Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T02:12:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JoseAntonioda_D.pdf: 21581539 bytes, checksum: 099864fc5149a9352616af17207c291d (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: As técnicas utilizadas no esclarecimento de estruturas macromoleculares estão situadas em campos interdisciplinares, onde os pesquisadores encontram-se unidos por um interesse comum, no sentido de detalhar o entendimento da função biológica e a relação com sua estrutura primária e tridimensional. Os inibidores de sementes de leguminosas são encontrados sob várias isoformas. Alguns métodos, como a espectrometria de massas, determinação da seqüência Nterminal e eletroforese bidimensional, vêm sendo amplamente explorados com o propósito de caracterizar melhor as isoformas presentes em sementes. A eletroforese bidimensional do inibidor de tripsina de Copaíba (CTI) revelou a presença de vários spots na faixa de 11 e 9 kDa. CTI foi resolvido em dois picos (CTI-I e CTI-II) quando submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C18 em sistema HPLC. Esses picos distintos foram submetidos à eletroforese bidimensional sendo três spots observados para CTI-I com pl de 8.0, 8.5 e 9.0 e três spots para CTI-II com pl de 4.7, 4.6 e 4.3. A análise por espectrometria de massa foi realizada para as subunidades CTI-I e CTI-II objetivando determinar as massas moleculares acuradas e prováveis números de isoformas para cada subunidade. Os espectros confirmaram uma heterogeneidade para CTI-I e CTI-II com predominância dos picos de massa 10.719 e 8.244, respectivamente. A impossibilidade em seqüenciar todos os spots para cada subunidade de CTI, norteou a escolha dos spots A e F de forma continuar os estudos de sequenciamento. Os spots A e F foram submetidos a digestões enzimáticas com as proteases tripsina, SV8 e clostripaína. A massa exata dos peptídeos de cada digesto foi determinada por espectrometria de massas utilizando MALDI- TOF. Os peptídeos mais intensos foram purificados e seqüenciados em um HPLC capilar acoplado ao espectrômetro de massas ESI QTOF. A estrutura primária final de CTI, determinada a partir da massa dos peptídeos das digestões enzimáticas e da seqüência obtida por espectrometria de massas indicou 182 resíduos de aminoácidos, apresentando elevado grau de homologia em relação a outros inibidores de tripsina do tipo Kunitz de vegetais; inclusive com o resíduo de arginina na posição do sítio reativo. A estrutura cristalográfica CTI foi resolvida, revelando que este inibidor é composto por duas cadeias polipeptídicas não covalentemente ligadas e possui apenas uma ponte dissulfeto. t de as diferenças estruturais, CTI é um inibidor efetivo de tripsina com uma constante de dissociação de 1,2 nM, da mesma ordem de grandeza que os inibidores padrões como STI, ETI ou WCI. Sua estrutura tridimensional revela que isso se deve ao fato de que as discrepâncias estruturais não afetam a conformação canônica do seu loop reativo. A comparação entre a seqüência deduzida dos mapas experimentais da densidade eletrônica e a seqüência determinada por 2D-PAGE e espectrometria de massas MALDI-TOF e ESI-QTOF, mostra um acordo de aproximadamente 75%, que pode ser devido à presença de várias isoformas que é um aspecto comum das proteínas extraídas de sementes. Experimentos objetivando a determinação dos residuos de aminoácidos importantes na atividade inibitória de CTI foram realizados utilizando reagentes modificadores específicos. O inibidor CTI foi inativado em 48 e 81% por EDC e PGO, respectivamente. Esses compostos atuam em grupos carboxila de Asp e Glu (EDC) e resíduos de arginina (PGO) , indicando funcionalmente a importância do resíduo de arginina na interação do inibidor com a protease. Estudos da estabilidade conformacional em diferentes pHs, temperaturas e agentes caotrópicos fomecem importantes informações sobre a biogênese e estrutura das proteínas. Um estudo verificando o efeito de agentes físico-químicos (pH, temperatura, DTT, uréia e cIoreto de guanidina) na estabilidade conformacional do inibidor de tripsina (CTI) purificado de sementes de Copaifera langsdorffii foi realizado. CTI, um inibidor atípico da família Kunitz, demonstrou ser resistente em sua estabilidade funcional, apesar de sofrer prejuízos na estrutura quatemária após redução em 1 mM DTT como evidenciado por SDS-PAGE, gel filtração em protein-pack, experimentos cinéticos, espectros de fluorescência e de dicroísmo circular. Os experimentos de desnaturação em função dos agentes caotrópicos foram monitorados pela intensidade de fluorescência dos resíduos de triptofano. A desnaturação de CTI na presença de agentes caotrópicos mostrou ser um processo reversível após diálise, para estrutura e função no caso da uréia e do cloreto de guanidina. Os resultados indicaram que a desnaturação de CTI envolve pelo menos dois estágios: nativo e desnaturado. A presença de 3.5 M de uréia ou GdnHCI inibiu 50% e 100% da atividade inibitória, respectivamente. Ambos agentes caotrópicos promoveram um deslocamento do centro de massa. O cálculo da estabilidade conformacional AG (H20) foi feito tomando-se o deslocamento nos comprimentos de onda máxima de emissão de fluorescência como parâmetro. O AG (H2O) em função da concentração de uréia e guanidina foi de 63.0 e 54.0 Kcal mol-1, respectivamente. Os cálculos de centro de massa foram tomados em função da concentração do agente desnaturante em ambos os casos / Abstract: The techniques used in the clarification of macromolecular structures are situated in interdisciplinary fields, where the researchers find themselves united by a common interest in detailing the agreement of the biological function and the relation with its primary and threedimensional structure. The inhibitors of leguminous seeds are found under severa I isoforms. Some methods, as the mass spectrometry, determination of the N-terminal sequence and bidimensional electrophoresis have been widely explored with the purpose of better characterizing these isoforms in seeds. The bidimensional electrophoresis of the Copaiba trypsin inhibitor (CTI) disclosed to the presence of several spots in the 9 and 11 kDa. CTI was resolved in two peaks (CTI-I and CTI-II) when submitted to the reverse phase chromatography in C18 column in HPLC system. These distinct peaks had been submitted to bidimensional electrophorese, 3 spots had been observed for CTI-I with pl of 8.0, 8.5 and 9.0 and three spots for CTI-II with pl of 4.7, 4.6 and 4.3. The analysis for mass spectrometry was carried through for subunits CTI-I and CTI-II objectifying to determine the accurate molecular masses and probable numbers of isoforms for each subunit. The specters had respectively confirmed microheterogeneity for CTI-I and CTI-II with predominance ofthe peaks ofmass 10,719 and 8,244, respectively. The impossibility to sequence ali spots for each subunit of CTI guided the choice of spots more intense (A and F) to continue the sequence studies. Spots A and F had been submitted to the enzymatic digestions with proteases trypsin, SV8 and clostripain. The accurate mass of the peptide of each digest was determined by mass spectrometry using MALDI-TOF MS. The most intense peptides were been purified and sequenced in a LC connected to the spectrometer of mass ESI QTOF. The primary structure of CTI, determined trom the mass of the peptide of the enzymatic digestions and the sequence gotten for mass spectrometry indicated 182 residues of amino acids, presenting a raised degree of similarity to other Kunitz-type inhibitors of the plant, also with the residue of arginine in the position of the reactive site. The crystallographic structure of CTI inhibitor was solved and reveals that, CTI is composed by two non-covalently bound polypeptide chains and only one disulfide bridge. In spite of these structural differences, CTI is an effective trypsin inhibitor with a dissociation constant of 1.2 nM, a value comparable to other standard Kunitz-type inhibitors like STI, ETI or WCI. It three-dimensional structure reveals that this is because the structural discrepancies do not affect the canonical conformation of reactive loop of CTI. The comparison between the sequence deduced from the experimental electron density maps and the sequence determined using 2D-PAGE, MALDI- TOF and ESI-QTOF mass spectrometry shows an agreernent of about 75%, which can be due to the presence of various isoforms that is a common aspect of proteins extracted trom seeds. Experiments objectifying the determination of the important amino acid residues in the inhibitory activity of the CTI were perfomed using specific modifying reagents. The CTI inhibitor was inactivated in 48 and 81% for EDC and PGO, respectively. These composites act in carboxyl group of Asp and Glu (EDC) and residues of arginine (PGO), indicating functionally the importance of the arginine residue in the interaction of inhibitor with protease. Studies of the conformacional stability in different pHs, temperatures and chaotropic agents have given a wealth of information on the structure and biogenesis of proteins. A study verifying the effect of physico-chemical agents (pH, temperature, DTT, urea and guanidine hydrochloride) in the conformacional stability of trypsin inhibitor (CTI) purified trom seeds trom Copaifera langsdorffii was carried through. CTI an atypical inhibitor of the Kunitz family demonstrated to be resistant in its functional stability, although suffering trom damages in the quatemary structure with reduction in 1 mM DTT as evidenced for SDS-PAGE, gel filtration in protein-pack, kinetic experiments, spectrum of fluorescence and circular dichroism. The denaturation experiments in function of the chaotropic agents were monitored by the intensity of the fluorescence of tryptofan residues. The CTI denaturation in the presence of chaotropic agents showed to be a reversible process after dialysis, for structure and function in the case of the urea and guanidine chloride. The results had indicated that the denaturation of CTI involves at least two steps: native and denatured. The presence of 3.5 M of urea or GdnHCI inhibited 50% and 100% of the inhibitory activity, respectively. 80th chaotropic agents had promoted a displacernent of the mass center. The conformational stability calculations dG (H2O) were made by taking the wavelengths corresponding to the maximum fluorescence emission as a pararneter. The dG (H2O) value in function of the concentration of urea and guanidine chloride were 63,0 and 54,0 Kcal mol-1, respectively. The calculations of center of mass were taken as a function of the denaturating agent concentration in both cases / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Valdemiro Carlos Sgarbieri / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-21T04:31:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_MariaReginaBarbieriDe_D.pdf: 28183156 bytes, checksum: bf7a539a7aa882bc0e3dbf77dd91a0ab (MD5) Previous issue date: 1996 / Doutorado

Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T02:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mello_GlauciaCoelhode_D.pdf: 13820355 bytes, checksum: f4848f2050224a7f6808a8923338dac1 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Os inibidores de proteinases desempenham as mais variadas funções biológicas. Em plantas, eles podem estar envolvidos no mecanismo de defesa vegetal contra predadores e doenças. Devido à habilidade dessas moléculas protéicas bloquearem enzimas, os inibidores também podem ser usados como ferramentas no estudo de processos bioquímicos relacionados a patologias, tais como a inflamação, hemorragia e até mesmo o câncer. Neste trabalho, a caracterização físico-química e o estudo dos papéis biológicos de dois inibidores isolados e purificados de sementes de Dimorphandra mollis, DMTI (Mace do et ai., 2000) e DMTI-II (Mello et aI., 2001) foram realizadas com o objetivo de melhor conhecer essas moléculas. DMTI (20 kDa) e DMTI-II (23kDa) são inibidores de tripsina pertencentes à família de Kunitz. A estabilidade da atividade inibitória de DMTI e DMTI-II foi analisada e comparada. DMTI e DMTI-II perde, respectivamente, cerca de 20% e 40% da atividade quando incubados a 60 °e por 20 minutos. Entretanto, a atividade de ambos não foi afetada por diferentes condições de pH, concentrações crescentes dos agentes redutores DTT e uréia. No entanto, a atividade DMTI-II sofreu um descréscimo de 50% quando incubado com cloreto de guanidina. A diferença da estabilidade dos inibidores levou a investigação da estrutura protéica de ambos; DMTI e DMTI-II foram submetidos a análises de dicroísmo circular e calorimetria. A ação inseticida de DMTI-II e DMTI sobre os lepidópteros Anagasta kuehniella e Corcyra cephalonica, foram analisadas através de ensaios in vitro e in vivo. Tanto DMTI-II quanto DMTI, quando incorporados ao nível de 2% na dieta artificial dos insetos, não se mostraram agentes inseticidas potenciais contra essas duas espécies. Estes resultados não descartam a utilização dos inibi dores de D. mollis na biotecnologia vegetal contra outras espécies de insetos, apenas ajudam a esclarecer as características como agentes inseticidas biológicos. Quando estudado o envolvimento de DMTI-II e DMTI na resposta inflamatória utilizando o edema de pata em ratos como modelo experimental, os resultados mostraram que doses crescentes de DMTI-II geram uma curva dose-dependente sendo que a resposta máxima ocorre 30 minutos após a sua injeção subplantar, o que sugeriu a ação do inibidor na liberação de histamina e serotonina, que são responsáveis pelo aumento da penneabilidade vascular. A elucidação do mecanismo de ação de DMTI-Il foi estudada através da utilização de drogas antiinflamatórias, como a mepiramina e ciproheptadina; sendo esta última a que melhor inibiu a ação de DMTI-Il na indução do edema. Concomitantemente, a sua ação na liberação de bradicinina também pode estar ocorrendo, pois o pré-tratamento com o antagonista de receptores B 2, HOE 140, reduziu cerca de 79% do edema induzido por DMTI-II / Abstract: Proteinase inhibitors have a wide range of biological functions. In plants, they¿re part of the defense mechanism against predators and diseases. As they can block enzymes, inhibitors are useful tools in the study of biochemical processes related to pathologies, such as inflammation, hemorrhage and even cancer. This paper aims at assessing the physical-chemical features and the biological functions of two inhibitors isolated and purified trom Dimorphandra mollis seeds, DMTI (Macedo et al., 2000) and DMTI-II (Mello et aI., 2001). DMTI (20 kDa) and DMTI-TI (23 kDa) are trypsin inhibitors ITom the Kunitz family. The stability of the inhibitory activity of DMTI and that ofDMTI-II were analyzed and compared to each other. DMTI and DMTI-II lost 20% and 40%, respectively, oftheir activities when incubated at 60°C for 20 minutes. However, neither inhibitory activity was sensitive to pH above the 2.0-10.0 range, reducing DTT agents and urea. On the other hand, DMTI-II activity was reduced by 50% when incubated with guanidine hydrochloride. The difference of stability between the inhibitors led to further investigation of their protein structure; DMTI and DMTI-II structures were analyzed by circular dichroism (CD) and differential scanning calorimetry (DSC). The effectiveness of DMTI-II and DMTI as insecticide in Lepidoptera insects, Anagasta kuehniella and Corcyra cephalonica, was analyzed in vitro and in vivo assays. Neither DMTI-II nor DMTI, when incorporated into artificial diet at 2%, were active as insecticide agents against these two species. Nevertheless, these results do not discard the use of inhibitors trom D. mollis in plant biotechnology against other species of insects; they just help us to understand how they work as biological agents. When studying DMTI and DMTI-II participation in inflammatory response in the rat paw edema experimental model, the results showed that increased doses of DMTI-II induced a dose dependent curve, and maximum response occurred 30 min after sub-plantar injection, which indicated that the inhibitor is active in the release of histamine and serotonin, which are responsible for the increase of vascular permeability. The elucidation of DMTI-II action mechanism was studied by using anti-inflammatory drugs, such as mepyramine and cyproheptadine, the latter the most effective against DMTI-II effects in edema induction. At the same time, it may also be active in bradykinin release as the pretreatment with B2 receptor antagonist HOE 140 reduced the DMTI-II induced edema by near1y 79% / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T17:22:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JoseAntonioda_M.pdf: 9541917 bytes, checksum: add850a1bcd914f9e54f920e79088cf3 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Os inibidores foram isolados de TOI em sementes de Copaifera langsorffii, conhecida vulgarmente por Copaíba, uma árvore nativa do Brasil da subfamília Caesalpinoideae da família Leguminosae. A fração TOI foi purificada a partir de precipitação com sulfato de amônio, cromatografia em uma coluna de troca-iônica em OEAE-Sepharose e coluna de afinidade em Sepharose- Trypsina. TOI apresentou-se homogêneo em gel de poliacrilamida-SOS 12,5%, com uma massa molecular aparente de 24 kOa em condições não reduzidas, e 12 kOa em condições reduzidas com OIT. A massa molecular relativa estimada por filtração em gel em uma coluna Superdex-75, sistema FPLC, confirmou os resultados obtidos em PAGE-SOS. TOI tem um Ki de 1,2nM para a enzima tripsina bovina mostrando uma alta afinidade. No entanto, TOI não mostrou atividade inibitória para quimotripsina. O estudo da estequiometria do complexo TOI-tripsina revelou que este inibe tripsina na razão molar de 1: 1. O complexo TripsinaTOI foi eluído na cromatografia de filtração em gel com um tempo de retenção equivalente a uma massa molecular relativa de 39 kOa. Evidenciou-se também que TOI é ativo na sua forma monomérica e não na sua forma dimérica. A Focalização Isoelétrica de TOI revelou a presença de duas bandas de proteínas, ambas coradas para inibidor de tripsina com pls de 6,45 e 7,35, indicando dois inibidores em TO!. Os inibidores de TOI, designadas por TOI-I e TOI-II, foram isoladas em coluna de fase reversa C18 /lBondapack, em Sistema HPLC Walters. Foi observado em gel de Tricina 16,5% uma diferença mínima na massa molecular aparente, sendo aproximadamente 12 e 10 kOa para TOI-I e TOI-1I respectivamente. O sequenciamento N-terminal dos inibidores de TOI revelou a presença da sequência consenso observada nos inibidores de tripsina tipo Kunitz para TOI-I, contudo, pesquisas nos banco de dados de proteínas não revelou nenhuma homologia para TOI-II. TOI mostrou alta estabilidade para diferentes condições de pH, temperatura e concentração de OTT, indicando um possível número elevado de pontes de dissulfeto na estrutura molecular. TOI não foi degradado proteoliticamente na digestibilidade in vitro pelas proteases encontradas no intestino médio do gorgulho Callosobruchus maculatus, e demonstrou um efeito deletério no desenvolvimento dos insetos, sugerindo que TOI atua como um fator antinutritivo e prejudica o desenvolvimento de Callosobruchus maculatus / Abstract: Two inhibitors have been isolated de TOI fraction in seeds of Copaifera langsorffii, ordinarily known as Copaíba, one Brazilian native tree of the Caesalpinoideae subfamily of Leguminosae family. The fraction TOI was purified by ammonium sulfate preeipitation, ion-exehange ehromatography on OEAE-Sepharose and affinity ehromatography on trypsin-Sepharose. TOI presented homogeneity in PAGE-SOS geI12,5%, with apparent moleeular mass of 24 and 12 kOa in non-and reduetion condition, respeetively. The relative moleeular mass determined by FPLC gel filtration on a Superdex 75 eolumn, eonfirmed on the results in PAGE-SOS. TOI have Ki of 1,2nM to bovine trypsin enzyme showing high affinity. However, no inhibition was found for quimotrypsin. The stoiehiometrie study of the trypsin-TOI eomplex evideneed that inhibitor is aetive for trypsin at 1: 1 molar ratio. The trypsin- TOI eomplex was eluted on a gel filtration ehromatography with retention time equivalent a relative moleeular mass of the 39kOa. Evidenced too, that TOI is active on enzyme trypsin on its monomerie form and not dimerie one. The isoelectrie foeusing of TOI demonstrated the presenee of two proteie bands, with isoelectrie point between 6.45 e 7,35, indicating two inhibitors in TOI. These inhibitors of TOI, designated for TOI-I and TOI-II, was isolated by reversed - phase HPLC on a J.L-Bondapaek column (Waters System) and was observed in Trieine-gel 16,5% one minimal differenee on apparent moleeular mass, of approximately 12 and 10 kOa for TOI-I and TOI-1I respectively. N-terminal sequeneing of the inhibitors of TOI, demonstrated the presenee of the eonsensus sequenee present in the soybean Kunitz-Type trypsin inhibitor for TOI-I, however, protein database searehes did not reveal any homology to TOI-II. The TOI showed high stability to pH different eonditions, temperature and amount of OTT, indicating one elevated number of disulfides bonds in a moleeular strueture. The TOI was not proteolytically degraded on a in vitro digestibility by midgut proteinases of the gorgulho Callosobruchus maculatus and demonstrated one deleterious effect on a insect's development, suggesting that TOI acts like toxie factor and deereased survival of Callosobruchus maculatus / Mestrado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-05Bitstream added on 2014-06-13T19:36:48Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_msf_me_jabo.pdf: 289970 bytes, checksum: 690be387700029389cd1e264f81060e0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O sistema imunológico de bezerros consolida-se com a ingestão do colostro, alimento rico em imunoglobulinas que são proteínas responsáveis por transferir imunidade aos bezerros. A eficiência dessa transferência é influenciada por uma série de fatores, dentre eles a integridade das imunoglobulinas a serem absorvidas. No colostro estão naturalmente presentes os inibidores de tripsina, capazes de preservar as imunoglobulinas da ação de enzimas proteolíticas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a potencialidade dos inibidores de tripsina da soja na transmissão da imunidade passiva de bezerras da raça Holandesa, por meio da análise das concentrações de imunoglobulina G (IgG) e proteína total (PT) e atividade da gamaglutamiltransferase (GGT) sérica. Foram utilizadas 18 bezerras recém-nascidas alimentadas com colostro (T1), colostro adicionado de inibidor de tripsina purificado Sigma tipo I-S (50 mg) (T2) e provenientes da fração albumina da soja 1,08 g (T3). As amostras de sangue foram colhidas por venopunção da veia jugular com 1, 12, 24, 36 e 48 h após o nascimento, sendo a primeira colheita realizada antes do fornecimento do colostro. O colostro apresentou teor de gordura de 3,2 a 7,2 %, de proteína total de 14,10 a 19,52 %, representada por 7,84 a 9,44 % pelas proteínas do soro (PS). A atividade dos inibidores de tripsina variou de 0,766 a 0,945 mg de tripsina inibida.mL-1. Não houve influencia dos tratamentos (p>0,05%) para os parâmetros analisados, porém houve efeito (p<0,05%) do período de amostragem, com aumento nas concentrações de IgG, GGT e PT a partir da 0h com respectivos valores médios de 0,68 g.dL-1; 15,17U.L-1, 4,43 g.dL-1, com pico de absorção às 24 h: 3,06 g.dL-1, 2.779 U.L-1 e 7,54 g.dL-1, respectivamente, indicando transmissão adequada de imunidade passiva. A adição dos... / The calves’ immune system is consolidated by the ingestion of colostrum, which is rich in immunoglobulin, the proteins that are responsible for transfering the immunity to the calves. This transferring efficacy is influenced by a series of facts, among them the immunoglobulin’s integrity to be absorbed. Trypsin inhibitors are naturally present on the colostrum and they are able to preserve the immunoglobulin from the proteoclastic enzyme actions. The aim of this work was to evaluate the potentiality of soya Trypsin inhibitor on the passive immunity of the Holstein female calves, by evaluating the concentration of immunoglobulin G (IgG) and total protein (PT) as well as Gammaglutamil transferase (GGT) activity in serum. Eighteen newborn female calves were taken and they were fed with colostrums (T1), colostrums with purified trypsin inhibitor I-S Sigma (50mg), (T2) and colostrums with soya albumin fraction 1.08 g (T3). Blood samples were collected by jugular veined punch within 1, 12, 24, 36 and 48 hours after they were born, the first collection was done before the colostrums was given. Colostrums have presented 3.2% to 7.2 % of fat contents; 14, 10% to 19, 52 % of total protein represented by 7, 84% to 9, 44 % of serum protein (PS). Trypsin inhibitor activities have varied from 0,766 mg to 0,945 mg of inhibited trypsin mL-1. There was no influence of the treatments (p>0,05%) for the analyzed parameters, however, there was (p<0,05%) a significant effect for the period of collection, with an increase on IgG, GGT and, PT concentrations from 0h with the respective medium values of 0,68g.dL- 15,17U.L-1, 4,43 g.dL-1. The absorption pick was at 24 h: with 3,06 g.dL-1, 2.779 U.L-1 and 7,54 g.dL-1 means, respectively for IgG, GGT and PT, indicating an adequate transmission of passive immunity. The addition of soya Trypsin... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T11:17:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mello_GlauciaCoelhode_M.pdf: 8782241 bytes, checksum: b2eab6f44b4a7734dcb76be2f126999a (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Algumas espécies vegetais podem apresentar em suas sementes, agentes bioquímicos que atuam no mecanismo de defesa da planta. Uma grande variedade destes são, na maioria, constituídos de proteínas e carboidratos. Dentre os agentes de origem protéica estão os inibidores de proteinases, que além da sua atuação em plantas, podem ter aplicações no tratamento de patologias, como inflamações, hemorragia e até mesmo o câncer. Neste trabalho, um inibidor de tripsina presente nas sementes de Dimorphandra mollis (Leguminosae-Mimosoideae), conhecida comumente por Faveiro-Doce, foi isolado e purificado a partir de precipitação com sulfato de amônio (30-60%), cromatografias em coluna de exclusão molecular (Sephadex G-75), troca iônica (DEAE-Sepharose) e de afinidade (Sepharose- Tripsina). A pureza do inibidor de D. mollis (DMTI-II) foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida, que revelou uma única banda de proteína, mesmo em condições redutoras (O,IM DTT), indicando que DMTI-II é constituído por uma única cadeia polipeptídica. A massa molecular relativa de 25 kDa foi estimada por gel filtração em coluna de Superdex-75, em sistema FPLC. Uma constate de inibição de Ki de 1,7 x IO-IOM foi obtida para DMTI-II com a enzima tripsina bovina, mostrando portanto uma alta afinidade entre enzima e inibidor. Estudos estequiométricos revelaram que DMTI-II inibiu a tripsina na razão molar de 1:1, sendo a massa molecular do complexo formado de 46 kDa, determinada por cromatografia de filtração em gel, em coluna Superdex-75 (sistema FPLC). A atividade inibitória de DMTI-II mostrou ser altamente estável para diferentes condições de pH e concentrações do agente redutor DTT. A determinação da sequência N-terminal do inibidor que apresentou alto grau de homologia com outros inibi dores da família Kunitz, permitiu confnmar as características e propriedades mostradas durante o decorrer do trabalho. DMTI-II foi também submetido a ensaios de digestibilidade in vitro por pepsina e papaína e por enzimas presentes no intestino médio de larvas de Callosobruchus macu/atus com o intuito de verificar sua provável ação contra esta espécie de inseto. Os resultados mostraram que DMTI-II foi refratário à ação dessas enzimas, sugerindo uma possível aplicação na biotecnologia vegetal / Abstract: Some plants species can have in their seeds biochemical agents that act on their defense mechanism. A great number of them are of proteins or carbohydrates nature. Among the ones with protein origin are the proteinase inhibitors, that can also have a role on the treatment of pathologies, such as inflammation, hemorrhage and even on cancer. In this work, a trypsin inhibitor from Dimorphandra mol/is (Leguminosae Mimosoideae) seeds, commonly known as "Faveiro-Doce", was isolated and purified by ammnium sulfate precipitation (30-60%), gel filtration chromatography (Sephadex G-75), ionexchange chromatography (DEAE-Sepharose) and affinity chromatography (SepharoseTrypsin). D. mollis inhibitor's (DMTI-II) was assayed by polyacrylamide gel electrophoresis, yielding a single protein band, indicating that DMTI-II is constituted by one polypeptide chain. A molecular weight of25 kDa was estimated by gel filtration on Superdex G-75 column (FPLC system). An inhibition constant value of 1.7 x IO-IOM was obtained for DMTI-II with bovine trypsin, showing a high affmity between enzyme and inhibitor. Stoichiometric studies showed that DMTI-II inhibited trypsin in a I: I molar ratio. The molecular weight of the complex was determined as 46 kDa, by gel filtration chromatography in the Superdex G75 column. DMTI-II inhibitory activity was stable in the different pH conditions and reducing agent (DTT) concentration. Determination ofthe inhibitor N-terminal sequence showed a high degree of homology in relation to other inhibitors from the Kunitz fami1y, reinforcing the characteristics and properties found during this work. DMTI-II inhibitor was submitted to digestion assays in vitro by pepsin and papain and by enzymes present in the larvae midgut from Callosobruchus maculatus, to verify its probable _on against this insect specie. The results showed that DMTI-II was refractory to the action of those enzymes, suggesting a possible application on plant biotechnology / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Igor Polikarpov / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:29:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Krauchenko_Sandra_D.pdf: 16409460 bytes, checksum: de77214db0609d7859cd4a199cf747a6 (MD5) Previous issue date: 2004 / Doutorado

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T16:20:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_SilvanaCristina_M.pdf: 4387966 bytes, checksum: 19da59ac17254dba0a8949838880eefc (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: No presente trabalho foi investigado um inibidor de proteinases em sementes da espécie Delonix regia Leguminosae-Caesalpinioideae). As sementes das leguminosas contêm uma alta concentração de proteína em relação aos outros componentes da planta. Dentre essas proteínas, os inibidores de proteinases, particularmente inibidores de enzimas da família das serinoproteinases (que inclui tripsina, quimotripsina e enzimas da coagulação sanguínea), exercem uma importante função na fisiologia da planta. Os inibidores de proteinases têm sido estudados há mais de 50 anos. Eles têm mostrado ser muito importantes no tratamento de disfunções metabólicas associadas às enzimas proteolíticas, tais como em casos de pancreatites, efizemas, alergias, inflamação, hipertensão e câncer. O inibidor de Delonix regia (DrTI) foi isolado em solução salina 10% (p/v), submetido a uma precipitação por acetona 80% (v/v) e purificado através de cromatografias de troca iônica (Sephadex A-50 e DEAE 5PW) e de exclusão molecular (Sephadex G-75). o DrTI inibiu tripsina bovina e porcina e a calicreína plasmática humana. Os valores de Ki encontrados foram 2, 19x1 0-8M, 4,53x10-8M e 5,25x 10-9 M, respectivamente. A pureza do inibidor foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida (10-20%), na presença de 5DS. O inibidor apresentou uma única banda de proteína em condições nativas e reduzidas (0,1 M DTT). Estes resultados indicam que o DrTI é constituído por uma única cadeia polipeptídica. A massa molecular aparente do inibidor foi de 22 kDa, um resultado similar aos inibidores de proteinase do tipo Kunitz. O DrTI foi submetido a estudos cristalográficos e seu modelo permitiu comparação estrutural com o inibidor de tripsina do tipo Kunitz isolado de sementes de Erythrina caffra / Abstract: In the present work, a proteinase inhibitor in seeds of Delonix regia (LeguminosaeCaesalpinioideae) specie, was investigated. The Leguminosae seeds contain a high concentration of protein in relation to the other components of the plant. Among these proteins, the proteinase inhibitors, particularly enzymes inhibitors of serinoproteinases family (that include trypsin, chymotrypsin and blood coagulating enzymes), play an important role in plant physiology. Plant inhibitors have been investigated for more than fifty years ago. They have been shown to be very important in the treatment of metabolic disfunctions associated to proteolytic enzymes, such as in cases of pancreatits, emphyzema, allergy, inflamation and cancers. The Delonix regia inhibitor (DrTI) was isolated in saline solution 10% (p/v), after acetonic precipitation 80% (v/v), and purified through ion exchange chromatography (Sephadex A-50 e DEAE 5PW) and molecular exclusion (Sephadex G-75). DrTI inhibited bovine and porcine trypsin and human plasma kallikrein. The values of Ki found were 2,19 x 10-8M, 4,53 x 10-8M and 5,25 x 10-9M, respectively. Purity of inhibitor was detected by poliacrylamide gel electrophoresis (10-20%) in the presence of SDS. The inhibitor displayed a single protein band, in native and reduced conditions (0,1 M DTT). These results indicate that DrTI is constituted by a single polipeptide chain.The apparent molecular mass of inhibitor was of 22 kDa, a result similar to the proteinase inhibitors of the Kunitz-type. DrTI was submitted to crystallographic studies and its model allowed structural comparison to the trypsin inhibitor of the Kunitz-type isolated from Erythrina caffra seeds / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: João Alberto Negrão / Coorientador: Maria Regina Barbieri de Carvalho / Banca: José Jurandir Fagliari / Banca: Maria da Graça Pinheiro / Resumo: O sistema imunológico de bezerros consolida-se com a ingestão do colostro, alimento rico em imunoglobulinas que são proteínas responsáveis por transferir imunidade aos bezerros. A eficiência dessa transferência é influenciada por uma série de fatores, dentre eles a integridade das imunoglobulinas a serem absorvidas. No colostro estão naturalmente presentes os inibidores de tripsina, capazes de preservar as imunoglobulinas da ação de enzimas proteolíticas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a potencialidade dos inibidores de tripsina da soja na transmissão da imunidade passiva de bezerras da raça Holandesa, por meio da análise das concentrações de imunoglobulina G (IgG) e proteína total (PT) e atividade da gamaglutamiltransferase (GGT) sérica. Foram utilizadas 18 bezerras recém-nascidas alimentadas com colostro (T1), colostro adicionado de inibidor de tripsina purificado Sigma tipo I-S (50 mg) (T2) e provenientes da fração albumina da soja 1,08 g (T3). As amostras de sangue foram colhidas por venopunção da veia jugular com 1, 12, 24, 36 e 48 h após o nascimento, sendo a primeira colheita realizada antes do fornecimento do colostro. O colostro apresentou teor de gordura de 3,2 a 7,2 %, de proteína total de 14,10 a 19,52 %, representada por 7,84 a 9,44 % pelas proteínas do soro (PS). A atividade dos inibidores de tripsina variou de 0,766 a 0,945 mg de tripsina inibida.mL-1. Não houve influencia dos tratamentos (p>0,05%) para os parâmetros analisados, porém houve efeito (p<0,05%) do período de amostragem, com aumento nas concentrações de IgG, GGT e PT a partir da 0h com respectivos valores médios de 0,68 g.dL-1; 15,17U.L-1, 4,43 g.dL-1, com pico de absorção às 24 h: 3,06 g.dL-1, 2.779 U.L-1 e 7,54 g.dL-1, respectivamente, indicando transmissão adequada de imunidade passiva. A adição dos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The calves' immune system is consolidated by the ingestion of colostrum, which is rich in immunoglobulin, the proteins that are responsible for transfering the immunity to the calves. This transferring efficacy is influenced by a series of facts, among them the immunoglobulin's integrity to be absorbed. Trypsin inhibitors are naturally present on the colostrum and they are able to preserve the immunoglobulin from the proteoclastic enzyme actions. The aim of this work was to evaluate the potentiality of soya Trypsin inhibitor on the passive immunity of the Holstein female calves, by evaluating the concentration of immunoglobulin G (IgG) and total protein (PT) as well as Gammaglutamil transferase (GGT) activity in serum. Eighteen newborn female calves were taken and they were fed with colostrums (T1), colostrums with purified trypsin inhibitor I-S Sigma (50mg), (T2) and colostrums with soya albumin fraction 1.08 g (T3). Blood samples were collected by jugular veined punch within 1, 12, 24, 36 and 48 hours after they were born, the first collection was done before the colostrums was given. Colostrums have presented 3.2% to 7.2 % of fat contents; 14, 10% to 19, 52 % of total protein represented by 7, 84% to 9, 44 % of serum protein (PS). Trypsin inhibitor activities have varied from 0,766 mg to 0,945 mg of inhibited trypsin mL-1. There was no influence of the treatments (p>0,05%) for the analyzed parameters, however, there was (p<0,05%) a significant effect for the period of collection, with an increase on IgG, GGT and, PT concentrations from 0h with the respective medium values of 0,68g.dL- 15,17U.L-1, 4,43 g.dL-1. The absorption pick was at 24 h: with 3,06 g.dL-1, 2.779 U.L-1 and 7,54 g.dL-1 means, respectively for IgG, GGT and PT, indicating an adequate transmission of passive immunity. The addition of soya Trypsin... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:21:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guimaraes_LaysCordeiro_M.pdf: 5932501 bytes, checksum: 2972555d649882421e88bba9ccd5dfea (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular