Orientadores: Clarice Weis Arns, Helena Lage Ferreira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T04:15:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martini_MatheusCavalheiro_D.pdf: 16763908 bytes, checksum: 65c4aed6451181f383a10560fce87e51 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O vírus da Bronquite Infecciosa (VBI), pertencente à família Coronaviridae, é um importante patógeno à sanidade e fatores econômicos da produção avícola no Brasil e no mundo. O VBI possui múltiplos sorotipos e o frequente surgimento de novas variantes é um dos principais problemas relacionados a este vírus. Este trabalho tem como objetivo a investigação experimental da patogênese de um isolado de pombo (Columba/Brazil/2007/Unicamp/67T), caracterizado molecularmente pelo gene S1 como VBI sorotipo Massachusetts, e seus efeitos in vivo, em galinhas e camundongos. O presente estudo foi dividido em duas partes, na primeira um grupo de aves "specific pathogen free" (SPF) foi inoculado pela via óculo-nasal com a amostra viral proveniente de pombo. Os animais, de um dia de vida, foram sacrificados nos dias 2, 4, 5, 7, 9, 11, 14, 21, 28, 35 e 42 dias pós-inoculação (dpi). Foram coletados suabes de traqueia, seio nasal e cloaca, além de órgãos como pulmão, íleo, pró-ventrículo (coletado entre 7 e 21 dpi), rim, tonsilas cecais (coletada a partir de 4dpi) e testículos (coletado a partir de 5 dpi). Sinais clínicos respiratórios como espirros, estertores, corrimento nasal, além de letargia, diarreia e perda de coordenação foram observados principalmente no 5dpi. A inibição da atividade ciliar ocorreu concomitantemente ao pico de sinais clínicos das aves. Foi analisado tropismo tecidual, através da quantidade de RNA viral detectado, pelo trato digestório. Os maiores títulos de RNA viral foram detectados na tonsila cecal, seguida pelo íleo (ambos no 5dpi) e cloaca (no 2dpi). Além disso, houve detecção de RNA viral no rim e trato respiratório, com maior título de RNA viral na traqueia. Os órgãos que apresentaram maiores danos teciduais através do exame histopatológico foram o rim, íleo e traqueia (todos no 5dpi). Por fim, as aves inoculadas com a amostra do VBI oriundo de pombo produziram anticorpos entre os dias 14 e 21dpi, detectados no soro destes animais através do ELISA. Na segunda parte do trabalho, a capacidade de replicação de diferentes variantes do VBI em camundongos foi avaliada. Para tanto, camundongos das linhagens Balb/C e A/J foram inoculados pela via nasal com duas amostras do sorotipo Massachussets (Mass) e com a variante brasileira (BR-I), e sacrificados no 3, 10 e 14 dpi. Não foram observados sinais clínicos nem lesões macroscópicas graves. O RNA viral foi detectado em todos os órgãos coletados, sendo os principais órgãos de replicação o seio nasal e pulmão (no 3dpi) para os camundongos da linhagem A/J e pulmão e duodeno (ambos no 3dpi) na linhagem de camundongos Balb/C, nos quais os títulos virais detectados foram mais altos. Pneumonia intersticial, edema e infiltrado mononuclear foram as principais alterações histopatológicas observadas no 3dpi em camundongos inoculados com as diferentes variantes. A presença da nucleoproteína viral, pela imunohistoquímica, foi detectada no duodeno, traqueia e pulmão de camundongos no 3dpi nas duas linhagens de camundongos. Os anticorpos contra o coronavírus aviário foram detectados somente no 3dpi. Assim, os resultados do presente estudo demonstraram que a variante Massachussets, com origem de pombo, causa a doença clínica em aves comerciais não vacinadas e pode replicar em modelo mamífero por um curto período de tempo, ressaltando a importância da vacinação e o papel potencial dos roedores como possível reservatório e carreador do vírus / Abstract: Infectious bronchitis virus (IBV) belonging to the family Coronaviridae is an important pathogen to sanity and economics of poultry production in Brazil and worldwide. The VBI has multiple serotypes and the frequent emergence of new variants is one of the main problems related to this virus. This work aims to experimentally investigate the pathogenesis of pigeon sample (Columba/Brazil/2007/Unicamp/67T), molecularly characterized by S1 gene as IBV Massachusetts serotype, and its effects in vivo in chickens and mice. This study was divided into two parts. In the first part, a group of birds "specific pathogen free" (SPF) was inoculated by oculo-nasal route with the viral sample from pigeon. The animals with one-day-old, were sacrificed on 2, 4, 5, 7, 9, 11, 14, 21, 28, 35 and 42 days post-inoculation (dpi). Tracheal swabs, nasal sinus and cloaca were collected, and organs such as lung, ileum, pro-ventricular (collected between 7 and 21dpi), kidney, caecal tonsils (collected from 4dpi) and testes (collected from 5 dpi). Clinical signs such as sneezing, rales, nasal discharge, lethargy, diarrhea, and loss of coordination were observed mainly in the 5dpi. Inhibition of ciliary activity occurred concomitantly with the peak of clinical signs of birds. Tissue tropism was analyzed by the amount of viral RNA detected by the gastrointestinal tract. The higher titers of viral RNA were detected in the cecal tonsil, followed by the ileum (both in 5dpi) and cloaca (in 2dpi). In addition, viral RNA was detected in the kidney and respiratory tract, with highest titer of viral RNA in the trachea. The organs that showed severe tissue damage by histopathology were the kidney, ileum and trachea (all in 5dpi). Finally, the birds inoculated with the sample originated from IBV Pigeon produced antibodies between 14 and 21dpi, detected in the serum of these animals by ELISA. In the second part, the replication capacity of different variants of IBV in mice was evaluated. For this, mice of strains BALB/C and A/J were inoculated intranasally with two strains of Massachusetts (Mass) serotype and the Brazilian variant (BR-I), and sacrificed at 3, 10 and 14 dpi. No clinical signs or severe macroscopic lesions were observed. The viral RNA was detected in all organs collected, higher tittles were detected on sinus and lung (in 3dpi) for mice of strain A/J and on lung and duodenum (both in 3dpi) in the line of Balb/C; in this line the viral titles were higher than the strain A/J. Interstitial pneumonia, edema and mononuclear cell infiltration were the main histopathological changes observed in 3dpi in inoculated mice with different variants. The presence of viral nucleoprotein, immunohistochemistry was detected in the duodenum, trachea and lungs of mice in 3dpi in both mice strains. Antibodies against avian coronaviruses have been detected only in 3dpi. Thus, the results of this study demonstrate that the Massachusetts variant, originating from pigeon, cause clinical disease in commercial poultry unvaccinated and can replicate in mammalian model for a short period of time, emphasizing the importance of vaccination and the potential role of rodents as possible reservoir and the carrier virus / Doutorado / Microbiologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-04-18T14:52:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2107997 bytes, checksum: 9af3c7a1788cd5f34e07226a97b0fc13 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-18T14:52:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2107997 bytes, checksum: 9af3c7a1788cd5f34e07226a97b0fc13 (MD5) Previous issue date: 2015-07-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A criação de aves em sistemas industrializados vem adquirindo, mundialmente, características que envolvem uma elevada densidade animal, o que, consequentemente, leva ao surgimento de condições epidemiológicas capazes de predisporem ao aparecimento de problemas sanitários. Diante deste contexto, aumenta-se a preocupação com as doenças infecciosas, dentre elas, a Bronquite Infecciosa das Galinhas (BIG), cujo agente etiológico é o Infectious bronchitis virus (IBV). O presente estudo teve como objetivo reconstruir a epidemiologia molecular do IBV, por meio de análises filogenéticas e filogeográficas dos genes estruturais N e S1, para estudo da evolução viral. Estas informações são importantes para estabelecer um padrão de dispersão em um contexto histórico geográfico, entender eventos biológicos no passado relacionados à dinâmica populacional e ajudar no desenvolvimento de estratégias efetivas de controle do IBV. Para isso, foram montados dois bancos de dados com sequências moleculares completas e parciais dos genes N e S1 obtidos no GenBank. O primeiro banco de dados (IBV1) contemplou sequências completas de S1 (N=256) e N (N=154) e o segundo banco de dados (IBV2) foi montado com sequências parciais de S1 (N=390) e N (N=173). Importantes parâmetros para estudo da evolução viral foram analisados nesse trabalho para os genes S1 e N do IBV, incluindo estimativas de eventos de recombinação, taxa de mutação, pressão de seleção, dinâmica populacional e dispersão espacial. Os resultados apontam que, na ausência de uma elevada taxa de mutação e pelo fato da seleção purificadora ser a principal forma de seleção natural no IBV, o processo de recombinação tem um papel fundamental na evolução do IBV. As análises de dinâmica populacional sugerem que, até meados da década de 2000, os diferentes programas de vacinação, juntamente com os métodos de biosseguridade, foram eficazes para controlar o crescimento do tamanho efetivo populacional do IBV. Contudo, a partir de 2007, o aumento da população de variantes do IBV, pode indicar que os protocolos vacinais, usados no presente, não estão sendo mais eficazes. Os resultados das análises de dispersão viral do gene S1 e N foram analisados de forma conjunta, a fim de reconstruir um padrão de dispersão do IBV ao longo de sua história evolutiva. O ponto de origem de todas as cepas atuais do IBV foi a China que, após dispersão local, disseminou para os Estados Unidos e, por conseguinte, se dispersou para diferentes países e continentes até alcançar a ampla distribuição mundial encontrada nos dias atuais. Os principais centros de dispersão atuais do IBV foram a China, Estados Unidos, Brasil, Taiwan e Europa. / The intensification of poultry in industrial systems has acquired, worldwide, features that involve a high stock density, which, consequently, leads to the emergence of epidemiological conditions that may predispose to the appearance of health problems. Given this context, the concern with infectious diseases increases, among the diseases is the Avian Infectious Bronchitis (IB), whose etiologic agent is the Infectious bronchitis virus (IBV). This study aimed to reconstruct the molecular epidemiology of IBV through phylogenetic and phylogeographic analyzes of structural genes N and S1, to the study of viral evolution. These pieces of information are important to establish a pattern of dispersion in a geographical historical context, to understand biological events in the past related to population dynamics and to help develop effective strategies for control of IBV. To establish a better outlook for discussion of IBV molecular epidemiology, there were created two databases with complete and partial molecular sequences of genes N and S1 obtained from GenBank. The first database (IBV1) considered complete sequences of the S1 (N = 256) subunit and of the N (N = 154) gene of IBV. To increase the extension of countries from which sequences are available, a second database (IBV2) was created with partial sequences of the S1 (N = 390) gene and the N (N = 173) gene. Important parameters for the study of viral evolution were analyzed in this work for the S1 and N genes of the IBV, including estimates of recombination events, mutation rate, selection pressure, population dynamics and spatial dispersion. The results show that, in the absence of a high mutation rate and because of the purifying selection to be the main form of natural selection in IBV, the recombination process plays a key role in the evolution of IBV. The analysis of population dynamics suggest that, until the mid-2000s, the different vaccination programs, along with the biosecurity methods have been effective in controlling the growth of effective population size of the IBV. However, since 2007, the increase in the population of IBV variants may indicate that the vaccine protocols, used in the present, have not been effective anymore. The results of analyzes of the viral spread of the gene S1 and N were analyzed together, in order to reconstruct a pattern of the IBV dispersion along its evolutionary history. The point of origin of all current strains of IBV was China, which after local dispersion spread to the United States of America and thus dispersed to different countries and continents until reaching the worldwide distribution found today. The current main scattering centers of the IBV were China, the United States, Brazil, Taiwan and Europe.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-04-27T14:27:09Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1652814 bytes, checksum: eb04b97fc0b892ebed6c35181487174a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T14:27:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1652814 bytes, checksum: eb04b97fc0b892ebed6c35181487174a (MD5) Previous issue date: 2015-08-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Infectious bronchitis virus (IBV) é uma das principais causas de perdas econômicas na indústria avícola, afetando galinhas de todas as idades, apesar das tentativas de controle por vacinação. Os objetivos deste estudo de três capítulos propôs-se: 1) analisar a composição genética das vacinas vivas H120 e Ma5 de IBV disponíveis comercialmente no Brasil, 2) promover a caracterização molecular de IBV acometendo um plantel de matrizes e, 3) investigar persistência viral nesse lote ao final do ciclo de produção e verificar a ocorrência de transmissão vertical. No capítulo 1 foi obtida a sequência completa do gene S1 das vacinas produzidas por diferentes laboratórios, sendo verificada que as vacinas H120 possuem subpopulações de IBV distintas, refletindo em até 14 diferenças na sequência de aminoácidos entre as vacinas. Na análise do cromatograma de S1 obtida da vacina Ma5 também foi detectado pico secundário, sugerindo a presença de subpopulação do vírus. Para abordar essa questão foi desenvolvido um sistema para identificar a população de espécies de RNA dessa vacina. Apesar de ser clonada foram identificadas pelo menos cinco subpopulações do vírus intra-vacina. Portanto, essa grande diversidade genética entre as vacinas poderia justificar os diferentes resultados da vacinação. No capítulo 2, a sequência parcial de S1 de IBV foi obtida diretamente de amostras clínicas. A vacina Ma5, previamente utilizada nesse lote, foi detectada na traqueia e no intestino delgado; enquanto subpopulação de IBV variante foi identificada em órgão específico das aves. Esse achado tem grande importância sob o ponto de vista aplicado porque ele ilustra o potencial repertório patogênico que a infecção por IBV de campo pode imputar sobre um lote de galinhas acometidas pela doença. Finalmente, no capítulo 3, diferentes órgãos dessas galinhas em final de produção e líquido cório-alantoide (LCA) de embriões vivos com 18 dias de incubação oriundos desse lote foram utilizados para a detecção e identificação de IBV. A vacina Ma5 foi detectada no intestino delgado, rins e oviduto das galinhas e no LCA de embriões. No entanto, nas tonsilas cecais foi detectado IBV com significativa diferença genética na comparação com a vacina Ma5 previamente utilizada e aqueles identificados nos diferentes órgãos das aves na época da doença. Esses achados sugerem que além da vacina, outras subpopulações de IBV podem persistir por longos períodos no hospedeiro e, pelo menos em galinhas em final de produção a vacina Ma5 pode ser transmitida verticalmente. / Infectious bronchitis virus (IBV) is a major cause of economic losses in the poultry industry, affecting chickens of all ages, despite attempts to control by vaccination. The objectives of this three-chapter study were: 1) analyze the genetic makeup of the 120 and Ma5 IBV vaccines strains available commercially in Brazil, 2) promote the molecular characterization of IBV affecting one broiler breeding flock and, 3) to investigate IBV persistence in this flock at the end of the production cycle and to verify the occurrence of vertical transmission. In chapter 1, the complete sequence of the S1 gene of vaccines produced by different laboratories was obtained and verified that the vaccines of the strain H120 have different subpopulations, resulting in up to 14 amino acid sequence substitutions among the vaccines. On the other hand, the analysis of Ma5 strain S1 gene an additional peak was detected suggesting the presence of subpopulation of the virus. To address this issue a system to identify the population of RNA species of the vaccine was developed. Despite being cloned, at least five subpopulations of genotypes were detected with in a Ma5 batch. Therefore, this great genetic diversity among the vaccines could justify the different vaccination reactions/results. In chapter 2, partial sequence of S1 of the IBV was obtained directly from clinical specimens. In alignment with the Ma5, which was previously used therein, the same was detected in the trachea and small intestine; while subpopulation of IBV variant was identified in specific organ of birds. This finding has great importance from the applied point of view because illustrates the potential pathogenic repertoire that infection by field IBV can charge on the same lot of chickens affected by the disease. Finally, in chapter 3, different organs of breeders at the end of production and allantoic fluid of embryos with 18 days of incubation deriving this flock were used for the detection and identification of IBV. The Ma5 vaccine was detected in small intestine, kidneys and oviduct of the chickens, and also in the allantoic fluid embryos. However, in the cecal tonsils, IBV was detected in significant genetic difference in comparison with the previously used Ma5 vaccine and those detected in different organs of the birds at the time of disease. These results suggest that in addition to vaccine, other (s) subpopulation (s) of IBV can persist for long periods in the lost least chickens at the end of production Ma5 vaccine can be transmitted vertically.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-07-04Bitstream added on 2014-06-13T18:31:25Z : No. of bitstreams: 1 luciano_rl_me_jabo.pdf: 288271 bytes, checksum: 77640cc158f0c12048ecdaf245801057 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Um método de diagnóstico baseado na associação entre as técnicas de RT-PCR e ELISA foi desenvolvido para a detecção do vírus da bronquite infecciosa das aves (VBI). Inicialmente, a especificidade e a sensibilidade analíticas dessa técnica, bem como dos métodos de RT-PCR e Nested-RT-PCR, foram determinadas, tendo-se demonstrado, para o primeiro parâmetro, apenas a detecção do VBI, enquanto que outros vírus heterólogos aviários testados, tais como pneumovírus aviário (APV / estirpe do grupo B), vírus da doença de Newcastle (NDV / estirpe La Sota) e vírus da doença de Gumboro (GDV - estirpe Lukert), não foram detectados. Quanto à avaliação da sensibilidade analítica dos métodos empregados neste estudo foi constatado que o RT-PCR-ELISA demonstrou ser 10 vezes mais sensível do que a RT-PCR, enquanto que a reação de Nested-PCR foi 100 vezes mais sensível que a RT-PCR e 10 vezes mais sensível que o RT-PCR-ELISA. A técnica de RT-PCR-ELISA, juntamente com os outros dois métodos de biologia molecular, foram aplicadas para a detecção das estirpes H-120 e A034 do VBI, em amostras de pulmão e traquéia obtidas de aves experimentalmente infectadas com essas duas estirpes virais. Os resultados obtidos nos diferentes métodos de biologia molecular foram comparados entre si e com a técnica padrão de isolamento viral em ovos embrionados, verificando-se que o RT-PCR-ELISA revelou-se tão específico quanto as técnicas de isolamento viral e Nested-PCR, porém foi menos sensível do que esses mesmos métodos na detecção do VBI. A técnica de RT-PCR-ELISA, utilizada pela primeira vez para o VBI, demonstrou o potencial de se constituir uma alternativa viável para um diagnóstico direto mais rápido e específico do VBI. / A molecular biology method for the detection of avian infectious bronchitis virus (IBV) was developed combining the reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Firstly, the analytical specificity and sensitivity of RT-PCR-ELISA, RT-PCR and Nested-RT-PCR were assessed. The specificity of these methods were confirmed since only IBV was detected, while other heterologous avian viral pathogens such as pneumovirus (Group B), Newcastle disease virus (LaSota strain) and gumboro disease virus (Lukert strain) were not detected by these techniques. The sensitivity of these methods was established, indicating that the RT-PCR-ELISA was about ten times more sensitive than conventional RT-PCR, while Nested-PCR was a hundred more sensitive than RT-PCR and ten times more sensitive than PCR-ELISA. The RT-PCR-ELISA and the two molecular biology methods were also applied for the detection of IBV strains H-120 and A034, in lung and tracheal tissue samples collected from experimentally infected chickens. The results of these different methods were also compared with the standard diagnostic technique, the virus isolation in chicken embryonated eggs, showing that RT-PCR-ELISA was as specific as virus isolation and Nested-PCR, however it was less sensitive than these methods for the IBV detection. The RT-PCR-ELISA, applied for the first time for IBV detection and direct diagnosis in tissue samples, can be potentially applied as an useful alternative for the rapid and specific diagnosis of IBV.

Infectious bronchitis virus (IBV) is a member of family Coronaviridae and is classified into group 3 of the Coronaviruses. The virus is a single-stranded positive-sense RNA virus with a genome of 27kbp. IBV is a highly infectious disease of chickens that results in high morbidity with moderate to severe mortality depending on the strain involved, age of the birds, and immune status of the chickens. Multiple worldwide investigations indicate that differentiation within the S1 glycoprotein gene can lead to serotype variation within the IBV species. In this study 46 isolates collected over two years from broiler and broiler breeder flocks and eight historical isolates were analyzed. Forty one isolates originated from the KwaZulu-Natal region whilst the remaining thirteen were isolated from 4 other poultry-dense provinces. The S1 gene was sequenced and compared to determine variation between South African isolates, as well as global sequences submitted to Genbank. The results indicate the division of isolates analyzed into 2 different clades of IBV within the province. The most prevalent genotype was similar to IBV Mass strain detected in 79% of the full S1 sequences. Variation up to 22.3% was detected within local strains, supporting the hypothesis that multiple IBV serotypes may co-circulate in the same region simultaneously. Additionally, more conservation was observed among Mass serotypes versus QX-like serotypes, implying that vaccine use can influence the variability within the IBV population. Higher variability was found in the first half of the S1 gene in comparison to the last half of the S1 gene. This is in agreement with previous findings that the hypervariable regions of the S1 gene are located within the first 450 base pairs. This study offers the first published consolidation of IBV isolates from South Africa and identifies variation within the IBV population of the SA broiler flock. Previous publications list four or five IBV isolates whilst this study describes variation found in 54 isolates spanning 32 years. In addition this study provides the insight into the prevalence of IBV variation in poultry flocks due to the large number of isolates. The comparative use of geno- and serotyping for South African IBV isolates is also described for the first time in this study. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2013. / gm2014 / Veterinary Tropical Diseases / unrestricted

Coronavírus, incluindo-se o Coronavírus aviário (ACoV), possuem o maior genoma composto por RNA conhecido entre os vírus. Aproximadamente dois terços desse genoma codificam proteínas não estruturais (Nsps), cujas funções parecem estar associadas à replicação e patogênese viral. Até o momento, esses alvos têm sido pouco explorados quanto a sua diversidade em diferentes linhagens de ACoV. O presente estudo teve como objetivo investigar a diversidade dos genes codificadores das proteínas não estruturais Nsp2 e protease Papaína-like (Plpro), utilizando-se linhagens brasileiras de ACoV. Para tanto, 10 linhagens de ACoV, isoladas em ovos embrionados, foram submetidas à RT-PCR direcionada aos genes codificadores de Plpro e Nsp2, seguindo-se o sequenciamento de DNA e a análise filogenética, juntamente com sequências homólogas obtidas no GenBank. Além disso, realizou-se a genotipagem por meio do sequenciamento parcial do gene codificador da proteína de espícula (região S1). Três das amostras virais obtidas e investigadas no presente trabalho apresentaram padrão de segregação discordante para os genes estudados. O isolado CRG I22 agrupou-se com linhagens virais pertencentes ao genótipo Massachusetts para S1 e com o grupamento de ACoVs brasileiros os genes da Nsp2 e Plpro. O isolado CRG I33 agrupou-se com linhagens virais pertencentes ao genótipo brasileiro para s1 e plpro e de maneira divergente para o gene da Nsp2. Para o isolado CRG I38, não foi obtida a genotipagem por s1, entretanto, similarmente ao observado para o isolado CRG I33, esse isolado agrupo-se com linhagens virais brasileiras para o gene plro e de maneira independente para o gene nsp2. As demais linhagens estudadas resultaram na formação de um grupamento especificamente brasileiro de ACoV, para os três genes estudados. Esses achados sugerem a ocorrência de recombinação nessas amostras discrepantes. Quanto às identidades médias entre as sequencias nucleotídicas analisadas, a região de s1 analisada apresentou as menores identidades (73,75% ±16,78), seguido pelo gene plpro (88,06% ±5,7) e do gene nsp2 (92,28% ±4,37), em acordo com a literatura. Assim sendo, os alvos investigados podem constituir ferramentas úteis na epidemiologia molecular do ACoV e na investigação de linhagens recombinantes do vírus. O presente estudo é o primeiro a investigar a diversidade genética de genes codificadores de proteínas não-estruturais em linhagens brasileiras de ACoV. Os resultados aqui apresentados reforçam a existência de um genótipo brasileiro de ACoV, para os 3 genes estudados. Entretanto, discrepâncias pontuais encontradas no padrão genotípico para s1, nsp2 e nsp3 permitem inferir uma diversidade genética maior do que a conhecida até o momento, possivelmente resultante de eventos de recombinação entre ACoVs brasileiros, ACoVs vacinais e outros ainda desconhecidos. Os resultados obtidos auxiliam na compreensão dos padrões e evolução dos ACoVs / Coronaviruses, including Avian coronavirus (ACoV), have the largest known RNA genome. Nearly two thirds of its genome codes for non-structural proteins (Nsps), whose functions appear to be linked to viral replication and pathogenesis. Hitherto these targets have been poorly explored regarding the ACoV lineages diversity. The present study aimed to assess the diversity of non-structural protein 2 (nsp2), papain-like protease (plpro) and spike protein (S1 subunit) coding genes, in Brazilian ACoV strains. To this end, 10 ACoV strains, isolated in embryonated eggs, had its 3rd and 5th passages submitted to RT-PCR targeting nsp2, plpro and s1, followed by DNA sequencing and phylogenetic analysis, herewith homologous sequences obtained from GenBank. Three of the ACoV strains sequenced showed a discordant segregation pattern for target genes. CRG I22 strain clustered with Massachusetts genotipe strains for S1, and with Brazilian cluster for nsp3 and plpro genes. CRG I33 strain, clustered with Brazilian strains for S1 and plpro genes, and was divergent for nsp2 gene. For CRG I38 strain, the S1 sequence was not obtained, however, similarly to what was observed for CRG I33, this strain grouped with the Brazilian lineage for plpro gene and was divergent for nsp2 gene. All the other ACoV here sequenced resulted in a specific Brazilian cluster for the three studied genes. Regarding the mean nucleotide identities measured, s1 gene showed the lowest identity (73.75% ±16.78), followed by plpro gene (88.06% ±5.7) and nsp2 gene (92.28% ±4.37), in accordance with previous reported data. Therefore, the targets of the present study are useful tools for ACoV molecular epidemiology studies and for the survey of recombinant ACoV strains. The presented study is the first one investigating the molecular diversity of non-structural proteins coding genes in Brazilian strains of ACoV. Results achieved herein reinforce the data over the circulation of ACoV Brazilian strains in this country, for the three investigated genes. However, divergences found between S1, nsp2 and plpro genetic patters allow inferring a higher molecular diversity than previously known. It is possible that this divergence is due to recombination events between ACoV from vaccines, Brazilian field strains and others still unknown. These results contribute on the comprehension over genetic patters and evolution of ACoV

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-22Bitstream added on 2014-06-13T18:44:27Z : No. of bitstreams: 1 caetano_ag_dr_jabo.pdf: 1343619 bytes, checksum: 387f2f16ea3939c118f65585ece520a6 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O vírus da Bronquite infecciosa (VBI) é um Coronavírus aviário que infecta aves domésticas de corte e postura, ocasionando grandes perdas econômicas na indústria avícola. Dada a natureza altamente contagiosa e aguda da doença, há uma grande necessidade do desenvolvimento de métodos diagnósticos que possam ajudar na detecção e/ou caracterização de estirpes variantes do VBI. Sendo assim, para auxiliar no diagnostico laboratorial da infecção, foi construída uma biblioteca de fragmentos de anticorpos monoclonais pela técnica de Phage-display. Para tanto, após a imunização de galinhas com a estirpe vacinal H120, foi extraído o RNA total do baço das aves imunizadas e amplificadas as cadeias variáveis leve e pesada que foram unidas por linker, originando o fragmento gênico de cadeia única scFv. Após a realização de três ciclos de seleção foram obtidos 400 clones que foram avaliados em ensaios de ELISA e Western blotting para averiguação da especificidade dos mesmos frente às proteínas da estirpe H120. Após realização dos testes foram selecionados dois clones, um que apresentou grande reatividade para com a proteína de nucleocapsídeo (N) (scFv-N) e o outro com reatividade para com a subunidade 1 da glicoproteína de superfície (S) (scFv-S1). O anticorpo scFv-S1 quando utilizado em ensaio de vírus-neutralização em ovos embrionados mostrou titulo significativo de proteção. Já em testes de ELISA utilizando estirpes de referência e isolados brasileiros de campo do VBI, o anticorpo scFv-N foi capaz de detectar todas as estirpes (H120, M41, Arkansas, IBVPR05, IBVPR02, IBVPR01, IBVSC01), enquanto que o scFv-S1 pode discriminar as estirpes pertencentes ao sorotipo Massachusetts (H120, M41 e IBVSC01) das demais estirpes variantes avaliadas. Os fragmentos de anticorpos scFv-N e scFv-S1 também mostraram bons resultados quando utilizados na técnica... / Infectious bronchitis virus (IBV), the coronavirus of the chicken, is one of the main causes of economic loss within the poultry industry, affecting the performance of meattype and egg-laying domestic fowls. Given the highly contagious and acute nature of the disease, there is an urgent need for the development of diagnostic assays that can detect and/or characterize IBV strains. In order to improve the laboratory diagnosis of IBV infection, phage-displayed recombinant antibody library derived from splenic mRNA of chickens immunized with H120 vaccine strain of infectious bronchitis virus (IBV) was constructed as single chain variable fragments (scFv) by overlap extension polymerase chain reaction (PCR) of the individual heavy (VH) and light (VL) chain variable gene segments. After three rounds of panning selection, ten scFv phage display antibodies of 400 randomly chosen clones were demonstrated to react with IBV antigens by ELISA. The western blot analysis selected two scFv antibodies reacting strongly with nucleocapsid (N) (scFv-N) protein or subunit 1 of spike glycoprotein (S1) (scFv-S1) of IBV. The anti-S1 scFv antibody showed a significant neutralization titre in embryonating chicken egg test. In ELISA analysis using reference IBV strains and Brazilian field isolates, the anti-N scFv antibody was able to detect all strains (H120, M41, ARKANSAS, IBVPR05, IBVPR02, IBVPR01, IBVSC01), while the anti-S1 could discriminate Massachusetts serotype (H120, M41 and IBVSC01) between variant strains. A scFv-based indirect immunoperoxidase (IP) procedure was also applied to detect infectious bronchitis virus (IBV) antigens in formalin-fixed tracheal tissue sections. Thus, the results showed that scFv-N and scFv-S1 antibodies can be used for the detection and differentiation of IBV strains.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-20Bitstream added on 2014-06-13T18:44:31Z : No. of bitstreams: 1 gibertoni_am_dr_jabo.pdf: 1047291 bytes, checksum: 9be7492afd065b969b043d3a6d16e4be (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Foram realizadas a clonagem e expressão do gene da nucleoproteína (N) de uma estirpe vacinal de referência M41 do vírus da bronquite infecciosa (VBI), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina na extremidade carboxi-terminal, em 2 sistemas hospedeiros; na levedura metilotrófica, Pichia pastoris e na bactéria Escherichia coli. A proteína N derivada de um isolado variante do VBI de surtos a campo no Brasil, também foi expressa em E. coli. As características bioquímicas e imunoquímicas de tais proteínas recombinantes, foram determinadas, tendo sido evidenciado maior eficiência de produção no sistema hospedeiro constituído por E. coli, comparativamente ao sistema composto por P. pastoris. Uma vez obtidas, caracterizadas e purificadas, através da técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel-sepharose, as preparações de proteína N recombinante expressas em E. coli e derivadas ou da estirpe de referência M41 ou do novo isolado de campo no Brasil, foram utilizadas de forma bem sucedida, como antígenos alvo de ensaios indiretos de ELISA, que foram aplicados na detecção e mensuração de anticorpos dos isótipos IgG e IgM em aves infectadas com estirpes homóloga ou variantes do VBI. Foi, também, investigada a atividade imunogênica da proteína N recombinante em aves, que depois de imunizadas e re-imunizadas com essas proteínas recombinantes, produziram no soro sanguíneo e na secreção lacrimal quantidades elevadas de anticorpos anti-VBI específicos, mas não desenvolveram proteção efetiva contra o desafio com a estirpe homóloga desse vírus. Concluindo, a proteína N recombinante do VBI expressa pela E. coli possui elevada imunogenicidade, no sentido de induzir altos níveis de anticorpos específicos, e reatividade cruzada com proteínas N de outras variantes desse vírus, tendo um grande potencial de ser aplicada em... / Two host systems, represented by Escherichia coli and Pichia pastoris were used for cloning and protein expression of the nucleoprotein (N) gene of M41 strain of infectious bronchitis virus (IBV) as a fusion recombinant protein containing a poli-histidine tag. The N protein from a new variant Brazilian field isolate was also cloned and expressed by E. coli system. The biochemical and immunochemical properties of these recombinant N proteins were determined and higher efficiency on protein production was achieved by using the E. coli expression system. Both recombinant N proteins expressed by E. coli were purified in nickel-sepharose resin and used as antigen in indirect ELISA methods for the detection of IgG and IgM antibodies in birds infected with homologous and variant IBVs. The immunogenicity of N recombinant protein was also evaluated by immunizing and re-immunizing birds and high antibody levels were generated in lachrymal secretion and serum, but no effective protection against challenge with homologous virulent stain of IBV was induced. Concluding, the recombinant N IBV protein expressed by E. coli is highly immunogenic for inducing specific and crossreactive antibodies, and can be applied in the immuno-diagnosis of IB

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Banca: José Moacir Marin / Banca: Eduardo Hilário / Banca: Maria da Glória Buzinaro / Resumo: Foram realizadas a clonagem e expressão do gene da nucleoproteína (N) de uma estirpe vacinal de referência M41 do vírus da bronquite infecciosa (VBI), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina na extremidade carboxi-terminal, em 2 sistemas hospedeiros; na levedura metilotrófica, Pichia pastoris e na bactéria Escherichia coli. A proteína N derivada de um isolado variante do VBI de surtos a campo no Brasil, também foi expressa em E. coli. As características bioquímicas e imunoquímicas de tais proteínas recombinantes, foram determinadas, tendo sido evidenciado maior eficiência de produção no sistema hospedeiro constituído por E. coli, comparativamente ao sistema composto por P. pastoris. Uma vez obtidas, caracterizadas e purificadas, através da técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel-sepharose, as preparações de proteína N recombinante expressas em E. coli e derivadas ou da estirpe de referência M41 ou do novo isolado de campo no Brasil, foram utilizadas de forma bem sucedida, como antígenos alvo de ensaios indiretos de ELISA, que foram aplicados na detecção e mensuração de anticorpos dos isótipos IgG e IgM em aves infectadas com estirpes homóloga ou variantes do VBI. Foi, também, investigada a atividade imunogênica da proteína N recombinante em aves, que depois de imunizadas e re-imunizadas com essas proteínas recombinantes, produziram no soro sanguíneo e na secreção lacrimal quantidades elevadas de anticorpos anti-VBI específicos, mas não desenvolveram proteção efetiva contra o desafio com a estirpe homóloga desse vírus. Concluindo, a proteína N recombinante do VBI expressa pela E. coli possui elevada imunogenicidade, no sentido de induzir altos níveis de anticorpos específicos, e reatividade cruzada com proteínas N de outras variantes desse vírus, tendo um grande potencial de ser aplicada em ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Two host systems, represented by Escherichia coli and Pichia pastoris were used for cloning and protein expression of the nucleoprotein (N) gene of M41 strain of infectious bronchitis virus (IBV) as a fusion recombinant protein containing a poli-histidine tag. The N protein from a new variant Brazilian field isolate was also cloned and expressed by E. coli system. The biochemical and immunochemical properties of these recombinant N proteins were determined and higher efficiency on protein production was achieved by using the E. coli expression system. Both recombinant N proteins expressed by E. coli were purified in nickel-sepharose resin and used as antigen in indirect ELISA methods for the detection of IgG and IgM antibodies in birds infected with homologous and variant IBVs. The immunogenicity of N recombinant protein was also evaluated by immunizing and re-immunizing birds and high antibody levels were generated in lachrymal secretion and serum, but no effective protection against challenge with homologous virulent stain of IBV was induced. Concluding, the recombinant N IBV protein expressed by E. coli is highly immunogenic for inducing specific and crossreactive antibodies, and can be applied in the immuno-diagnosis of IB / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-06Bitstream added on 2014-06-13T20:16:37Z : No. of bitstreams: 1 piza_vmt_me_jabo.pdf: 496784 bytes, checksum: 8e82f3b02d746dfe3daa52fd23b8be9e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Nesse estudo foi desenvolvido e aplicado o procedimento de imunocaptura para realizar a reação de transcrição reversa seguida pela reação em cadeia da polimerase (IC-RT-PCR) a fim de ser amplificada uma região 5'_ proximal do gene 81 do vírus da bronquite infecciosa (VBI) com 228 pb e de forma a fazer a detecção e a diferenciação desse vírus, comparando-se os resultados dessa metodologia com os obtidos na técnica convencional de RT-PCR. Todas as 11 estirpes do VBI testadas foram amplificadas pelas duas técnicas moleculares, enquanto que nenhum dos vírus heterólogos (Pneumovírus Aviário do grupo A e B, Vírus da Doença de Gumboro e o Vírus da Doença de Newcastle) ensaiados levaram a amplificação específica do gene 81. O limiar de detecção para a técnica de IC-RT-PCR foi idêntico ao do método de RT-PCR e correspondeu a 102.8 Doses Infectantes Embrionárias 50%. Para um total de 35 amostras de tecidos do trato respiratório testadas e provenientes de aves infectadas experimentalmente, 32 foram positivas pela técnica de IC-RT-PCR e também pela RT-PCR convencional, enquanto que o isolamento viral foi obtido para 22 dessas amostras. A análise do produto amplificado do gene 81 na IC-RT-PCR através da técnica de RFLP (restriction fragment length polymorphism), com as enzimas Alul e Mboll, permitiu a diferenciação das 5 estirpes de referências e dos 6 isolados de campo analisados em 4 diferentes genótipos, correspondentes às estirpes de referência M41, Connecticut, ou 8E-17, ou a um isolado de campo. Portanto, a técnica de IC¬RT -PCR demonstrou um grande potencial para ser aplicada no diagnóstico direto do VBI, apresentando vantagens sobre a técnica convencional de RT-PCR, as quais foram derivadas da combinação da especificidade da imunocaptura em fase sólida com a sensibilidade da reação de PCR, o que pode proporcionar ganho de tempo e menor custo para a manipulação de um maior número de amostras. / In this study, the immunocapture procedure followed by reverse transcription and polymerase chain reaction (IC-RT-PCR) technique was standardized and applied for the amplification of 5'- proximal pari of 81 gene of infectious bronchitis virus (IBV) in infected f1uid or tissue samples, which were collected from embryonating chicken eggs or experimentally infected birds. The results of this technique were compared with those obtained in conventional RT-PCR. Ali eleven IBV strains tested were amplified, while none of the heterologous avian viral pathogens (Groups A and B Avian Pneumovirus, Newcastle Disease Virus and Gumboro Disease Vírus) gave positive results. The limit of detection for IC-RT¬PCR was identical to the common RT-PCR and corresponded to 102.8 50% embryonic infectious doses. Thirty two out of thirty five respiratory tissue samples collected from experimentally infected chickens were positive by both molecular techniques (IC-RT-PCR I common RT-PCR), whereas the vírus isolation test detected IBV in twenty two of these samples. The AluL and Mobll RFLP analysis of the 228 bp amplicon generated from IC-RT-PCR led to the discrimination of the 5 reference strains and 6 field IBV isolates in four genotypes; which were associated to the M41, to Connecticut, ar to 8E-17 strain, or to a field isolate. Therefore, the IC-RT-PCR demonstrated in this study a high potential for the application in the direct diagnosis of IBV and has relevant advantages over the conventional RT¬PCR, because it combines the specificity of the immunocapture in a solid phase with the sensitivity of the PCR, providing simplicity, rapidity and low cost for the manipulation of a high number of samples.