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A miosite por corpos de inclusão (inclusion body myositis - IBM), na sua forma esporádica, é considerada a miopatia adquirida mais comum após os 50 anos de idade. Embora seja incluída no grupo das miopatias inflamatórias, estudos recentes mostram um processo particular de degeneração muscular caracterizado por deposição anormal de agregados de proteínas nas fibras musculares e funcionamento anormal dos principais sistemas de degradação proteica. O objetivo deste estudo foi o de avaliar os aspectos clínicos, histológicos e imunoistoquímicos de pacientes com IBM. Avaliamos 18 casos com diagnóstico de IBM de dois dos principais centros de doenças neuromusculares do Brasil (25 biópsias musculares). Na tentativa de diferenciar os casos de IBM das outras miopatias inflamatórias, determinamos o padrão de expressão tecidual da p-tau (p62), alfa-sinucleína e TDP-43. Também foi avaliada a função lisossomal através da reação da fosfatase ácida (marcação da atividade lisossomal global) e determinação da marcação para LC3B (marcador de autofagia). Foi observado que a IBM predominou no sexo masculino (61% dos casos), da cor branca, com início das manifestações clínicas ao redor dos 59 anos de idade e os sintomas mais frequentes foram fraqueza muscular, instabilidade postural com quedas da própria altura, disfagia e perda ponderal, podendo ainda apresentar dispneia. O diagnóstico demorou em média 7,4 anos após o início dos sintomas e frequentemente esteve associada às seguintes comorbidades: hipertensão arterial sistêmica, diabetes mellitus tipo 2, osteopenia / osteoporose, dislipidemia e hiperuricemia / gota. O padrão de comprometimento muscular na IBM foi caracterizado por tetraparesia de predomínio proximal em membros inferiores e distal em membros superiores. Os valores séricos da creatinofosfoquinase em pelo menos uma das medições foram elevados em todos os pacientes, porém sem ultrapassar 10 vezes o limite superior da normalidade. O uso de imunossupressão não se mostrou eficaz nos pacientes com IBM. Os achados histológicos na IBM incluíram alterações distróficas variáveis com a presença de inflamação endomisial, assim como a ocorrência de vacúolos marginados, além da elevada frequência de alterações mitocondriais. Outros achados histológicos musculares característicos na IBM foram o aumento da atividade lisossomal (aumento global da marcação para fosfatase ácida), a presença de marcação positiva para beta-amilóide (marcação intra-vacuolar pelo vermelho-Congo), o aumento na degradação muscular (relacionada com ativação de LC3B, p-tau, e p62/SQSTM1) e a degeneração muscular (marcação para anti-phospo TDP-43 e para ?-sinucleína). Tais alterações apresentaram alta sensibilidade e especificidade. Sugerimos que a redução do critério de idade do início dos sintomas de mais de 45 anos para mais de 35 anos aumentaria a sensibilidade diagnóstica para os casos com IBM deste estudo de 83% para 100%. Com este estudo, foi possível caracterizar clínica e histológicamente pacientes com IBM em nosso meio, e fornecer indícios do benefício do uso de marcadores de degeneração e autofagia para o diagnóstico e para a determinação de vias ou sistemas celulares envolvidos na patogênese da doença / Sporadic inclusion body myositis (sIBM) is considered the most common acquired myopathy affecting adults aged over 50 years. Although included in the group of inflammatory myopathies, recent studies show a particular process of muscle degeneration characterized by abnormal deposit of protein aggregates in muscle fibers and abnormal operation of the main protein degradation systems. The aim of this study was to evaluate the clinical, histological and immunohistochemical patients with IBM. We evaluated 18 cases with IBM diagnostic of two of the main centers of neuromuscular diseases in Brazil (25 muscle biopsies). In an attempt to differentiate the IBM cases of other inflammatory myopathies, we determined the pattern of tissue expression of p-tau (p62), alfa-synuclein and TDP-43. Also evaluated the lysosomal function by acid phosphatase reaction (marking global lysosomal activity) and determining the markup for LC3B (autophagy marker). It was observed that IBM was predominant in males (61% of cases), white colored, with onset of clinical manifestations around 59 years old and the most common symptoms are muscle weakness, postural instability with high falls, dysphagia and weight loss, and may also present dyspnea. The diagnosis took an average of 7.4 years after the onset of symptoms and was often associated with the following comorbidities: hypertension, type 2 diabetes mellitus, osteopenia / osteoporosis, dyslipidemia and hyperuricemia / gout. The muscular damage pattern at IBM was characterized by tetraparesis predominantly proximal lower limbs and distal upper limbs. Serum creatine kinase levels in at least one of the measurements were elevated in all patients, but not exceeding 10 times normal. Immunosuppression was not effective in patients with IBM. The IBM histological findings included diversify dystrophic changes, endomysial inflammation, as well as the occurrence of rimmed vacuoles, in addition to high frequency of mitochondrial changes. Other characteristic muscle histological findings in IBM were increased lysosomal activity (overall increase in labeling for acid phosphatase), the presence of positive staining for beta-amyloid (intra-vacuolar by Congo red marking), increased muscle degradation (related to activation of LC3B, p-tau and p62 / SQSTM1) and muscle degeneration (marking for anti-phospo TDP-43 and ?-synuclein). Such changes have a high sensitivity and specificity. which makes these important complementary analyzes for accurate pathological diagnosis. We suggest that lowering the age of the onset of symptoms of greater than 45 years to older than 35 years would increase the diagnostic sensitivity for cases with IBM this study from 83% to 100%. With this study, it was possible to characterize clinically and histologically the patients with IBM in our centers, and provide evidence of the benefit of using degeneration and autophagy markers for diagnosis and for determining pathways or cellular systems involved in the pathogenesis of the disease

O Fator estimulador de colônias de granulócitos humano recombinante (rhG-CSF) produzido em Escherichia coli é uma proteína não glicosilada com 175 aminoácidos, de grande importância clínica para o tratamento de neutropenias. O presente trabalho propõe a construção de dois sistemas de expressão em E. coli, um sistema para obtenção do rhG-CSF no citoplasma e outro para secreção da proteína recombinante no meio de cultura utilizando a sequência sinal da L-asparaginase II. Os dois sistemas de expressão foram testados e comparados. A partir desses dados, passou-se para as etapas de obtenção do rhG-CSF com o sistema de expressão sem a sequência sinal. As etapas de renaturação e purificação foram eficientes obtendo-se uma proteína com adequado grau de pureza, integridade estrutural e atividade biológica. Essa proteína também foi utilizada com sucesso para a produção de anticorpos policlonais em camundongos. Com os resultados obtidos, a proteína rhG-CSF mostrou-se viável para estudos posteriores em bioreatores e produção em escala-piloto. / The recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) is a non-glycosylated protein with 175 amino acids. This factor plays an important role in hematopoietic cell proliferation and has been widely used for treating neutropenia. The purpose of this work is to construct two expression systems in E. coli; a system for obtaining rhG-CSF in the cytoplasm and the other for secretion of recombinant protein in the culture medium using the signal sequence of L-asparaginase II. The two expression systems were tested and compared. From these data, the next steps for obtaining the rhG-CSF were done with the expression system without the signal sequence. The refolding and purification steps were efficient, resulting in a protein with adequate purity, structural integrity and biological activity. This protein has also been successfully used for the production of polyclonal antibodies in mice. With these results, the protein rhG-CSF was feasible for further studies in bioreactors and pilot scale production.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19174号 / 医博第4016号 / 新制||医||1010(附属図書館) / 32166 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 髙橋 淳, 教授 村井 俊哉, 教授 渡邉 大 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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O vírus sincicial respiratório humano (HRSV) é o mais frequente agente patogênico da família Paramyxoviridae. Apesar de sua grande importância e impacto em saúde pública, alguns aspectos demandam elucidação. Entre eles, estão os mecanismos de tráfego intracelular de proteínas virais para o sitio de montagem. Baseado nisso, fizemos um estudo de imunofluorescência tentando contribuir para o entendimento da participação da via secretória no tráfego de proteínas estruturais de HRSV que não são glicosiladas: proteínas de matriz (M) e de nucleocapsídeo (N). Pudemos observar que essas proteínas seguem rota similar àquelas que são glicosiladas no Golgi, como a proteína de fusão (F). Ademais, as proteínas M e N, além de colocalizarem com proteínas celulares da via secretória, tais como trans-Golgi network-46 (TGN46) e sorting nexin-2 (SNX2), também influem no recrutamento de proteínas celulares para os corpos de inclusão virais, como mostrado no caso da proteína Glut1. Os dados indicam que proteínas M e N de HRSV seguem pela via endocítica inicial, acumulam-se em corpos de inclusão que seriam fábricas virais e, no caso de TGN46, podem ser incorporadas aos vírus em brotamento / Human respiratory syncytial virus (HRSV) is the most relevant cause of respiratory infection in children worldwide. Despite its importance in public health, some aspects of the mechanisms of the trafficking of viral structural proteins remain unclear. In the present study, immunofluorescence was used to understand how the virus matrix (M) and nucleocapsid (N) proteins, which are non-glycosylated , are addressed to inclusion bodies in Hep-2 cells (MOI=3). M and N proteins followed similar intracellular trafficking routes as compared to the glycosylated fusion (F) viral protein. Moreover, M and N proteins colocalized with two key elements of the secretory pathway: trans-Golgi network- 46 (TGN46) and sorting nexin-2 (SNX2). Viral proteins M and N appear to be involved in the recruitment of cell proteins at the formation of virus inclusion bodies, as shown for Glucose Transporter Type 1 (Glut1). The data suggest that HRSV M and N proteins follow the secretory pathway, initiating in early endosomes, as indicated by the co-localization with TGN46 and SNX2. In addition, these host cell proteins accumulate in inclusion bodies that are viral factories, and can be part of budding viral progeny. Therefore, HRSV M and N proteins, even though they are not glycosylated, take advantage of the secretory pathway to reach virus inclusion bodies. Confocal images suggest that SNX2, which is known for its membrane-deforming properties, could play a pivotal role in HRSV budding

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O vírus sincicial respiratório humano (HRSV) é o mais frequente agente patogênico da família Paramyxoviridae. Apesar de sua grande importância e impacto em saúde pública, alguns aspectos demandam elucidação. Entre eles, estão os mecanismos de tráfego intracelular de proteínas virais para o sitio de montagem. Baseado nisso, fizemos um estudo de imunofluorescência tentando contribuir para o entendimento da participação da via secretória no tráfego de proteínas estruturais de HRSV que não são glicosiladas: proteínas de matriz (M) e de nucleocapsídeo (N). Pudemos observar que essas proteínas seguem rota similar àquelas que são glicosiladas no Golgi, como a proteína de fusão (F). Ademais, as proteínas M e N, além de colocalizarem com proteínas celulares da via secretória, tais como trans-Golgi network-46 (TGN46) e sorting nexin-2 (SNX2), também influem no recrutamento de proteínas celulares para os corpos de inclusão virais, como mostrado no caso da proteína Glut1. Os dados indicam que proteínas M e N de HRSV seguem pela via endocítica inicial, acumulam-se em corpos de inclusão que seriam fábricas virais e, no caso de TGN46, podem ser incorporadas aos vírus em brotamento / Human respiratory syncytial virus (HRSV) is the most relevant cause of respiratory infection in children worldwide. Despite its importance in public health, some aspects of the mechanisms of the trafficking of viral structural proteins remain unclear. In the present study, immunofluorescence was used to understand how the virus matrix (M) and nucleocapsid (N) proteins, which are non-glycosylated , are addressed to inclusion bodies in Hep-2 cells (MOI=3). M and N proteins followed similar intracellular trafficking routes as compared to the glycosylated fusion (F) viral protein. Moreover, M and N proteins colocalized with two key elements of the secretory pathway: trans-Golgi network- 46 (TGN46) and sorting nexin-2 (SNX2). Viral proteins M and N appear to be involved in the recruitment of cell proteins at the formation of virus inclusion bodies, as shown for Glucose Transporter Type 1 (Glut1). The data suggest that HRSV M and N proteins follow the secretory pathway, initiating in early endosomes, as indicated by the co-localization with TGN46 and SNX2. In addition, these host cell proteins accumulate in inclusion bodies that are viral factories, and can be part of budding viral progeny. Therefore, HRSV M and N proteins, even though they are not glycosylated, take advantage of the secretory pathway to reach virus inclusion bodies. Confocal images suggest that SNX2, which is known for its membrane-deforming properties, could play a pivotal role in HRSV budding