Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5518.pdf: 1765927 bytes, checksum: 354bfee295ad1873956c15264ad51854 (MD5) Previous issue date: 2013-08-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / The photodynamic inactivation (PDI), used for biological control of microorganisms, involves the action of a photosensitizer (PS), activated by visible light, in order to oxidize organic substrates, resulting in cytotoxic effect. The control of free-living amoebae is important both for its pathogenicity and its microorganisms harboring. Additionally, some species may develop serious infections in humans. The present study evaluated the in vitro effectiveness of PDI in Acanthamoeba polyphaga. Salt of curcuminoids, curcumin, methylene blue and Photogem® were used as FS. Besides, this study intended to observe morphological changes caused by the salt of curcuminoids in the microorganism. The samples were grown at 37 ºC in PYG medium for a period of 48 to 72 hours. Curcumin was solubilized in 1 mL DMSO and further diluted in distilled water to obtain final concentrations. The other PS s were directly solubilized in distilled water. The irradiation light-emitting diodes were used at wavelengths 460 and 630 nm at doses of 30 and 50 J/cm2. After treatments, resazurin was added to evaluate the respiratory activity of A. polyphaga and the samples were incubated at 37 °C for 4 hours. The fluorescence intensity was measured in a fluorescence spectrophotometer. In PDI with salt of curcuminoids at concentrations 500, 1000 and 1500 µg/mL, there was a reduction of 27.7%, 61.4% and 82.5% at 30 J/cm2 and 75.2%, 85.0% and 95.9% at 50 J/cm2, respectively. In PDI with curcumin at concentrations 35, 70 and 140 µg/mL, there was a reduction of 16.2%, 24.0% and 25.7% at 30 J/cm2, and 25.4%, 28.3 % and 30.5% at 50 J/cm2, respectively. In PDI with methylene blue at concentrations 24 and 32 µg/mL, there was a reduction of 14.1% and 28.3% at 30 J/cm2, with no reduction in the concentration of 16 µg/mL and 18.7%, 36.9% and 23.9% at 50 J/cm2, respectively. Finally, in PDI with Photogem® at concentrations 50, 100 and 200 µg/mL, there was a reduction of 20.1%, 37.6% and 53.5% at 30 J/cm2, and 17.1%, 38.9% and 57.3% at 50 J/cm2, respectively. The removal of the PS before irradiation showed that the salt of curcuminoids probably didn t stay inside of amoebas, because the reduction obtained previously was not observed in this condition. The PS was toxic to the amoebae in the absence of light, at the concentrations tested, and the isolated use of light showed no phototoxic effect, except the dose of 50 J/cm2 at 460 nm wavelength. The phototoxicity by doses of light together the PS contributed to the death of the amoebae, being more efficient with salt of curcuminoids. The analysis of confocal microscopy images showed that the salt of curcuminoids caused damage in amoebae, confirming its toxicity in the dark. Therefore, it is concluded that contact with only the PS is already able to induce morphological changes in A. polyphaga, leading some of them to death. / A inativação fotodinâmica (IFD), utilizada no controle biológico de microrganismos, envolve a ação de um fotossensibilizador (FS), ativado por luz visível, no intuito de oxidar substratos biológicos, resultando em efeito citotóxico. O controle de amebas de vida livre é importante, tanto pela sua patogenicidade quanto pelo fato de abrigarem microrganismos. Além disso, algumas espécies podem desenvolver sérias infecções em humanos. O presente estudo propôs analisar a efetividade in vitro da IFD em Acanthamoeba polyphaga utilizando sal de curcuminóides, curcumina, azul de metileno e Photogem® como FS, além de observar alterações morfológicas causadas pelo sal de curcuminóides neste microrganismo. As amostras foram cultivadas em meio PYG, incubadas a 37°C por 48 a 72 horas. A curcumina foi solubilizada em 1 mL de DMSO e posteriormente diluída em água destilada para obtenção das concentrações finais. Os demais FS foram solubilizados diretamente em água destilada. Para a irradiação, diodos emissores de luz foram utilizados nos comprimentos de onda 460 e 630 nm, nas doses de 30 e 50 J/cm2. Após os tratamentos, resazurina foi adicionada para avaliar a viabilidade de A. polyphaga, sendo as amostras incubadas a 37°C por 4 horas. A intensidade de fluorescência foi medida em espectrofotômetro de fluorescência. Na IFD com sal de curcuminóides nas concentrações 500, 1000 e 1500 µg/mL, houve redução de 27,7%, 61,4% e 82,5% com 30 J/cm2, e de 75,2%, 85,0% e 95,9% com 50 J/cm2, respectivamente. Já na IFD com curcumina nas concentrações 35, 70 e 140 µg/mL, houve redução de 16,2%, 24,0% e 25,7% com 30 J/cm2, e de 25,4%, 28,3% e 30,5% com 50 J/cm2, respectivamente. Na IFD com azul de metileno nas concentrações 24 e 32µg/mL, houve redução de 14,1% e 28,3% com 30 J/cm2, não havendo redução na concentração de 16 µg/mL e de 18,7%, 36,9% e 23,9% com 50 J/cm2, respectivamente. Por fim, na IFD com Photogem® nas concentrações 50, 100 e 200 µg/mL, houve redução de 20,1%, 37,6% e 53,5% com 30 J/cm2, e de 17,1%, 38,9% e 57,3% com 50 J/cm2, respectivamente. A retirada do FS antes da irradiação mostrou que o sal de curcuminóides provavelmente não permaneceu no interior das amebas, pois a redução obtida anteriormente não foi observada nesta condição. Os FS apresentaram toxicidade para as amebas, na ausência de luz, nas concentrações testadas e o uso isolado da luz não apresentou efeito fototóxico, exceto a dose 50 J/cm2 no comprimento de onda 460 nm. A fototoxicidade proporcionada pelas doses de luz junto aos FS utilizados contribuiu para o efeito de morte das amebas, sendo a IFD eficiente com o sal de curcuminóides. A análise das imagens obtidas pela microscopia confocal mostrou que o sal de curcuminóides causou danos em amebas, confirmando a toxicidade apresentada no escuro. Portanto, conclui-se que apenas o contato com o FS já é capaz de induzir mudanças morfológicas em A. polyphaga, levando algumas células à morte.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work aimed to develop a procedure for disinfecting water by photodynamic inactivation of microorganisms and subsequent removal of photosensitizers. The Escherichia coli photoinactivation was performed using PHLS (Policromatic Halogen Light System) light system irradiation, Methylene Blue and Rose Bengal as photosensitizers, cationic and anionic dyes , respectively. The phase separation between the photosensitizers and the analyzed sample was studied by coagulation, being used the crushed seeds of Moringa oleifera, Chitosan powder and commercial Aluminum Sulphate. All experiments were performed previously in samples of E. coli (ATCC 25922) prepared with a turbidity of about 01 on the Mac Farland scale and later in a sample of effluent from the Sewage Treatment Plant of Uberlândia - MG. The results were quite significant as much photoinactivation as the photosensitizers removal, being Moringa oleifera the best coagulant used, able to remove, from effluent sample, 96.9% Rose Bengal and 75.9% Methylene Blue, both at a concentration of 3,91x10-5 mol L-1. / O presente trabalho visou desenvolver um procedimento para a desinfecção de águas através da inativação fotodinâmica de micro-organismos e posterior remoção dos fotossensitizadores. A fotoinativação de Escherichia coli foi realizada utilizando sistema de irradiação luminosa PHLS (Policromatic Halogen Light System) e Azul de Metileno e Rosa de Bengala como fotossensitizadores, corantes catiônico e aniônico, respectivamente. A separação de fases entre os fotossensitizadores e a amostra analisada foi estudada através de coagulação, sendo utilizadas as sementes de Moringa oleífera trituradas, Quitosana em pó e Sulfato de alumínio comercial. Todos os experimentos foram realizados previamente em amostras de E. coli (ATCC: 25922) preparadas com turvação de aproximadamente 01 na escala de Mac Farland e posteriormente em amostra de efluente proveniente da Estação de Tratamento de Esgoto de Uberlândia - MG. Os resultados obtidos foram bastante expressivos tanto na fotoinativação, quanto na remoção dos fotossensitizadores, sendo a Moringa oleífera o melhor coagulante utilizado, tendo conseguido remover da amostra de efluente 96,9% do Rosa de Bengala e 75,9% do Azul de Metileno, ambos em uma concentração de 3,91x10-5 mol L-1. / Mestre em Química

Devido à grande preocupação com a geração de novas tecnologias mais ágeis, eficientes e de baixo custo, as reações fotodinâmicas (RF) têm ganhado destaque. Estas envolvem a ativação de um fármaco fotossensível (fotossensibilizador (FS)), pela iluminação em uma faixa específica de comprimentos de onda, gerando assim espécies reativas altamente citotóxicas levando as células à morte. As RF são divididas em duas categorias: terapia fotodinâmica (TFD) e inativação fotodinâmica (IFD). A primeira é utilizada para tratamentos oncológicos, dermatológicos, entre outros. A segunda é utilizada para descontaminação de micro-organismos em infecções localizadas. Atualmente a IFD tem sido alvo de muitos estudos pois tem diversas vantagens quando comparadas com as técnicas de descontaminação atuais. Duas das mais importantes são: a seletividade e a não geração de micro-organismos resistentes aos FSs. Apesar desta técnica ser utilizada com sucesso em diversos campos, ela ainda apresenta baixa eficiência quando comparada às técnicas tradicionais. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi criar um novo protocolo de aplicação da IFD visando o aumento de eficiência, bem como um estudo profundo das interações dos FSs com as células, e o monitoramento da dinâmica do FS nestas. O presente estudo utiliza-se de células da levedura Candida albicans e demonstra a interação destas células com dois FSs: Photogem® e Curcumina. Foi proposto um novo protocolo que promove o aumento da internalização de FS pelas células baseado na pré-iluminação de baixa dose durante o tempo de incubação. Foi possível demonstrar através da medida dos espectros de absorção do sobrenadante de uma solução com células e Photogem®, que as amostras que tiveram pré-iluminação internalizaram mais FS do meio do que as células mantidas no escuro. Além disso, a partir de ensaios de viabilidade com a levedura e o Photogem® foi demonstrado que as amostras que tiveram pré-iluminação apresentaram diminuição de até seis ordens de grandeza nas unidades formadoras de colônia quando comparadas com as amostras tratadas pelo protocolo tradicional de IFD. Através das técnicas de microscopia confocal de fluorescência e de imagem de tempo de vida de fluorescência foi possível compreender a interação entre os FSs e as células, bem como estudar a ligação deste FS em diferentes regiões da célula. Além disso, foi estudada ainda a mobilidade destas moléculas dentro das células sob condições com e sem iluminação de baixa dose. Através deste estudo pôde-se inferir que as moléculas de curcumina tem tempos característicos de entrada nas células mais lentos que os tempos característicos do Photogem®. Ainda foi possível tomar vantagem da fluorescência do Photogem® para monitorar a entrada deste nas células de levedura, bem como monitorar a formação do seu fotoproduto, determinando assim que 7,5 minutos é o tempo médio de iluminação durante a incubação com FS necessário para que pelo menos 80% das células tivessem o FS internalizado, sem significante formação de fotoprodutos. Conclui-se ainda que este novo protocolo de incubação com iluminação leva a maior eficiência e seletividade da IFD, abrindo caminho para uma nova linha de pesquisa nas RF em geral, possivelmente podendo este protocolo ser aplicado em diversos tipos de células. / In the last years, due to the increasing need of generation of novel faster and cheaper technologies, the photodynamic reactions (PR) have been highlighted. These reactions involves the activation of a photosensitive drug, named photosensitizer (PS), by light in proper spectral window and generation of highly cytotoxic reactive species, leading cells to death. The photodynamic reactions may be divided in two categories: photodynamic therapy (PDT) and photodynamic inactivation (PDI). The first one is performed in order to treat oncologic, dermatologic and other diseases, whereas the second one is employed in the decontamination of microorganisms in localized infections. When compared with existing decontamination techniques, PDI has several advantages, among which two of the most important are its selectivity of the PS that acts only at the delivered site, as well as not inducing antibiotic resistance, for such reasons are subjected of many current studies. Althought this technique has been performed with great success in many fields, it still has a lack of efficiency. In this context, the purpose of this study was create a new application protocol of this technique in order to increase the efficiency, as well as understand the interactions of the PS with the cells and monitoring the drug dynamic in cells. In this study, Candida albicans cells were utilized and the interaction of two PSs (Photogem® and Curcumin) were demonstrated. A new protocol which promotes an increase of the PS cells uptake was proposed, this protocol is based on the low dose illumination during the incubation time. By measuring absorption spectra of the supernatant of two solutions with cells and Photogem®, in which in one of them were applied a low dose light, was demonstrated that the illuminated cells had an uptake increased when compared with the sample kept in the dark. Moreover, viability assays with the Photogem® and the cells proved that the cells that receive low dose light in the incubation stage had more damage in the PDI, showing a decrease of six orders of magnitude when compared with the traditional PDI. Through confocal and lifetime fluorescence microscopy techniques it was possible not only to comprehend the interaction between the PS and cells, as well as to study the binding of this molecules in different regions of the cells. Furthermore, the mobility of the PS molecules inside the cells was studied in conditions of illumination and dark, it could be inferred that the curcumin molecules has higher characteristic time than Photogem® molecules. Monitoring the cell Photogem® uptake, and the photoproduct formation was possible by take advantage of the PS fluorescence. Thus it was possible to determine the average illumination time (7.5 minutes) during the incubation time so at least 80% of the cells had the PS internalized, without much generation of photoproducts. It follows also that this new incubation protocol with low dose illumination leads to greater efficiency of PDI, so this study leads a new field of research in overall photodynamic reaction.

O crescente número de bactérias resistentes é devido principalmente ao número limitado de modos de ação dos antibióticos, contra os quais bactérias criam mecanismo de resistência. Há, portanto, necessidade de terapias com espectro de ação mais amplo, atingindo diferentes alvos moleculares. A inativação fotodinâmica (IFD) pode ser uma dessas terapias, pois baseia-se na geração de espécies reativas que atacam diversas moléculas, e não um alvo específico. Fotossensibilizadores (FSs) absorvem luz em comprimento de onda específico e a energia absorvida pode ser transferida a um oxigênio molecular, gerando espécies reativas de oxigênio (EROs). Tais espécies são altamente citotóxicas e produzem reações de oxidação que levam à morte celular. Um dos alvos das EROs são fosfolipídios insaturados das membranas biológicas. O objetivo desta dissertação é investigar a interação dos FSs curcumina e azul de metileno com fosfolipídios e o efeito da foto-ativação desses FSs em um mimético de membrana bacteriana. Para tanto, foram usados filmes de Langmuir do extrato lipídico de Escherichia coli e dos lipídios sintéticos isolados DOPE, POPG e cardiolipina. As isotermas de pressão com o extrato de E coli indicam interação entre os FSs e os lipídios do filme, aumentando a área ocupada. A irradiação do filme na presença de curcumina aumenta sua estabilidade, o que sugere formação de hidroperóxidos de lipídio, mais hidrofílicos, pela ação do oxigênio singleto. Nos filmes dos lipídios isolados só a curcumina é incorporada, havendo aumento na área ocupada pelo filme, e redução no potencial de superfície. Nenhum efeito decorrente da irradiação desses filmes foi detectado. Um filme Langmuir-Blodgett (LB) de extrato de E. coli com curcumina foi submetido a quatro ciclos de fotoclareamento seguido de recuperação da fluorescência visualizados num microscópio confocal. A intensidade da fluorescência aumentou após o primeiro ciclo, indicativo de mudança conformacional para alocar maior quantidade de curcumina, o que corrobora a hipótese da formação de hidroperóxidos. / The growing number of resistant bacteria is mainly due to the limited number of modes of action of antibiotics, against which bacteria create resistance. There is, therefore, a need for therapies with broader action spectrum, reaching different molecular targets. Photodynamic inactivation (PDI) may be one of these therapies, because it is based on the generation of reactive species that attack several molecules, not a specific target. Photosensitizers (FSs) absorb light at a specific wavelength and the absorbed energy can be transferred to a molecular oxygen, generating reactive oxygen species (ROS). Such species are highly cytotoxic and produce oxidation reactions that lead to cell death. One of the targets of ROS are unsaturated phospholipids from biological membranes. The objective of this dissertation is to investigate the interaction of the FSs curcumin and methylene blue with phospholipids and the effect of photoactivation of these FSs on a bacterial membrane mimetic. For this purpose, Langmuir films of the lipid extract of Escherichia coli and the synthetic lipids DOPE, POPG and cardiolipin were used. The surface pressure isotherms with the E. coli extract indicate interaction between the FSs and the lipids of the film, increasing the occupied area. The irradiation of the film in the presence of curcumin increases its stability, which suggests the formation of more hydrophilic lipid hydroperoxides by the action of singlet oxygen. In the synthetic lipid films only curcumin is incorporated, with increase in the area occupied by the film, and reduction in surface potential. No effect from irradiation of these films was detected. A Langmuir-Blodgett (LB) film of E. coli extract with curcumin was submitted to four cycles of photobleaching followed by fluorescence recovery visualized in a confocal microscope. The intensity of the fluorescence increased after the first cycle, indicative of conformational change to allocate a larger amount of curcumin, which corroborates the hypothesis of hydroperoxide formation.

Espécies de fungos dos gêneros Candida e Trichophyton e Cryptococcus neoformans são os mais importantes agentes causadores de micoses em humanos. A seleção de linhagens tolerantes aos fungicidas atualmente utilizados torna extremamente necessário o desenvolvimento de novas estratégias para o controle desses patógenos. A inativação fotodinâmica (IF) de fungos baseia-se na utilização de um fotossensibilizador (FS) que se acumula preferencialmente nas células-alvo e que pode ser ativado por exposições à luz visível. A ativação do FS induz a formação de espécies reativas de oxigênio que matam a célula fúngica. O uso de FS para o tratamento de micoses é uma aplicação recente e promissora da IF de fungos. No presente estudo, foram avaliados os efeitos dos tratamentos fotodinâmicos (TF) com os FS fenotiazínicos azul de metileno (MB), azul de toluidina (TBO), novo azul de metileno (NMBN), o derivado pentacíclico do azul de metileno S137 e com uma cloroalumínio ftalocianina em nanoemulsão (ClAlPc/NE) nas leveduras Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis, Cryptococcus neoformans e nos microconídios dos dermatófitos Trichophyton mentagrophytes e T. rubrum. Os efeitos dos TF com os diferentes FS fenotiazínicos também foram avaliados na linhagem celular L929 de camundongo. Inicialmente, a eficácia dos TF foi avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de cada FS para cada dose de luz. Adicionalmente, nas condições otimizadas, também foram determinados os efeitos dos TF na sobrevivência das diferentes espécies de fungos. Os MICs variaram tanto entre FS como entre espécies e diminuíram com o aumento da dose de luz. Entre os FS fenotiazínicos, para a maioria dos tratamentos (espécies e doses de luz), o NMBN e o S137 apresentaram os menores MICs. Os MICs para o NMBN e para o S137 foram <= 2,5 ?M para todas as espécies de Candida, para doses >= 20 J cm-2. MICs para a ClAlPc/NE foram tão baixos quanto 0,01 ?M para algumas das espécies de Candida. O TF com NMBN e S137 resultaram em redução de pelo menos 3 logs na sobrevivência de todas as espécies de Candida e de Trichophyton. O TF com ClAlPc/NE resultou em redução de até 4 logs na sobrevivência de C. albicans e C. tropicalis e de até 6 logs na sobrevivência de células melanizadas de C. neoformans. A internalização da ClAlPc foi confirmada por microscopia confocal de fluorescência e a quantidade incorporada pelas células foi dependente da concentração do FS. As toxicidades relativas entre os diferentes FS para as células de mamífero foram semelhantes às observadas em fungos, por exemplo maior toxicidade e fototoxicidade do NMBN e do S137 comparada às do MB e TBO / Fungal species of the genera Candida and Trichophyton and Cryptococcus neoformans are the main responsible for mycoses in humans. The selection of fungal strains resistant to currently used fungicides makes the development of alternative fungus-control techniques highly desirable. Fungal photodinamic inactivation (PI) is based on the use of a visible light-activate photosensitiser (PS) that preferentially accumulates in the cell of the target microorganism. The activation of the PS starts photochemical processes that produce a series of reactive oxygen species (ROS) that kill the fungal cell. The use of PS to treat mycoses is a novel and promising application of PI. In the present study, the effects of the photodynamic treatments (PDT) with the phenothiazinium PS methylene blue (MB), toluidine blue O (TBO), new methylene blue N (NMBN), the novel pentacyclic photosensitiser S137 and with a chloroaluminum phthalocyanine nanoemulsion (ClAlPc/NE) on the yeasts Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis and Cryptococcus neoformans and on microconidia of the dermatophytes Trichophyton mentagrophytes and T. rubrum were evaluated. The effects of the PDT with the phenothiazinium PS were also evaluated on the mouse fibroblast cell line L929. The efficacies of the PDT were evaluated initially by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) of each PS for each light dose. Additionally, for the optimized conditions, the effects of the PDT on the survival of the different fungal species were also determined. MICs varied both among PS and species and decreased with light dose increase. Among the phenothiazinium PS, for most treatments (species and light doses), NMBN and S137 showed the lowest MICs. MICs for NMBN and S137 were <= 2.5 ?M for all the Candida species to light doses >= 20 J cm-2. MICs for ClAlPc/NE were as low as 0.01 ?M for some of the Candida species. PDT with NMBN and S137 resulted in a reduction of at least 3 logs in the survival of all Candida and Trichphyton species. PDT with ClAlPc/NE resulted in reductions up to 4 logs in the survival of C. albicans and C. tropicalis and up to 6 logs in the survival of C. neoformans melanized cells. Internalization of ClAlPc by C. neoformans was confirmed by confocal fluorescence microscopy, and the degree of uptake was dependent on PS concentration. The relative toxicities among the different PS to mammalian cell were similar to the antifungal data, i.e. greater toxicity and phototoxicity with NMBN and S137 compared to MB and TBO.

A nanotecnologia tem sido aplicada para o desenvolvimento de materiais para diversas aplicações inclusive na inativação de patógenos. As nanopartículas de sílica (npSi) destacam-se pela alta área superficial, facilidade na alteração da superfície para aumento da eficiência adsortiva, penetrabilidade e toxicidade para bactérias gram-negativas sendo biocompatíveis para células de mamíferos e mais foto-estáveis que a maioria dos compostos orgânicos. Devido as suas vantagens, as npSi podem ser usadas para veicular fotossensibilizadores (FSs) uma vez que permitem sua utilização em solução aquosa em que os FSs geralmente são insolúveis. Além disso, o uso de FSs em vez de antibióticos, permite a inativação microbiológica pela Terapia Fotodinâmica sem que as bactérias adquiram resistência por mecanismos genéticos. Esse processo ocorre pela interação entre um FS, luz e oxigênio molecular produzindo oxigênio singleto que é extremamente reativo danificando estruturas celulares. O objetivo desse estudo foi otimizar a fotoinativação dinâmica de E .coli utilizando Azul de Metileno (AM) e Azul de Toluidina O (ATO) veiculados por npSi. As npSi foram preparadas pela metodologia sol-gel, caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e submetidas à adsorção de AM e ATO em sua superfície. A presença de AM e ATO na superfície das npSi foram analisadas por espectroscopia no infravermelho; espectroscopia de fluorescência por raio-X e análise termogravimétrica. O planejamento experimental, iniciado pelo fatorial 23 e modelado ao composto central em busca das condições ótimas foi adotado pela primeira vez nessa aplicabilidade, visando a fotoinativação de E. coli empregando AM e ATO em solução e em seguida com npSi. AM e ATO veiculados por npSi permitem a fotoinativação em concentrações mais baixas de FS (20 e 51% respectivamente), causando desestruturação da integridade bacteriana demonstrada por MEV. Os resultados sugerem que a veiculação de AM e ATO por npSi é extremamente efetiva para a fotoinativação dinâmica de E. coli e que o planejamento composto central pode levar à completa inativação das bactérias. / Nanotechnology has been applied to the development of materials for several apllications inclusive inactivation of pathogens. The silica nanoparticles (npSi) are distinguished by high surface area, ease of change the surface in order to increase the adsorption efficiency, penetrability and toxicity in gram-negative bacteria being biocompatible with mammalian cells and more photo-stable than most the organic compounds. Due to its advantages, npSi can be used to carry photosensitizers (PSs) since they allow its use in aquous solution in which PSs are frequently insoluble. Furthermore, the use of PSs instead of antibiotics, allows the microbiological inactivation by Photodynamic Therapy without bacteria to develop resistance by genetic mechanisms. This process occurs by the interaction among a PS, light and molecular oxygen producing singlet oxygen, which is extremely reactive, causing damage to cellular structures. The aim of this study was to optimize the photoinactivation of E. coli using Methylene Blue (MB) and Toluidine Blue O (TBO) carried by npSi using the central composite design. The npSi were prepared by sol-gel method, characterized by scanning electron microscopy (SEM) and subjected to adsorption of MB and TBO on its surface. The presence of FSs on the surface of npSi were analyzed by infrared spectroscopy, fluorescence X-ray spectroscopy and thermogravimetric analysis. The experimental design, initiated by the factorial 23 and modeled by the central composite in search of the optimal conditions was adopted for the first-time for this applicability, aiming the E. coli photoinactivation employing MB and TBO in solution and then with npSi. MB and TBO carried by npSi allowed the photoinactivation in lower concentrations of PS (20 and 51% respectively), causing disruption of bacterial integrity demonstrated by SEM. The results suggest that MB and TBO carried by npSi are extremely effective for dynamic photoinactivation of E. coli and the central composite design can lead to complete inactivation of bacteria.

O basidiomiceto Cryptococcus neoformans é um fungo saprófita, com ampla distribuição geográfica, que é normalmente isolado de solos que contêm excretas de pombos e detritos vegetais. Apesar de saprófita, o fungo pode infectar e causar doença em uma grande variedade de hospedeiros animais, como mamíferos, aves e insetos. O número de casos de micoses graves, causadas por C. neoformans e por outros gêneros de fungos, tem aumentado em todo o mundo, principalmente devido ao aumento do número de indivíduos imunocomprometidos. Adicionalmente, a emergência de novas espécies de patógenos e a seleção de linhagens tolerantes aos antifúngicos comumente utilizados fazem com que o desenvolvimento de novas estratégias para o controle de fungos seja extremamente desejável. A inativação fotodinâmica de fungos é um método novo e promissor, que pode ser utilizado tanto para o controle de micoses (em animais e em vegetais), como para a eliminação de fungos do ambiente. A fotoinativação de fungos é baseada no uso de fotossensibilizadores que se acumulam ou que são preferencialmente metabolizados pelas células do microrganismo-alvo. A seguir, o fotossensibilizador é exposto à luz visível, que, na presença de oxigênio, inicia processos fotoquímicos que produzem uma série de espécies reativas de oxigênio capazes de matar as células fúngicas sem provocar danos significativos nos tecidos do hospedeiro. Neste trabalho, foram avaliadas as eficácias do azul de metileno (MB) (em solução e em nanoemulsão), da cloro-alumínio ftalocianina (em nanoemulsão) e do complexo nitrosilo de rutênio (em solução) como fotossensibilizadores para a fotoinativação de células melanizadas e não melanizadas de C. neoformans. C. neoformans foi suscetível à fotoinativação pela cloro-alumínio ftalocianina, com uma inativação próxima de 100% quando foi utilizada uma combinação apropriada da concentração do fotossensibilizador e da dose de luz. A completa fotoinativação do fungo pela ftalocianina, em condições compatíveis com a terapia fotodinâmica, abre a perspectiva da utilização desse fotossensibilizador para o tratamento de micoses causadas por C. neoformans. A fotoinativação pelo MB foi apenas parcial e não ocorreu fotoinativação pelo nitrosilo de rutênio. Nenhum dos fotossensibilizadores matou o fungo na ausência da luz. Também foram feitos experimentos para se verificar a influência do tempo de crescimento e da melanização na tolerância de C. neoformans à fotoinativação pelo MB. Houve diferença significativa na tolerância entre diferentes linhagens de C. neoformans. Para a maioria dos tratamentos [linhagens e tempo de crescimento (4, 6 ou 8 dias)], não houve diferença significativa entre a tolerância de células melanizadas e não melanizadas. Também não foi observada diferença na tolerância entre células com idade de 4 a 8 dias. / The basidiomycete Cryptococcus neoformans is a saprophytic worldwide fungus which is normally isolated from soils contaminated with pigeon excreta and plant detritus. Despite a saprophytic existence, the fungus can infect and cause disease in a wide variety of animal hosts such as mammals, birds and insects. Serious infections caused by C. neoformans and by other genera of fungi have emerged all over the world, primarily due to the increased numbers of immunocompromised individuals. Additionally, the emergence of new species and antimycotic-resistant strains of pathogenic fungi makes the development of new fungus-control techniques highly desirable. Photodynamic inactivation of fungi is a new and promising method that can be used to control localized mycoses or kill fungi in the environment. The photodynamic inactivation of fungi is based on the use of a photosensitizer that accumulates in, or preferentially is metabolized by, cells of the target microorganism. The photosensitizer is then exposed to visible light in the presence of oxygen, and this starts photochemical processes that produce a series of reactive oxygen species (ROS) capable of killing the fungal cells without causing significant damage to host tissues. We report here the efficacy of methylene blue (MB) (in solution and in nanoemulsion), chloroaluminum phthalocyanine (in nanoemulsion) and nitrosyl ruthenium complex (in solution) as photosensitizers in photoinactivation of melanized and nonmelanized Cryptococcus neoformans yeast cells. C. neoformans were susceptible to photoinactivation by chloroaluminum phthalocyanine with inactivation close to 100% when the appropriate combination of photosensitizer concentration and light-exposure dose was used. Photoinactivation by MB was only partial and nitrosyl ruthenium complex was ineffective. In the dark, neither photosensitizers inactivated the fungus. Complementary experiments were performed to estimate the effect of the age of the cells and of melanization in the fungus tolerance to photoinactivation by MB. There was a significative difference in the tolerance among strains of C. neoformans. For most of the treatments (strains and time of growth) there was no difference between the tolerance of melanized and nonmelanized cells. There was no difference in the tolerance among 4 to 8-day cells either.

Fusarium é um grande gênero de fungos filamentosos amplamente distribuídos que são importantes patógenos de plantas, animais e humanos. As doenças causadas por Fusarium spp. geram grandes perdas econômicas na produção de frutas, legumes, cereais e de celulose. Em humanos, o controle da fusariose com apenas um antifúngico é ineficaz, apresentando uma elevada taxa de mortalidade, especialmente em pacientes imunocomprometidos. A maior resistência aos fungicidas utilizados atualmente tem estimulado o desenvolvimento de novas tecnologias mais eficazes para o controle de fungos patogênicos. Assim, é necessária a busca de alternativas para o controle de microrganismos em ambas as áreas, clínica e agrícola. A inativação fotodinâmica antimicrobiano (IFA) é uma promissora plataforma antifúngica alternativa que pode ser utilizada para controlar o inóculo de fungos em mamíferos e no meio ambiente. A IFA baseia-se na utilização de um fotossensibilizador (FS) que se acumula na célula fúngica alvo. A exposição do FS à luz com um comprimento de onda apropriado, inicia um processo fotoquímico que produz espécies reativas de oxigênio (EROs), principalmente o oxigênio singleto, causando um dano oxidativo não especifico levando a morte da célula fúngica, sem dano significativo às células do hospedeiro. Em comparação com os fungicidas utilizados atualmente, a multiplicidade dos danos causados pelas EROs, reduzem a chance de selecionar microrganismos tolerantes. No presente trabalho, avaliamos o efeito da IFA com a combinação de luz vermelhas com fluências de 10 e 15 J cm-2 e cinco FS fenotiazínicos, azul de metileno (MB), azul de toluidina O (TBO), novo azul de metileno N fórmula sem zinco (NMBN), novo azul de metileno N formula com zinco (NMBN Zn) e um novo fenotiazínico pentacíclico S137, em microconídios não germinados e 4 h-germinados de Fusarium oxysporum, F. moniliforme e F. solani. A IFA com NMBN Zn resultou em uma redução de aproximadamente 5-logs na sobrevivência dos microconídios não germinados (quiescentes) e 4 h-germinados (metabolicamente ativos) das três espécies de Fusarium quando expostas a luz na fluência de 15 J cm-2. A lavagem dos microconídios não germinados e 4 h-germinados para retirar o excesso de FS antes da exposição à luz reduziu, porém não impediu a morte provocada pela IFA. A IFA com todos os FS e fluência aumentou a permeabilidade da membrana celular dos microconídios nas três espécies de Fusarium. O dano oxidativo causado pelas EROs produzidos durante o processo fotoquímico da IFA foi avaliado nos lipídios, proteínas e DNA dos microconídios das espécies de Fusarium. Foi observado um aumento da peroxidação lipídica em microconídios das três espécies de Fusarium após a IFA com NMBN Zn e S137. Observamos o aumento na carbonilação de proteínas em microconídios de F. oxysporum após IFA subletal com todos os FS. O aumento no dano do DNA em microconídios não germinados e 4 h-germinados foi observado apenas para o S137 na fluência de 0, 10 e 15 J cm-2. Nossos estudos expandem a compreensão da inativação fotodinâmica de fungos filamentosos / Fusarium is a large genus of filamentous fungi widely distributed wich are important pathogens of plants, animals and humans. Crop diseases caused by Fusarium generate great economic losses in the production of fruit, vegetables, cereals, and cellulose. In humans the control of progression of fusariosis by single-agent antifungal therapy is problematic, leading to a high mortality rate, especially with immunocompromised patients. The increased tolerance to currently used fungicides has stimulated the development of novel and effective technologies to control pathogenic fungi. Thus, the search for alternatives to control microorganisms is necessary in both, clinical and agricultural areas. Antimicrobial photodynamic treatment (APDT) is a promising alternative antifungal platform that can be used to control fungi both in mammalian hosts and in the environment. APDT is based on the use of a photosensitizer (PS) that accumulates in the target fungal cell. The exposure of the PS to light of an appropriate wavelength starts a photochemical process that produces reactive oxygen species (ROS), especially singlet oxygen, leading to non-specific oxidative damage causing the death of the fungal cell without significant harm to the host cells. In comparison with currently used fungicides, the multiple and variable targets of ROS reduce the chance of selecting tolerant microorganisms. In the present study, we evaluated the effect of APDT with the combination of red light with fluence of 10 and 15 J cm-2, and five phenotiazinium photosensitizer, methylene blue (MB), toluidine blue O (TBO), new methylene blue N zinc free form (NMBN), new methylene blue N zinc chloride double salt (NMBN Zn) and a novel pentacyclic phenothiazinium S137, on ungerminated and germinated microconidia of Fusarium oxysporum, F. moniliforme and F. solani. APDT with NMBN Zn resulted in a reduction of approximately 5 logs in the survival of the quiescent ungerminated microconidia and metabolically active germinated microconidia of the three Fusarium species when the light fluence of 15 J cm-2 was applied. Washing out the PS from both ungerminated and germinated microconidia before light exposure reduced but did not prevent the killing effect of APDT. APDT with all the PS and fluences increased cell membrane permeability for the three Fusarium species. The oxidative damage caused by ROS produced during the photochemical process of APDT, was evaluated in the lipids, proteins and DNA present in the microconidia. Increases in lipid peroxidation in microconidia of the three Fusarium species were observed only after APDT with NMBN Zn and S137. Proteins oxidative damage was observed by the increase in protein carbonylation in microconidia of the F. oxysporum after APDT with all PS. The increases in DNA damage from both ungerminated and germinated microconidia was observed only for S137 at fluence of 0, 10 and 15 J cm-2. Our study expands the understanding of photodynamic inactivation in filamentous fungi

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In order to develop new alternatives and /or therapeutic approaches that are effective in viral clearance, we evaluated two photosensitizers, zinc phthalocyanine and aluminum phthalocyanine, the photoinactivation bovine herpesvirus 1. As a control we used irradiated virus without the presence of photosensitizer (light control) viruses incubated with photosensitizers without radiating (photosensitizer control) and viruses without any treatment. The light control showed that the use of light without the presence of photosensitizer does not have phototoxic effect on the virus; control showed that the photosensitizer zinc and aluminum phthalocyanines have no cytotoxicity in the absence of light. Both controls were compared to the virus that received no treatment. To better evaluate the irradiation time and the optimal concentration of the two photosensitizers, viral suspension aliquots containing 105.75 TCID50/mL were used, incubated with photosensitizers at concentrations of 5 and 10 μM and irradiated at 0, 15, 30, 45, 60, 75, and 90 minutes. After irradiation, the sample was added in permissive cell cultures virus, which was analyzed for the presence of cytopathic effect and the results were expressed as viral titers. The zinc phthalocyanine showed better efficiency in photoinactivation bovine herpesvirus 1, wherein the concentration of 10 μM with 30 minutes of irradiation was the most effective. The phthalocyanine aluminum inactivated virus completely after 60 minutes of irradiation, but there was no significant difference between concentrations. These results indicate that both phthalocyanines have a good applicability in photodynamic viral inactivation, but the zinc phthalocyanine has a better efficiency. / A inativação fotodinâmica é uma técnica baseada na combinação sinérgica de um fotossensibilizador, oxigênio e luz, que resulta na geração de espécies reativas do oxigênio, que são citotóxicas e causam a morte celular por apoptose ou necrose. O herpesvírus bovino 1 é responsável por enfermidades no sistema respiratório e reprodutivo, estima-se que ocorra uma perda econômica de um bilhões de dólares por ano, devido à ação do vírus no rebanho. Visando novas alternativas e/ou abordagens terapêuticas que sejam eficazes na eliminação viral, avaliamos dois fotossensibilizadores, ftalocianina zinco e ftalocianina alumínio, na fotoinativação do herpesvírus bovino 1. Como controle foram utilizados vírus irradiado sem a presença do fotossensibilizador (controle da luz), vírus incubado com os fotossensibilizadores sem irradiar (controle do fotossensibilizador) e vírus sem nenhum tratamento. O controle da luz mostrou que o emprego da luz sem a presença do fotossensibilizador não possui efeito fototóxico sobre o vírus, o controle do fotossensibilizador mostrou que as ftalocianinas zinco e alumínio não possuem citotoxidade na ausência da luz. Ambos os controles foram comparados ao vírus que não recebeu nenhum tratamento. Para avaliar o melhor tempo de irradiação e a melhor concentração dos dois fotossensibilizadores, foram utilizadas alíquotas de suspensão viral contendo 105,75 TCID50/mL, incubadas com os fotossensibilizadores nas concentrações de 5 e 10 μM e irradiadas nos tempos 0, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 minutos. Após a irradiação a amostra foi adicionada em culturas de células permissíveis ao vírus, onde foi analisada a presença de efeito citopático e os resultados foram expressos em títulos virais. A ftalocianina zinco apresentou melhor eficiência na fotoinativação do herpesvírus bovino 1, sendo a concentração de 10 μM com 30 minutos de irradiação a mais eficaz. A ftalocianina alumínio inativou o vírus totalmente após 60 minutos de irradiação, mas não apresentou diferença significativa entre as concentrações. Estes resultados indicam que ambas ftalocianinas possuem uma boa aplicabilidade na inativação fotodinâmica viral, porém a ftalocianina zinco possui uma melhor eficiência.

O basidiomiceto Cryptococcus neoformans é um fungo saprófita, com ampla distribuição geográfica, que é normalmente isolado de solos que contêm excretas de pombos e detritos vegetais. Apesar de saprófita, o fungo pode infectar e causar doença em uma grande variedade de hospedeiros animais, como mamíferos, aves e insetos. O número de casos de micoses graves, causadas por C. neoformans e por outros gêneros de fungos, tem aumentado em todo o mundo, principalmente devido ao aumento do número de indivíduos imunocomprometidos. Adicionalmente, a emergência de novas espécies de patógenos e a seleção de linhagens tolerantes aos antifúngicos comumente utilizados fazem com que o desenvolvimento de novas estratégias para o controle de fungos seja extremamente desejável. A inativação fotodinâmica de fungos é um método novo e promissor, que pode ser utilizado tanto para o controle de micoses (em animais e em vegetais), como para a eliminação de fungos do ambiente. A fotoinativação de fungos é baseada no uso de fotossensibilizadores que se acumulam ou que são preferencialmente metabolizados pelas células do microrganismo-alvo. A seguir, o fotossensibilizador é exposto à luz visível, que, na presença de oxigênio, inicia processos fotoquímicos que produzem uma série de espécies reativas de oxigênio capazes de matar as células fúngicas sem provocar danos significativos nos tecidos do hospedeiro. Neste trabalho, foram avaliadas as eficácias do azul de metileno (MB) (em solução e em nanoemulsão), da cloro-alumínio ftalocianina (em nanoemulsão) e do complexo nitrosilo de rutênio (em solução) como fotossensibilizadores para a fotoinativação de células melanizadas e não melanizadas de C. neoformans. C. neoformans foi suscetível à fotoinativação pela cloro-alumínio ftalocianina, com uma inativação próxima de 100% quando foi utilizada uma combinação apropriada da concentração do fotossensibilizador e da dose de luz. A completa fotoinativação do fungo pela ftalocianina, em condições compatíveis com a terapia fotodinâmica, abre a perspectiva da utilização desse fotossensibilizador para o tratamento de micoses causadas por C. neoformans. A fotoinativação pelo MB foi apenas parcial e não ocorreu fotoinativação pelo nitrosilo de rutênio. Nenhum dos fotossensibilizadores matou o fungo na ausência da luz. Também foram feitos experimentos para se verificar a influência do tempo de crescimento e da melanização na tolerância de C. neoformans à fotoinativação pelo MB. Houve diferença significativa na tolerância entre diferentes linhagens de C. neoformans. Para a maioria dos tratamentos [linhagens e tempo de crescimento (4, 6 ou 8 dias)], não houve diferença significativa entre a tolerância de células melanizadas e não melanizadas. Também não foi observada diferença na tolerância entre células com idade de 4 a 8 dias. / The basidiomycete Cryptococcus neoformans is a saprophytic worldwide fungus which is normally isolated from soils contaminated with pigeon excreta and plant detritus. Despite a saprophytic existence, the fungus can infect and cause disease in a wide variety of animal hosts such as mammals, birds and insects. Serious infections caused by C. neoformans and by other genera of fungi have emerged all over the world, primarily due to the increased numbers of immunocompromised individuals. Additionally, the emergence of new species and antimycotic-resistant strains of pathogenic fungi makes the development of new fungus-control techniques highly desirable. Photodynamic inactivation of fungi is a new and promising method that can be used to control localized mycoses or kill fungi in the environment. The photodynamic inactivation of fungi is based on the use of a photosensitizer that accumulates in, or preferentially is metabolized by, cells of the target microorganism. The photosensitizer is then exposed to visible light in the presence of oxygen, and this starts photochemical processes that produce a series of reactive oxygen species (ROS) capable of killing the fungal cells without causing significant damage to host tissues. We report here the efficacy of methylene blue (MB) (in solution and in nanoemulsion), chloroaluminum phthalocyanine (in nanoemulsion) and nitrosyl ruthenium complex (in solution) as photosensitizers in photoinactivation of melanized and nonmelanized Cryptococcus neoformans yeast cells. C. neoformans were susceptible to photoinactivation by chloroaluminum phthalocyanine with inactivation close to 100% when the appropriate combination of photosensitizer concentration and light-exposure dose was used. Photoinactivation by MB was only partial and nitrosyl ruthenium complex was ineffective. In the dark, neither photosensitizers inactivated the fungus. Complementary experiments were performed to estimate the effect of the age of the cells and of melanization in the fungus tolerance to photoinactivation by MB. There was a significative difference in the tolerance among strains of C. neoformans. For most of the treatments (strains and time of growth) there was no difference between the tolerance of melanized and nonmelanized cells. There was no difference in the tolerance among 4 to 8-day cells either.