviously. But when we culture of denuded oocytes instead of COCs, BMP15 mRNA didn¡¦t express throughout the period. We also detected GDF9 and BMP15 mRNA in pig embryonic stage and in differentiation stage of pig stem cell. GDF9 mRNA level continued to express after fertilization, but BMP15 mRNA didn¡¦t appear. We also added BMP15 antibody against Expanding of COCs. The present results support the concept that BMP15 is a key mediator of oocyte-enabled cumulus expansion in pig.

Orientador: Eunice Oba / Banca: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga / Banca: Otavio Mitio Ohashi / Banca: Marcelo Marcondes Seneda / Banca: Mayra Elena Ortiz D'Avila Assumpção / Resumo: Pesquisadores do mundo inteiro têm investigado a função de fatores e eventos biológicos envolvidos na foliculogênese e no processo de maturação ovocitária in vitro em várias espécies, com o intuito de aprimorar tecnologias de produção e manipulação de embriões. O objetivo do presente estudo foi avaliar: a morfometria ovariana; os aspectos morfométricos e ultra-estruturais dos folículos ovarianos; os fatores que influenciam a recuperação, qualidade ovocitária e taxas de maturação nuclear in vitro; as concentrações de progesterona e insulina plasmáticas e os níveis de hormônios esteróides (estradiol e progesterona) e IGF-I no líquido folicular, em búfalas e vacas. Amostras de sangue e os ovários de 86 búfalas (33 gestantes e 53 não gestantes) e de 95 vacas (36 gestantes e 59 não gestantes) foram colhidos em abatedouros. Os ovários foram transportados ao laboratório em solução salina acrescida de penicilina e estreptomicina a 36ºC. As dimensões ovarianas foram mensuradas com o auxílio de paquímetro e balança digitais. Para a maturação ovocitária in vitro, os complexos cumulus oophorus (CCOs) foram recuperados por aspiração folicular, selecionados e cultivados em meio TCM-199 suplementado com 10% de soro fetal bovino, piruvato de sódio, FSH, LH, estradiol, cisteamina e gentamicina, por 22 a 24 horas, a uma temperatura de 38,5ºC, em atmosfera úmida com 5% de CO2 em ar. Para as técnicas de histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão foram processados 10 e 5 ovários de cada espécie, respectivamente. As concentrações de progesterona, insulina, estradiol e IGF-I nas amostras de sangue e fluido folicular foram determinadas por procedimento de radioimunoensaio, utilizando-se kits comerciais. Na análise histológica, verificou-se ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Researchers around the world have investigated the function of biological factors and events during folliculogenisis and in the process of in vitro maturation of oocytes in several species in order to improve technologies of embryo production and manipulation. The aim of the present study was to evaluate: ovarian morphometry; morphological and ultrastructural aspects of ovarian follicles; factors affecting the recovery and competence of oocytes and in vitro nuclear maturation; plasma progesterone and insulin concentrations; progesterone, estradiol and IGF-I in follicular fluid, in bubaline and bovine species. Blood samples and ovaries of 86 buffaloes (33 pregnant and 53 non pregnant) and 95 cows (36 pregnant and 59 non pregnant) were collected at slaughterhouses. The ovaries were transported to the laboratory in saline solution enriched with penicillin and streptomycin at 36ºC. The ovarian dimensions were measured using digital paquimeter and balance. For in vitro maturation process, cumulus-oocyte complexes (COCs) were recovered by follicular aspiration, selected and matured in TCM 199 supplemented with 10% fetal calf serum, sodium pyruvate, LH, FSH, estradiol, gentamicin and cysteamin. In vitro maturation was carried out at 38.5ºC under a controlled gas atmosphere of 5% CO2 in humidified air for 22-24 hours. For classical histology and transmission electron microscopy, 10 and 5 ovaries of each species respectively were processed. Progesterone, insulin, estradiol and IGF-I concentrations of blood and follicular fluid were determined by use of radioimmunoassay and commercial kits. In histological evaluation, the diameters of follicles and oocytes increased according to follicular development. Ultrastructural characterization of bubaline and bovine ovarian follicles showed a differentiated cell apparatus for substrate metabolization, ...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-05Bitstream added on 2014-06-13T19:05:29Z : No. of bitstreams: 1 leal_ls_dr_botfmvz.pdf: 1424462 bytes, checksum: bbd9bf26b7adb5dc3b7bb266434ac12a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Pesquisadores do mundo inteiro têm investigado a função de fatores e eventos biológicos envolvidos na foliculogênese e no processo de maturação ovocitária in vitro em várias espécies, com o intuito de aprimorar tecnologias de produção e manipulação de embriões. O objetivo do presente estudo foi avaliar: a morfometria ovariana; os aspectos morfométricos e ultra-estruturais dos folículos ovarianos; os fatores que influenciam a recuperação, qualidade ovocitária e taxas de maturação nuclear in vitro; as concentrações de progesterona e insulina plasmáticas e os níveis de hormônios esteróides (estradiol e progesterona) e IGF-I no líquido folicular, em búfalas e vacas. Amostras de sangue e os ovários de 86 búfalas (33 gestantes e 53 não gestantes) e de 95 vacas (36 gestantes e 59 não gestantes) foram colhidos em abatedouros. Os ovários foram transportados ao laboratório em solução salina acrescida de penicilina e estreptomicina a 36ºC. As dimensões ovarianas foram mensuradas com o auxílio de paquímetro e balança digitais. Para a maturação ovocitária in vitro, os complexos cumulus oophorus (CCOs) foram recuperados por aspiração folicular, selecionados e cultivados em meio TCM-199 suplementado com 10% de soro fetal bovino, piruvato de sódio, FSH, LH, estradiol, cisteamina e gentamicina, por 22 a 24 horas, a uma temperatura de 38,5ºC, em atmosfera úmida com 5% de CO2 em ar. Para as técnicas de histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão foram processados 10 e 5 ovários de cada espécie, respectivamente. As concentrações de progesterona, insulina, estradiol e IGF-I nas amostras de sangue e fluido folicular foram determinadas por procedimento de radioimunoensaio, utilizando-se kits comerciais. Na análise histológica, verificou-se... / Researchers around the world have investigated the function of biological factors and events during folliculogenisis and in the process of in vitro maturation of oocytes in several species in order to improve technologies of embryo production and manipulation. The aim of the present study was to evaluate: ovarian morphometry; morphological and ultrastructural aspects of ovarian follicles; factors affecting the recovery and competence of oocytes and in vitro nuclear maturation; plasma progesterone and insulin concentrations; progesterone, estradiol and IGF-I in follicular fluid, in bubaline and bovine species. Blood samples and ovaries of 86 buffaloes (33 pregnant and 53 non pregnant) and 95 cows (36 pregnant and 59 non pregnant) were collected at slaughterhouses. The ovaries were transported to the laboratory in saline solution enriched with penicillin and streptomycin at 36ºC. The ovarian dimensions were measured using digital paquimeter and balance. For in vitro maturation process, cumulus-oocyte complexes (COCs) were recovered by follicular aspiration, selected and matured in TCM 199 supplemented with 10% fetal calf serum, sodium pyruvate, LH, FSH, estradiol, gentamicin and cysteamin. In vitro maturation was carried out at 38.5ºC under a controlled gas atmosphere of 5% CO2 in humidified air for 22-24 hours. For classical histology and transmission electron microscopy, 10 and 5 ovaries of each species respectively were processed. Progesterone, insulin, estradiol and IGF-I concentrations of blood and follicular fluid were determined by use of radioimmunoassay and commercial kits. In histological evaluation, the diameters of follicles and oocytes increased according to follicular development. Ultrastructural characterization of bubaline and bovine ovarian follicles showed a differentiated cell apparatus for substrate metabolization, ...(Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Naiara Zoccal Saraiva / Banca: César Roberto Esper / Banca: Simone Cristina Méo Niciura / Resumo: Este estudo objetivou avaliar a influência do fluido folicular (FF) e da proteína recombinante humana GDF9 adicionados ao meio de maturação sobre a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro. Foram realizados três experimentos utilizando o meio TCM199 como meio básico de maturação. No primeiro experimento, os oócitos foram maturados em cinco diferentes meios (0%, 25%, 50%, 75% ou 100% de FF) em quatro tempos de maturação (22, 24, 26 ou 28 h). No segundo experimento, os oócitos foram maturados nos mesmos meios utilizados no primeiro experimento e fecundados em três diferentes tempos (24, 26 ou 28 h). No terceiro experimento, foram utilizados dois meios: controle (sem FF) ou com 25% de FF e quatro níveis de suplementação (0, 25, 100 ou 200 ng/mL) com GDF9. O FF promoveu retardo da progressão meiótica, afetando a maturação nuclear e a migração de grânulos corticais para a periferia dos oócitos. O FF em altas concentrações influenciou negativamente as taxas de clivagem e de blastocisto. O GDF9, com (25%) ou sem FF, não influenciou as taxas de clivagem e de blastocisto, no entanto, interferiu positivamente sobre o percentual de embriões considerados superiores. O percentual mais elevado (82,22%) de embriões classificados como superiores foi obtido com o uso de 200 ng de GDF9 em meio de maturação acrescido de 25% de FF. Em conclusão, a adição do fluido folicular (75% e 100%) ao meio de maturação in vitro retarda a progressão meiótica, sincronizando a maturação nuclear com a citoplasmática e a suplementação do meio de maturação com proteína recombinante humana GDF9 melhora a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro, baseando-se na avaliação da proporção do número de células da massa celular interna (MCI) em relação ao número total de células / Abstract: This study aimed to evaluate the effects of follicular fluid (FF) and recombinant human GDF9 added to the maturation media on the quality of in vitro produced bovine embryos. Three experiments using TCM199 medium as basic maturation media were performed. In the first experiment oocytes were matured in five different media (0%, 25%, 50%, 75% or 100% of FF) during four maturation times (22, 24, 26 or 28 h). In the second experiment, the oocytes were matured in the same five media used in the first experiment and fertilized at three different times (24, 26 or 28 h). In the third experiment were used two media: control (without FF) or with 25% FF combined with four levels of supplementation (0, 25, 100 or 200ng/mL) with GDF9. The FF promoted delay of the meiotic progression, affecting nuclear maturation and cortical granules migration to the oocyte periphery. In addition FF influenced the cleavage and blastocyst rates. GDF9, without or added to FF did not affect the cleavage and blastocyst rates, however, a positive influence on the percentage of embryos considered superior was observed. The highest percentage (82.22%) of embryos considered superior was obtained with maturation media added with 25% of FF and supplemented with 200 ng of GDF9. In conclusion, addition follicular fluid (75% and 100%) to the in vitro maturation media delays meiotic progression, synchronizing nuclear to cytoplasmic maturation, and supplementation of maturation media with recombinant human GDF9 improves the quality of bovine embryos in vitro produced, based on inner cell mass cells (ICM) proportion, relative to the total cell number / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-30Bitstream added on 2014-06-13T20:38:41Z : No. of bitstreams: 1 cruz_mhc_me_jabo.pdf: 449643 bytes, checksum: 0e9dfaf9ccce6d16d2b674ee50050873 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este estudo objetivou avaliar a influência do fluido folicular (FF) e da proteína recombinante humana GDF9 adicionados ao meio de maturação sobre a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro. Foram realizados três experimentos utilizando o meio TCM199 como meio básico de maturação. No primeiro experimento, os oócitos foram maturados em cinco diferentes meios (0%, 25%, 50%, 75% ou 100% de FF) em quatro tempos de maturação (22, 24, 26 ou 28 h). No segundo experimento, os oócitos foram maturados nos mesmos meios utilizados no primeiro experimento e fecundados em três diferentes tempos (24, 26 ou 28 h). No terceiro experimento, foram utilizados dois meios: controle (sem FF) ou com 25% de FF e quatro níveis de suplementação (0, 25, 100 ou 200 ng/mL) com GDF9. O FF promoveu retardo da progressão meiótica, afetando a maturação nuclear e a migração de grânulos corticais para a periferia dos oócitos. O FF em altas concentrações influenciou negativamente as taxas de clivagem e de blastocisto. O GDF9, com (25%) ou sem FF, não influenciou as taxas de clivagem e de blastocisto, no entanto, interferiu positivamente sobre o percentual de embriões considerados superiores. O percentual mais elevado (82,22%) de embriões classificados como superiores foi obtido com o uso de 200 ng de GDF9 em meio de maturação acrescido de 25% de FF. Em conclusão, a adição do fluido folicular (75% e 100%) ao meio de maturação in vitro retarda a progressão meiótica, sincronizando a maturação nuclear com a citoplasmática e a suplementação do meio de maturação com proteína recombinante humana GDF9 melhora a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro, baseando-se na avaliação da proporção do número de células da massa celular interna (MCI) em relação ao número total de células / This study aimed to evaluate the effects of follicular fluid (FF) and recombinant human GDF9 added to the maturation media on the quality of in vitro produced bovine embryos. Three experiments using TCM199 medium as basic maturation media were performed. In the first experiment oocytes were matured in five different media (0%, 25%, 50%, 75% or 100% of FF) during four maturation times (22, 24, 26 or 28 h). In the second experiment, the oocytes were matured in the same five media used in the first experiment and fertilized at three different times (24, 26 or 28 h). In the third experiment were used two media: control (without FF) or with 25% FF combined with four levels of supplementation (0, 25, 100 or 200ng/mL) with GDF9. The FF promoted delay of the meiotic progression, affecting nuclear maturation and cortical granules migration to the oocyte periphery. In addition FF influenced the cleavage and blastocyst rates. GDF9, without or added to FF did not affect the cleavage and blastocyst rates, however, a positive influence on the percentage of embryos considered superior was observed. The highest percentage (82.22%) of embryos considered superior was obtained with maturation media added with 25% of FF and supplemented with 200 ng of GDF9. In conclusion, addition follicular fluid (75% and 100%) to the in vitro maturation media delays meiotic progression, synchronizing nuclear to cytoplasmic maturation, and supplementation of maturation media with recombinant human GDF9 improves the quality of bovine embryos in vitro produced, based on inner cell mass cells (ICM) proportion, relative to the total cell number

Submitted by Giovana Barros Nunes (giovanabnunes@hotmail.com) on 2018-04-12T15:28:06Z No. of bitstreams: 1 GBN VERSÃO FINAL DISSERTAÇÃO P IMPRESSÃO.pdf: 1111649 bytes, checksum: f77c4c688d28fc8ca13182c8832085f8 (MD5) / Rejected by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: No arquivo submetido ao repositório deve estar inserido o certificado de aprovação (documento obrigatório). A informação sobre a lombada não precisa conter no arquivo pdf inserido. Favor inserir o certificado de aprovação e submeter novamente a sua dissertação no repositório. Agradecemos a compreensão on 2018-04-13T11:25:20Z (GMT) / Submitted by Giovana Barros Nunes (giovanabnunes@hotmail.com) on 2018-04-13T14:08:12Z No. of bitstreams: 1 Dissertação GIOVANA BARROS NUNES VERSÃO DEFINITIVA Repositório.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-04-13T17:17:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nunes_gb_me_jabo.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-13T17:17:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nunes_gb_me_jabo.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito do precursor do peptídeo natriurético tipo C (NPPC) durante o cultivo de pré-maturação in vitro (pré-MIV) de oócitos bovinos sobre: 1) a progressão da maturação nuclear; 2) a expressão gênica das células do cumulus e 3) a aquisição da competência do oócito para o desenvolvimento embrionário in vitro. Os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram pré-MIV com 100 nM NPPC por 8 horas (grupo NPPC) e, ao final do período, foram lavados para completa remoção do NPPC e submetidos à MIV por 22h. Após 8h de pré-MIV e após 8h de pré-MIV seguidas de 22h de MIV (duração total do cultivo = 30h) foram avaliadas a progressão da maturação nuclear e a expressão relativa de mRNA nas células do cumulus. O grupo controle (C) foi maturado na ausência de NPPC por até 30h, e as mesmas avaliações anteriores foram realizadas imediatamente após a remoção do ambiente folicular (C0), após 8h de cultivo (C8), após 22h de cultivo (C22) e após 30h de cultivo (C30). Em outro experimento, cujos tratamentos foram idênticos aos supramencionados, os oócitos foram fecundados ao término da MIV e foi avaliado o desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos. Após 8h de cultivo de pré-MIV, a análise da progressão da meiose demonstrou que o grupo C0 apresentou 58,9% de estruturas com configuração de GV1, enquanto que o grupo C8 apresentou apenas 13,9% de estruturas nesta configuração (P<0,05). A proporção de GV1 no grupo NPPC foi semelhante a ambos estes grupos (22,8%; P>0,05). Por outro lado, o grupo C8 apresentou maior taxa de GV3 em relação ao C0 (53,1% vs. 3,62%; P<0,05), sem diferenças com o grupo NPPC (38,7%; P>0,05). Ao final do cultivo de MIV, não foi observada diferença entre os grupos (C22 vs. NPPC vs. C30) com relação à maturação nuclear, todavia, houve maior taxa de oócitos degenerados no C30 em comparação com C22 (11,4% vs. 2,8%; P<0,05). A análise da expressão relativa de genes das células do cumulus após 8h de pré-MIV com NPPC evidenciou aumento (P<0,05) na expressão de genes relacionados à expansão destas células (GREM1, PTGS2/COX2, PTX3, TNFAIP6 e VCAN), à maturação oocitária (BDNF, EGFR, NOS3, PDE5A, PRKCD e STAT3) e ao desenvolvimento embrionário (IGF1R, KRT8 e LUM). Ao final do cultivo de MIV, observou-se no grupo NPPC que o gene PTX3, relacionado à expansão das células do cumulus, além dos genes AREG e BDNF, relacionados à maturação oocitária, e o gene LUM, relacionado ao desenvolvimento embrionário estavam mais expressos em comparação com o grupo C30 (P<0,05). Com relação ao desenvolvimento embrionário, os grupos experimentais não apresentaram diferença (P>0,05) quanto à taxa de clivagem (média de 73,22%). Embora o grupo NPPC não tenha diferido (P>0,05) de C22 e C30 quanto à taxa de blastocistos, houve diferença entre C22 e C30 (69,3 vs. 37,4; P<0,05). Todavia, não houve diferença entre os grupos com relação ao número de células totais (blastômeros) e apoptóticas (P>0,05). Em conclusão, o cultivo de pré-MIV de oócitos bovinos por 8h com 100nM NPPC não bloqueou a retomada da meiose, mas a progressão da meiose ocorreu de forma mais lenta e impediu o envelhecimento e degeneração dos oócitos. O cultivo de oócitos por tempo prolongado (30h) na ausência de NPPC foi prejudicial para o desenvolvimento embrionário, mas o tratamento com NPPC (8h pré-MIV+22h MIV = duração total de 30h) reverteu parcialmente este índice. / The aim of this study was to evaluate the effect of the C-type natriuretic peptide precursor (NPPC) during pre in vitro maturation culture (pre-IVM) of bovine oocytes on: 1) nuclear maturation progress; 2) gene expression in cumulus cells and 3) acquisition of competence for in vitro embryo development. Cumulus oocyte complexes (COCs) were pre-IVM with 100 nM NPPC for 8 hours (NPPC group) and then were washed for the complete removal of NPPC and submitted to IVM for 22h. After 8h pre-IVM followed by 22h IVM (total culture time = 30h) oocytes were evaluated for nuclear maturation progress and cumulus cells for relative mRNA expression. Control group (C) was IVM in the absence of NPPC for up to 30h and the same evaluations were made immediately after follicle removal (C0) and after 8h (C8), 22h (C22) and after 30h of culture (C30). In another experiment with the same treatment, the oocytes were fertilized at the end of IVM and embryo development to the blastocyst stage was evaluated. After 8 hours of pre-IVM culture, meiosis progression analysis showed 58.9% of oocytes in GV1 configuration in C0, while C8 had only 13.9% (P<0.05). The GV1 rates in NPPC did not differ from any group (22.8%; P>0.05). On the other hand, C8 showed higher rates of GV3 in comparison with C0 (53.1% vs. 3.62%; p<0.05) and no differences compared to NPPC (38.7%; P<0.05). At the end of IVM culture, no differences between groups (C22 vs. NPPC vs. C30) were observed in nuclear maturation, however, higher rates of degenerated oocytes were observed in C30 in comparison with C22 (11.4% vs. 2.8%; P<0.05). The relative gene expression analysis in cumulus cells after 8h pre-IVM with NPPC showed an up-regulation in genes related to cumulus cells expansion (GREM1, PTGS2/COX2, PTX3, TNFAIP6 and VCAN), oocyte maturation (BDNF, EGFR, NOS3, PDE5A, PRKCD e STAT3) and embryo development (IGF1R, KRT8 and LUM). At the end of IVM culture, the cumulus cells expansion related gene, PTX3, the oocyte maturation genes, AREG and BDNF, and the embryo development gene, LUM, were up-regulated in NPPC in comparison with C30 (p<0.05). Regarding embryo development, the cleavage rates did not differ in experimental groups (mean around 73,22%). Besides, blastocyst rates did not differ between NPPC (P>0.05) and the other groups, but there was a difference between C22 and C30 (69.3 vs. 37.4%; P<0.05). There was no difference between the groups in total cell number (blastomeres) and apoptotic cells (P<0.05). In conclusion, the pre-IVM culture of bovine oocytes for 8h with 100nM NPPC did not block meiosis resumption, but meiosis progression occurred more slowly and prevented aging and degeneration of the oocytes. The prolonged time of oocyte culture (30h) in the absence of NPPC was detrimental to embryo development, but NPPC treatment (8h pre-IVM + 22h IVM = total duration of 30h) partially reversed this effect.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico encontrado em diversos tipos celulares como células endoteliais, neurônios e macrófagos. A síntese do NO é realizada pela ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS). Um dos mecanismos de ação do NO é dado pela ativação da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), resultando na produção de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), um mensageiro secundário nessa via de sinalização celular. O GMPc por sua vez é capaz de modular a atividade de algumas fosfodiesterases (PDEs), enzimas responsáveis pela degradação do GMPc e de outro nucleotídeo cíclico, o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc). O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da elevação dos níveis de NO por meio do doador de óxido nítrico (SNAP) e o uso de inibidores de diferentes isoformas de fosfodiesterases no meio de cultivo durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos sobre a retomada da meiose, concentração de NO e níveis de GMPc e AMPc. Deste modo, os complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos foram cultivados por até 9 horas com o doador de NO (SNAP - 10-7 M) associado ou não ao inibidor de GCs (ODQ - 10-5 M) e associado ou não aos inibidores das fosfodiesterases, PDE5 (Sildenafil - 10&micro;M), PDE3 (Cilostamide - 20&micro;M) e PDE8 (Dipiridamole - 50&micro;M). As amostras foram avaliadas quanto a taxa de retomada da meiose, níveis de NO (9h de MIV) e níveis dos nucleotídeos cíclicos GMPc e AMPc (0, 1, 2 e 3h de MIV). O SNAP retardou o rompimento da vesícula germinativa com 9horas de cultivo (P&lt;0,05) e quando o SNAP foi associado ao ODQ o efeito foi revertido (P&gt;0,05). A inclusão de SNAP no cultivo, os níveis de NO foram elevados (P&lt;0,05). Os níveis de GMPc só foram influenciados positivamente pelo SNAP com 1 hora de cultivo (P&lt;0,05) e após 2 e 3 horas, esta influência não persistiu (P&gt;0,05), visto que o ODQ aboliu o efeito. A influência do SNAP foi devido ao estímulo da GCs. Para os níveis de AMPc, o doador de NO não foi capaz de influenciar suas concentrações durante as 3 horas de cultivo (P&gt;0,05). Quando o SNAP foi associado ao Sildenafil (SNAP+SIL) não houve diferença em relação ao grupo imaturo (P&gt;0,05), porém, também não se diferiu do tratamento SNAP e controle (P&gt;0,05). Para as taxas de retomada de meiose todos os tratamentos foram eficientes e conseguiram retardar a quebra da vesícula germinativa diante do grupo controle (P&lt;0,05), sendo o grupo SNAP+CIL mais eficiente. Para os níveis de AMPc, nem mesmo com a utilização de inibidores das PDE3 e PDE8 foi possível atenuar a queda do nucleotídeo. Em conclusão, o SNAP exerceu influência na retomada da meiose, na concentração de NO e nos níveis de GMPc sendo que sua ação se deve à atividade da GCs. Não houve influência sobre os níveis de AMPc, quando o SNAP foi associado a inibidores específicos de fosfodiesterases, mesmo quando apresentaram efeito sobre a retomada da meiose. A via NO/GCs/GMPc não parecer atuar sobre a via PDE3/AMPc, sugerindo a ação de outras vias no controle da meiose. / Nitric oxide (NO) is a chemical messenger found in many cell types such as endothelial cells, neurons and macrophages. The synthesis of NO is made by the action of nitric oxide synthase (NOS). One of the mechanisms of action of NO is given by the activation of the enzyme soluble guanylate cyclase (sGC), resulting in the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), a secondary messenger in this pathway of cell signaling. The cGMP in turn is capable of modulating the activity of some phosphodiesterases (PDEs), enzymes responsible for degradation of cGMP and other cyclic nucleotide, cyclic adenosine monophosphate (cAMP). The objective of this study was to investigate the effects of elevated levels of NO via nitric oxide donor (SNAP) and the use of inhibitors of phosphodiesterase isoforms in the culture medium during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP and cAMP levels. Thus, the complexes cumulus-oocyte (COCs) were cultured for cattle up to 9 hours with the NO donor (SNAP - 10-7 M) with or without the inhibitor of sGC (ODQ - 10-5 M) and with or without to inhibitors of phosphodiesterase PDE5 (Sildenafil - 10&micro;M), PDE3 (Cilostamide - 20&micro;M) and PDE8 (Dipyridamole - 50&micro;M). The samples were evaluated for the rate of resumption of meiosis, levels of NO (9h - IVM) and levels of cyclic nucleotides cGMP and cAMP (0, 1, 2 and 3h - IVM). The SNAP delayed with germinal vesicle breakdown of 9hours cultivation (P &lt; 0.05) when SNAP was associated with ODQ was reversed the effect (P&gt; 0.05). The inclusion of SNAP cultivation, NO levels were increased (P&lt;0.05). cGMP levels were positively influenced only by the snap 1 hour in culture (P&lt;0.05) and after 2 and 3 hours, this effect was not maintained (P&lt;0.05), whereas ODQ abolished the effect. The influence of SNAP was due to stimulation of GCs. For cAMP levels, the NO donor was not able to influence their concentrations during the 3 h incubation (P&gt;0.05). When SNAP was associated with Sildenafil (SIL+SNAP) there was no difference compared to the immature group (P&gt;0.05), however, also did not differ from SNAP treatment and control (P&gt;0.05). Rates for resumption of meiosis all treatments were efficient and able delay before germinal vesicle breakdown in the control group (P&lt;0.05), with SNAP+CIL group more efficient. For cAMP levels, even with the use of inhibitors of PDE3 and PDE8 was possible to alleviate the decrease of the nucleotide. In conclusion, SNAP exerted influence on the resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP levels and that its action is due to a GCs activity. There was no effect on cAMP levels, when SNAP was associated with specific phosphodiesterase inhibitors, even when presented effect on the resumption of meiosis. The pathway NO/sGC/cGMP seem not act on the pathway PDE3/AMPc, suggesting the action of other pathways in the control of meiosis.

A maturação in vitro de oócitos (MIV) é uma importante tecnologia reprodutiva a qual gera oócitos maduros capazes de suportar o desenvolvimento embrionário pré-implantacional e sua completa evolução à termo. Muitos fatores levam ao processo de maturação do oócito, e o AMH (hormônio anti-Mülleriano) tem demonstrado possuir um importante efeito nesta etapa. Neste trabalho nós demonstramos a influência da suplementação de AMH na maturação de complexos cumulus-oócito (COCs). Nossos resultados demonstram que não houve efeito na produção de embriões para COCS grau I. Entretanto, pudemos encontrar diferenças significativas entre os COCs graus II e III maturados na presença de 150ng/ml de AMH. Aqui também demonstramos que não houve diferença significativa na expressão relativa de mRNA para os genes AMHRII e FSHR no oócito, e na expressão relativa de mRNA para os genes AMH, AMHRII e FSHR nas células da granulosa. Nossos resultados corroboram com as importantes funções do AMH na produção de embriões, sugerem que a suplementação do meio de maturação de oócitos com AMH pode ajudar a melhorar a produção de blastocistos. / The in vitro oocyte maturation (MIV) is an important reproductive technology that generates mature oocytes able to support the preimplantation embryonic development and their fully evolution to term. Many factors lead to oocyte maturation process, and the AMH (AntiMüllerian hormone) have demonstrated important effects in the oocyte development. Here, we report the influence of AMH supplementation in the cumulus-oocyte complex (COCs) maturation. We found that AMH had no effect on embryo production of COCs grade I. On the other hand, significant differences between the COCs grade II and COCs grade III matured in AMH 150ng/ml were verified. We have also demonstrated that there were no significant difference in mRNA expression of the genes AMHRII and FSHR in the oocyte, and in mRNA of the genes AMH, AMHRII and FSHR in the granulosa cells. Taken together, the results corroborate the important roles for AMH on embryo production, and suggest that AMH supplementation could achieve successful outcome in the production of blastocysts.