Orientador: Maria Lígia Rodrigues Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:17:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bezerra_CezardaSilva_M.pdf: 16272882 bytes, checksum: c9bdf2bf628fb555d1bc1ccc47c972c5 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Os inibidores de proteases de plantas têm sido amplamente estudados como uma alternativa para o controle de insetos-praga devido à capacidade de inibir enzimas envolvidas na digestão. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi estudar a atividade biológica do inibidor de tripsina de sementes de Inga vera (IVTI) sobre o desenvolvimento, fisiologia nutricional e atividade enzimática de Anagasta kuehniellla. Larvas neonatas (n=40) foram mantidas em dieta artificial sem inibidor (controle) ou contendo 1% de IVTI (p/p) até atingirem o quarto e quinto instares. As análises realizadas determinaram o efeito sobre o desenvolvimento destas, desde período larval até emergência dos adultos. Através de outras aferições elaboramos uma tabela de parâmetros nutricionais. A atividade proteolítica do homogenato intestinal e fecal foi analisada através de zimograma e ensaios enzimáticos in vitro, utilizando BApNA e Suc-AAPF-pNA como substratos para tripsina e quimotripsina, respectivamente. IVTI foi incubado com o homogenato intestinal larval para verificar a degradação do mesmo. O consumo de IVTI pelas larvas provocou uma redução de cerca de 50% no peso médio larval e uma redução significativa taxa de sobrevivência de 15%, bem como o prolongamento do período larval em 8 dias. A análise dos índices nutricionais revelou uma redução na eficiência de conversão do alimento ingerido e digerido e um aumento no custo metabólico, sugerindo que IVTI apresenta efeito antinutricional para esta espécie. IVTI alterou a atividade proteolítica intestinal das larvas com a redução atividade tríptica e o aumento da atividade quimotríptica. Na análise fecal, os níveis da atividade tríptica foram semelhantes tanto nas fezes das larvas alimentadas em dieta controle quanto contendo inibidor, entretanto foi observado um aumento no nível da atividade quimotríptica nas larvas alimentadas com inibidor. IVTI não foi degradado pelas enzimas intestinais, sendo excretado nas fezes e permanecendo com sua atividade inibitória ativa. O zimograma não revelou nenhuma forma variante de enzima nas larvas alimentadas com inibidor, mas foi possível observar quais sofreram influências pelo mesmo. Com base nesses resultados, IVTI apresentou uma atividade tóxica e antinutricional contra A. kuehniella / Abstract: Plant protease inhibitors have been extensively studied as an alternative for the control of insect pests because of their ability to inhibit enzymes digestive enzymes. In this work, the biological activity of trypsin inhibitor of Inga vera seed (IVTI) on the development, nutritional physiology and enzyme activity of Anagasta kuehniellla was evaluated. Neonate larvae (n=40) were maintained on artificial diet without inhibitor (control) or containing 1% IVTI (w / w) until fourth and fifth instar. This bioassay determined the effect on the development from the larval period to adult emergence. Through other measurements prepared a table of nutritional parameters. The proteolytic activity of intestinal and fecal homogenate was analyzed by zymography and enzymatic assays, in vitro, using BApNA and Suc-AAPF-pNA as substrates for trypsin and chymotrypsin, respectively. IVTI was incubated with the larval gut and check the degradation of the inhibitor. IVTI consumption by the larvae resulted in a reduction of about 50% of larval weight and a significant larval survival rate of 15%, as well as the extension of the larval period to 8 days. Nutritional analyses showed a reduction of efficiency of conversion of food eaten and digested and an increase in metabolic cost, suggesting that IVTI produces an anti-nutritional effect for this specie. IVTI changed the proteolytic activity in the gut of the larvae with decrease of trypsin activity and increase of chymotrypsin activity. Fecal analyses, the levels of trypsin activity were similar in the feces of larvae fed on control diet as containing inhibitor, however there was an increase in the level of chymotrypsin activity in larvae fed with inhibitor. IVTI was not degraded by intestinal enzymes, but it excreted in the feces and their inhibitory activity remained active. Zymogram revealed no variant form of the enzyme in the larvae fed inhibitor, but was observed which were influenced by it. Based on these results, IVTI presented an anti-nutritional and toxic activity against A. kuehniella / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores : Everson Alves Miranda, Zivko L. Nikolov / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-01T15:51:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Azzoni_AdrianoRodrigues_D.pdf: 7397163 bytes, checksum: 205f126ad771bb30d977324c656157fe (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A expressão em plantas transgênicas é potencialmente uma das formas mais econômicas de produção em larga escala de peptídeos e proteínas de emprego farmacêutico. Dentre as vantagens estão a capacidade de estocagem da biomolécula por longo período em sementes, o baixo custo de produção e escalonamento (basta aumentar a área plantada) e o pequeno risco de contaminação por agentes patogênicos aos humanos. Contudo, existem poucos trabalhos visando a avaliar o potencial das plantas transgênicas do ponto de vista da recuperação e purificação de biomoléculas (RPB) em larga escala. Neste trabalho foi estudada a recuperação e purificação de aprotinina recombinante, um inibidor de proteases utilizado como fármaco, produzida em sementes de milho transgênico. Mais do que desenvolver metodologias de purificação de uma proteína específica, este trabalho objetivou contribuir com novos conhecimentos sobre a utilização da planta de milho como biorreator. Condições de extração visando a maximização da eficiência de extração da aprotinina recombinante e minimização da extração de impurezas foram estudas. Destes estudos, a condição de extração a pH 3,0 e força iônica de 200 mM foi a que se mostrou mais adequada. A aprotinina recombinante, juntamente com um inibidor de tripsina naturalmente encontrado em sementes de milho (inibidor de tripsina do milho - ITM) foi capturada do extrato aquoso da semente através do uso de cromatografia em resina de agarose com tripsina imobilizada. Duas diferentes rotas cromatográficas foram empregadas para a separação entre os inibidores e purificação final da aprotinina: cromatografia em resina agarose-IDA-Cu2+ e cromatografia em resina SP Sepharose. A confirmação da purificação da aprotinina recombinante foi realizada através de seqüenciamento N-terminal, SDS-PAGE e HPLC, sendo que este último método de análise indicou que purezas tão elevadas quanto 97% foram alcançadas. Uma vez que o ITM também foi purificado, o processo aqui estudado tem como vantagem a possibilidade de sua co-produção. Finalmente, os resultados deste trabalho vem corroborar com pesquisas anteriores que indicam o potencial do uso de plantas como biorreatores / Abstract: Expression in transgenic plants is potentially one of the most economical systems for large-scale production of valuable peptide and protein products. Advantages of the use of plants as bioreactors include the low cost of growing a large amount of biomass, easy scale-up (increase of plant acreage), natural storage organs (seeds and tubers), and the reduced risk on propagating human or animal pathogens. However, the downstream processing of recombinant proteins produced in plants has not been extensively studied. In this work, we studied the extraction and purification of recombinant aprotinin, a protease inhibitor used as a therapeutic compound, produced in transgenic com seed. More than just studing the recovery and purification of a recombinant protein, the aim of this work was to add new information about the use of transgenic com as bioreactor. Conditions for extraction from transgenic com meal that maximize aprotinin concentration and its fraction of the total soluble protein in the extract were determined as pH 3.0 and 200 mM NaCI. Aprotinin in this extract, together with a native com trypsin inhibitor (CTI) was captured using a trypsin-agarose column. These two inhibitors were separated by using two different approaches: immobilized metal ion affinity chromatography IMAC (agarose-IDA-Cu2+ resin) and cation-exchange chromatography (SP Sepharose resin). The high purity of the recombinant aprotinin was verified by SDSPAGE and N-terminal sequencing. Reverse phase HPLC analysis of the recombinant aprotinin purified by IMAC suggested a purity as greater as 97%. Since CTI was also purified, the recovery and purification process studied has the advantage of possible CTI coproduction. Finally, the work presented here introduces additional information on the recovery and purification of recombinant proteins produced in plants and corroborates with past research on the potential use of plants as bioreactors / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientadores: Maria Lígia Rodrigues Macedo, Odalys Garcia Cabrera, Goran Neshich / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T08:34:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ramos_VanessadaSilveira_D.pdf: 9537452 bytes, checksum: 829f959a45ba9dc3fb47b19126255aca (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os inibidores de tripsina têm sido utilizados com sucesso para aumentar a resistência das plantas contra os insetos. No presente trabalho avaliamos a eficiência de um inibidor de tripsina de Inga laurina (ILTI) sobre o desenvolvimento de larvas de Diatraea saccharalis e Heliothis virescens, duas importantes pragas da cana-de-açúcar e tabaco, respectivamente. Para estes fins foram utilizadas diversas estratégias (i) purificação da proteína ILTI nativa a partir de sementes de I. laurina e sua utilização para suplementação de dieta artificial fornecida como alimento às larvas dos insetos em estudo. Isto com o intuito de avaliar os efeitos do inibidor no desenvolvimento destes indivíduos; (ii) obtenção da sequência de DNA do gene ilti, clonagem, expressão e purificação da proteína recombinante assim como avaliação da sua atividade inibitória; (iii) obtenção de plantas transgênicas de cana-de-açúcar e tabaco com o gene ilti obtido a partir do DNA genômico de I. laurina ou do gene ilti-s sintetizado quimicamente usando o uso de códons da cana-de-açúcar. A adição de 0,1% (p/p) de ILTI na dieta de D. saccharalis não alterou a sobrevivência larval, mas resultou em uma redução de 56% no peso das larvas. As larvas de H. virescens que foram alimentadas em uma dieta contendo 0,5% (p/p) de ILTI apresentaram uma redução de 84% no peso. Experimentos in vitro mostraram que ILTI não foi digerido pelas proteinases do intestino médio de ambas as espécies de larvas. Ensaios trípticos permitiram observar que não houve alteração nos níveis de tripsina no intestino médio de ambos os insetos. Entretanto, verificou-se uma redução de 55,3% na atividade tríptica das fezes de D. saccharalis e um aumento de 24,1% desta atividade nas fezes de H. virescens. A atividade da tripsina em ambas as espécies alimentadas com ILTI foi sensível ao inibidor, sugerindo que nenhuma nova proteinase resistente à ILTI foi induzida. Adicionalmente, a proteína recombinante reILTI produzida em Escherichia coli apresentou atividade inibitória similar à proteína nativa em testes de atividade anti-tríptica. Com isso, reILTI pode ser considerada como uma potencial ferramenta biotecnológica. Finalmente, larvas de D. saccharalis e H. virescens foram alimentadas com plantas transgênicas de cana-de-açúcar e tabaco - respectivamente - expressando os genes ilti e/ou ilti-s. Os resultados mostraram que os transgênicos foram capazes de interferir no metabolismo dos insetos-praga testados sugerindo que esta estratégia pode ser promissora na obtenção de plantas mais resistentes ao ataque de insetos / Abstract: Trypsin inhibitors have been successfully used to increase plant resistance against insects. In this work, we evaluated the efficiency of a trypsin inhibitor from Inga laurina (ILTI) on the development of Diatraea saccharalis and Heliothis virescens, two important pests of sugarcane and tobacco, respectively. For these purposes, several strategies were employed: (i) purification of the native protein ILTI from I. laurina seeds, and its use as a supplement in the artificial diet provided for the insect larvae. This purpose was performed in order to evaluate the effects of ILTI on the development of these individuals, (ii) elucidation of the DNA sequence of the ilti gene; cloning, expression and purification of the recombinant protein (reILTI) as well as evaluation of its inhibitory activity, (iii) production of transgenic plants of sugarcane and tobacco with the gene ilti from I. laurina genomic DNA or the gene ilti-s, which was chemically synthesized using the sugarcane codon usage. The addition of 0.1% (w/w) ILTI in the diet of D. saccharalisdid not alter larval survival but resulted in a reduction of 56% in the weight of the larvae. The H. virescens larvae that were fed a diet containing 0.5% (w/w) ILTI showed an 84% decrease in weight. In vitro experiments showed that ILTI was not digested by the midgut proteinases of either species of larvae. Triptic assays allowed observe that there was no alteration in the trypsin levels in the midgut of either insect. However, there was a reduction of 55.3% in the triptic activity in the feces of D. saccharalis and an increase of 24.1% of this activity in the feces of H. virescens. The trypsin activity in both species fed with ILTI was sensitive to the inhibitor, suggesting that no novel proteinase resistant to ILTI was induced. Additionally, reILTI showed similar inhibitory activity to those of the native protein in the anti-tryptic assays. Therefore, reILTI can be considered a potential biotechnological tool. Finally, larvae of D. saccharalis and H. virescens were fed with transgenic sugarcane and tobacco plants, respectively. The results showed that transgenic plants were able to interfere with the metabolism of these insect pests, suggesting that this is a promising strategy for the production of plants that are more resistant to insect attack / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-12Bitstream added on 2014-06-13T20:37:31Z : No. of bitstreams: 1 castoldi_r_me_jabo.pdf: 271551 bytes, checksum: 70eaecbffef73c494f584a13c0f4a3d6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivou-se avaliar o desempenho de cinco genótipos de soja-hortaliça, quanto às características agronômicas, funcionais e antinutricionais. O experimento foi conduzido em campo, no Setor de Olericultura e Plantas Aromático-Medicinais na UNESP-FCAV. O delineamento experimental adotado foi o de blocos ao acaso com cinco tratamentos (genótipos) e quatro repetições, sendo que cada parcela experimental foi constituída por quatro linhas de plantio com seis metros de comprimento e 0,60 m entrelinhas, considerando-se para avaliação 20 plantas por parcela, das duas linhas centrais. Para a formação das mudas, utilizou-se do sistema de semeadura em bandejas de poliestireno expandido, com capacidade para 128 células, contendo substrato Plantmax Hortaliças® HT. As mudas foram transplantadas aos 10 dias após a semeadura. Avaliaram-se os genótipos JLM003, JLM004, JLM010, JLM024 e JLM030 quanto às características: precocidade; altura de inserção da primeira vagem (cm); número de vagens por planta; número de sementes por vagem; massa fresca das vagens por planta (g); massa fresca de 100 sementes (g); produtividade total estimada de grãos imaturos (kg ha-1); teor de umidade; proteínas; lipídeos; cinzas; carboidratos; isoflavonas e inibidores de tripsina Kunitz (KSTI). Na avaliação das principais características agronômicas, funcionais e antinutricionais, nas condições deste experimento, pode-se concluir que o genótipo de soja-hortaliça JLM010 é o mais recomendado para a região de Jaboticabal-SP, por apresentar melhores características agronômicas para produção como hortaliça (136,04 g para massa fresca das vagens por planta, 92,52 g para massa fresca de 100 sementes e 11.121,22 kg ha-1para produtividade total estimada de grãos imaturos) e também se destacar quanto às propriedades funcionais. / The aim of this study was to evaluate the performance of five genotypes of vegetable soybean with respect to agronomic, functional and antinutritional characteristics. The experiments were conducted in the field, in the Sector of Vegetable Crops and Aromatic Medicinal Plants, in the UNESP-FCAV. The experimental design adopted was a randomized block design with five treatments (genotypes) and four repetitions. Each experimental parcel comprised four planting rows of six meters in length and 0.60 m between rows, and 20 plants per parcel, from the two center rows, were evaluated. Seedlings were started in Polystyrene trays with 128 cells containing the substrate Plantmax Hortaliças® HT. The seedlings were transplanted at 10 days after planting. The genotypes JLM003, JLM004, JLM010, JLM024 and JLM030 were evaluated with respect to the following characteristics: precocity, height to first pod (cm), number of pods per plant, number of seeds per pod, fresh weight of pods per plant (g), fresh weight of 100 seeds (g), estimated total productivity of immature seeds, moisture content, proteins, lipids, ash, carbohydrates, isoflavones and Kunitz trypsin inhibitor (KSTI). In the evaluated of principals characteristics agronomic, functional and antinutritional, in the conditions this study, conclude that: 1) the genotype JLM010 was found to be the most recommended for the region of Jaboticabal-SP, as it showed better agronomic characteristics for production as a vegetable (136,04 g for fresh weight of pods per plant, 92,52 g for fresh weight of 100 seeds and 11.121,22 kg ha-1 for estimated total productivity of immature seeds) and displayed better functional characteristics and also highlight on the functional properties.

Resumo: Objetivou-se avaliar o desempenho de cinco genótipos de soja-hortaliça, quanto às características agronômicas, funcionais e antinutricionais. O experimento foi conduzido em campo, no Setor de Olericultura e Plantas Aromático-Medicinais na UNESP-FCAV. O delineamento experimental adotado foi o de blocos ao acaso com cinco tratamentos (genótipos) e quatro repetições, sendo que cada parcela experimental foi constituída por quatro linhas de plantio com seis metros de comprimento e 0,60 m entrelinhas, considerando-se para avaliação 20 plantas por parcela, das duas linhas centrais. Para a formação das mudas, utilizou-se do sistema de semeadura em bandejas de poliestireno expandido, com capacidade para 128 células, contendo substrato Plantmax Hortaliças® HT. As mudas foram transplantadas aos 10 dias após a semeadura. Avaliaram-se os genótipos JLM003, JLM004, JLM010, JLM024 e JLM030 quanto às características: precocidade; altura de inserção da primeira vagem (cm); número de vagens por planta; número de sementes por vagem; massa fresca das vagens por planta (g); massa fresca de 100 sementes (g); produtividade total estimada de grãos imaturos (kg ha-1); teor de umidade; proteínas; lipídeos; cinzas; carboidratos; isoflavonas e inibidores de tripsina Kunitz (KSTI). Na avaliação das principais características agronômicas, funcionais e antinutricionais, nas condições deste experimento, pode-se concluir que o genótipo de soja-hortaliça JLM010 é o mais recomendado para a região de Jaboticabal-SP, por apresentar melhores características agronômicas para produção como hortaliça (136,04 g para massa fresca das vagens por planta, 92,52 g para massa fresca de 100 sementes e 11.121,22 kg ha-1para produtividade total estimada de grãos imaturos) e também se destacar quanto às propriedades funcionais. / Abstract: The aim of this study was to evaluate the performance of five genotypes of vegetable soybean with respect to agronomic, functional and antinutritional characteristics. The experiments were conducted in the field, in the Sector of Vegetable Crops and Aromatic Medicinal Plants, in the UNESP-FCAV. The experimental design adopted was a randomized block design with five treatments (genotypes) and four repetitions. Each experimental parcel comprised four planting rows of six meters in length and 0.60 m between rows, and 20 plants per parcel, from the two center rows, were evaluated. Seedlings were started in Polystyrene trays with 128 cells containing the substrate Plantmax Hortaliças® HT. The seedlings were transplanted at 10 days after planting. The genotypes JLM003, JLM004, JLM010, JLM024 and JLM030 were evaluated with respect to the following characteristics: precocity, height to first pod (cm), number of pods per plant, number of seeds per pod, fresh weight of pods per plant (g), fresh weight of 100 seeds (g), estimated total productivity of immature seeds, moisture content, proteins, lipids, ash, carbohydrates, isoflavones and Kunitz trypsin inhibitor (KSTI). In the evaluated of principals characteristics agronomic, functional and antinutritional, in the conditions this study, conclude that: 1) the genotype JLM010 was found to be the most recommended for the region of Jaboticabal-SP, as it showed better agronomic characteristics for production as a vegetable (136,04 g for fresh weight of pods per plant, 92,52 g for fresh weight of 100 seeds and 11.121,22 kg ha-1 for estimated total productivity of immature seeds) and displayed better functional characteristics and also highlight on the functional properties. / Orientadora: Leila Trevizan Braz / Coorientadora: Mercedes Concórdia Carrão-Panizzi / Banca: Arthur Bernardes Cecílio Filho / Banca: Marcelo Álvares de Oliveira / Mestre

Orientadores: Maria Ligia Rodrigues Macedo, Goran Nesic / Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T21:49:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_DesireeSoaresda_M.pdf: 1615013 bytes, checksum: e404c15f23a6cd6027750ac4c6e28c69 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As sementes são ricas fontes de inibidores de proteinases, que prejudicam sua qualidade nutricional, reduzindo a digestibilidade das proteínas e sua absorção. Neste estudo, um inibidor de tripsina (ApTI) foi purificado a partir de sementes de Adenanthera pavonina e testado seu efeito no crescimento e desenvolvimento de dois lepidópteros. Larvas de Anagasta kuehniella alimentadas com ApTI 1% mostraram redução de 50% na sobrevivência e no peso médio. Larvas de Anticarsia gemmatalis alimentadas com dieta contendo ApTI 0,5% apresentaram diminuição de 31% na sobrevivência e de 22% no peso médio. O tempo de desenvolvimento larval e pupal de Anagasta kuehniella alimentadas com a dieta contendo ApTI 1% foi maior, enquanto a porcentagem de adultos sobreviventes diminuiu em relação ao grupo controle. A avaliação nutricional de ApTI sobre o desenvolvimento larval de A. kuehniella mostrou redução na eficiência de conversão do alimento ingerido (ECI) e alimento digerido (ECD), e aumento na digestibilidade aproximada (AD) e no custo metabólico (CM). Em relação as larvas de A. gemmatalis, não houve efeito na (ECI), porém foi observado redução na (ECD) e aumento na (AD) e no (CM). Para examinar o efeito in vivo de ApTI sobre os insetos, as atividades das proteinases intestinais das larvas que se alimentaram com dietas livres do inibidor e contendo o inibidor a 0,25 - 1% foram comparadas através de ensaios enzimáticos e eletroforese em gel de atividade enzimática. Larvas de quarto instar de A. kuehniella alimentadas com dieta contendo ApTI 1% apresentaram diminuição na atividade tríptica do intestino e manutenção dessa nas fezes. Larvas de A. gemmatalis alimentadas em dieta contendo ApTI 0,5% mostraram diminuição da atividade tríptica do intestino e das fezes. Estes resultados sugerem que ApTI possui efeitos anti-metabólicos quando ingeridos por A. kuehniella e A.gemmatalis. / Abstract: Seeds are a major source of proteinases inhibitors, which cause nutrition quality damage and reduce the absorption and digestibility of proteins. In this study, a trypsin inhibitor (ApTI) was purified from Adenanthera pavonina seeds and their effect on growth and development tested in two Lepidoptera. Anagasta kuehniella larvae were fed with ApTI 1% showing a significant decrease in survival and larval weight (50%). A. gemmatalis fed with 0.5% ApTI showed a survival of 31% and decrease in weight of 22%, when compared with the control group. Larval and pupal developmental time of Anagasta kuehniella larvae, fed on an ApTI diet at 1% was significantly longer, and the percentage of surviving adults decreased. The nutritional effect of ApTI on A. kuehniella larval development was to decrease the conversion of ingested food (ECI) and digested food (ECD) efficiency, and increase estimated digestibility (AD) and metabolic cost (CM). ApTI had no effect on A. gemmatalis conversion of ingested food efficiency. However, a decrease in the conversion of digested food efficiency (ECD) and increase in estimated digestibility (AD) and metabolic cost (CM) were observed. Enzymatic assays and electrophoreses were performed in order to evaluate the in vivo ApTI effect of larval intestinal proteinase activities between those that were not fed with the inhibitor and those fed with inhibitor (0.25 - 1%). A. kuehniella four instars larvae fed with 1% ApTI showed a reduction in intestinal tryptic activity and maintenance of feces tryptic activity. A. gemmatalis fed with 0.5% ApTI suffered a reduction in intestinal and feces tryptic activities. These results suggest that ApTI presents considerable anti-metabolic effects in A. kuehniella and A. gemmatalis. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarlosEMG.pdf: 434119 bytes, checksum: cffd1dddf77ec049b23dadc1bfa89773 (MD5) Previous issue date: 2004-12-20 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / A proteinaceous trypsin inhibitor was purified from Crotalaria pallida seeds by ammonium sulphate fractionation, affinity chromatography on immobilized Trypsin-Sepharose and TCA precipitation. The trypsin inhibitor, named ITC, had Mr of 32.5 kDa by SDS-PAGE and was composed by two subunits with 27.7 and 5.6 kDa linked by disulphide bridges, a typical characteristic of Kunitz-Inhibitor family. ITC was stable until 50?C, and at 100?C its residual activity was of about 60%. Also, ITC was stable at pHs 2 to 12. The inhibition of trypsin by ITC was non-competitive, with a Ki of 8,8 x 10-7M. ITC inhibits weakly other serine proteinases such as chymotrypsin and elastase. The inhibition of papain (44% of inhibition), a cysteine proteinase was an indicative of the bi-functionality of ITC. In vitro assays against digestive proteinases from several Lepdoptera, Diptera and Coleoptera pests were made. ITC inhibited in 100% digestive enzymes of Ceratitis capitata (fruit fly), Spodoptera frugiperda and Alabama argillacea, the last one being a cotton pest. It also inhibited in 74.4% Callosobruchus maculatus (bean weevil) digestive enzymes, a Coleoptera pest. ITC, when added in artificial diet models, affected weakly the development of C. capitata larvae and it had a WD50 of 2.65% to C. maculatus larvae / Um inibidor de proteinase foi isolado de sementes de Crotalaria pallida por fracionamento com sulfato de am?nio, cromatografia de afinidade em Sepharose com tripsina acoplada e precipita??o com ?cido tricloroac?tico (TCA). O inibidor de tripsina, denominado ITC, possui massa molecular de 32,5 kDa determinada por SDS-PAGE e ? composto por duas subunidades, uma de 25,7 e outra de 5,6 kDa, ligadas por pontes dissulfeto; uma caracter?stica t?pica da fam?lia de inibidores de Kunitz. ITC foi est?vel at? 50?C e a 100?C sua atividade residual foi cerca de 60%. ITC tamb?m foi est?vel em valores de pHs variando de 2 a 12. A inibi??o da tripsina por ITC ? do tipo n?o-competitivo, com um Ki de 8,8 x 10-7M. ITC inibe fracamente outras proteinases ser?nicas como quimotripsina e elastase. A inibi??o da papa?na (44%), uma proteinase ciste?nica, foi indicativa da bifuncionalidade de ITC. Ensaios in vitro contra proteinases digestivas de v?rios insetos praga das ordens Lepidoptera, Diptera e Coleoptera foram realizados. ITC inibiu em cerca de 100% enzimas digestivas de Ceratitis capitata (mosca-das-frutas), Spodoptera frugiperda (lagarta do cartucho do algod?o), e Alabama argillacea (curuquer? do algod?o). ITC tamb?m inibiu em 74,4% enzimas digestivas de Callosobruchus maculatus (broca do feij?o) uma praga da ordem Coleoptera. ITC, quando adicionado a dietas artificiais, afetou fracamente o desenvolvimento de larvas de C. capitata e teve um WD50 de 2,65% contra larvas de C. maculatus

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Inibidores de proteases vegetais sÃo proteÃnas de baixa massa molecular, geralmente presentes em altas concentraÃÃes nos tecidos de armazenamento, particularmente em sementes de plantas pertencentes à famÃlia Fabaceae. Neste estudo, um inibidor de proteases pertencente à famÃlia Bowman-Birk (LzaBBI) foi purificado a partir do extrato salino de sementes de Luetzelburgia auriculata. ApÃs fervura desse extrato salino, o inibidor foi purificado por cromatografia de afinidade em matriz de anidrotripsina-Sepharose 4B, seguido de cromatografia em matriz de troca iÃnica (DEAE Sepharose) e cromatografia em fase reversa. Em condiÃÃes redutoras, ou nÃo, o LzaBBI apresentou massa molecular aparente de 17,3 kDa, e uma Ãnica cadeia polipeptÃdica. Sua sequÃncia NH2-terminal possui alta similaridade com inibidores do tipo Bowman-Birk de leguminosas. O LzaBBI permaneceu estÃvel apÃs fervura a 98 ÂC por 120 min, bem como apÃs incubado na faixa de pHs entre 2 a 11. AlÃm de possuir relevante estabilidade estrutural, de importÃncia para futuras aplicaÃÃes biotecnolÃgicas, apresentou efeito negativo no crescimento da bactÃria Staphylococcus aureus, quando em baixas concentraÃÃes. / Plant protease inhibitors are proteins of low molecular weight, usually present in high concentrations in storage tissues, particularly in seeds of species belong to the Fabaceae family. In this study, a Bowman-Birk protease inhibitor (LzaBBI) was purified from the saline extract of the Luetzelburgia auriculata seeds After boiling of this saline extract, the inhibitor was purified by affinity chromatography on Sepharose 4B-anhydrotrypsin, followed by ion exchange chromatography on DEAE Sepharose and reverse phase chromatography. Under reducing conditions or not, LzaBBI showed an apparent molecular mass of 17.3 kDa and a single polypeptide chain. The NH2-terminal sequencing of the LzaBBI showed high similarity with other Bowman-Birk inhibitors of legumes. LzaBBI remained stable after boiling at 98 ÂC for 120 min and also remained stable with trypsin inhibitory activity after incubation in pH buffers with pHs varying from 2 to 11. In addition to its relevant structural stability, of importance in future biotechnological applications, LzaBBI showed negative impact on the Staphylococcus aureus development when at low doses.

Orientador: Maria Lígia Rodrigues Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:07:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_DesireeSoaresda_D.pdf: 3168437 bytes, checksum: b863b3429e08cd7ff7926b540a4d69b5 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Inibidores de peptidases (IPs) são proteínas vegetais envolvidas nos mecanismos de defesa contra herbívoros e patógenos. São considerados agentes antimetabólicos, uma vez que sua presença na dieta de insetos compromete seu desenvolvimento normal. Este efeito se dá através da formação de complexos entre os IPs e as enzimas digestivas, comprometendo assim o processo digestivo dos insetos. Neste trabalho, investigamos efeitos do inibidor de tripsina de sementes de Adenanthera pavonina (ApTI) sobre o desenvolvimento de dois insetos-praga, a broca-da-cana (Diatraea saccharalis) e a lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda). Bioensaios, estudos bioquímicos e de proteômica, foram realizados a fim de determinar o efeito de ApTI sobre o desenvolvimento destes insetos. A exposição aguda de larvas de D. saccharalis ao ApTI diminuiu a atividade das tripsinas e quimotripsinas em 87% e 63%, respectivamente. ApTI afetou o desenvolvimento deste inseto como observado através da diminuição na viabilidade larval (55%) e pupal (20,6%). Larvas oriundas da geração F1 apresentaram efeitos similares aos observados na geração F0, como redução no peso (23%) e na taxa de sobrevivência (33%). Análises bioquímicas revelaram que o inibidor foi refratário à digestão pelas peptidases de D. saccharalis e que o perfil de enzimas digestivas permaneceu sensível à inibição por quantidades crescentes de ApTI. Entretanto, não foi possível realizar a identificação das proteínas do intestino desta lagarta por espectrometria de massas. Larvas de S. frugiperda foram criadas em dieta contendo 0,5% de ApTI. Ao final dos experimentos, uma redução no peso médio larval de 30% foi observada. Porém, diferentemente dos resultados obtidos para D. saccharalis, as enzimas das larvas alimentadas com ApTI mostraram-se resistentes à inibição, sugerindo que esta espécie adapta-se à dieta contendo inibidor. O sequenciamento das proteínas presentes nos fluidos intestinais de S. frugiperda permitiu a identificação de 41 proteínas. Dentre elas foi possível identificar serinopeptidases do tipo tripsina e quimotripsina, proteínas estruturais, enzimas quinases e fosfatases. Nossos resultados demonstram que são necessários novos estudos para obtenção de mais informações acerca das proteínas presentes no fluido intestinal de S. frugiperda, para correlacionarmos sua expressão diferencial em larvas submetidas a diferentes tratamentos, conhecendo desta maneira um novo indício sobre os mecanismos adaptativos desta espécie contra os IPs / Abstract: Peptidase inhibitors (PIs) are plant proteins involved in defense mechanisms against herbivores and pathogens. They are considered antinutritional compounds, since their presence in insect diet hinder the normal larval development. This effect is due the complexation between PIs and peptidases, affecting the insect digestive process. In this work, we investigated the effects of trypsin inhibitor from Adenanthera pavonina seeds (ApTI) on the development of two pest insects: the sugarcane borer (Diatraea saccharalis) and the fall armyworm (Spodoptera frugiperda). Biochemical and proteomic studies were carried out in order to determine the ApTI effects on the development of these insects. The acute exposure of sugarcane borer to ApTI reduced the trypsin and chymotrypsin activities in 87% and 63%, respectively. The effect of ApTI on development of sugarcane borer was noticed by reduced larval (23%) and pupal viability (33%). Biochemical analysis revealed that the inhibitor was refractory to digestion by D. saccharalis peptidases and the enzymes maintained sensibility to inhibition by increasing amounts of ApTI. However, it was not possible to identify proteins from sugarcane borer gut through mass spectrometry approach. S. frugiperda larvae were reared in artificial diet containing 0.5% ApTI and a reduction in average larval weight of 30% was noticed. But, differently of D. saccharalis, S. frugiperda midgut enzymes became resistant to inhibition by ApTI, showing that this species adapted to ApTI-diet. From the sequencing of S. frugiperda gut fluid proteins we identified 41 proteins. Among them, we identified trypsin and chymotrypsin enzymes, structural proteins and quinases and phosphatases enzymes. Our results demonstrated that further researches are necessary in order to obtain more information about proteins from S. frugiperda gut fluid. The correlation between differential expressed proteins in larvae submitted to different treatments is crucial to reach new indicatives about the adaptive mechanisms this species evolve against PIs / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

INTRODUÇÃO: A prevalência de asma tem crescido e a maioria dos pacientes com asma grave não obtém o controle total dos sintomas com as terapias disponíveis, fazendo-se necessária a busca por novas alternativas terapêuticas. Inibidores de proteinases têm sido estudados como tratamento de processos inflamatórios, dentre eles o Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) OBJETIVO: Avaliar se o inibidor de proteinase EcTI modula a hiperresponsividade brônquica à metacolina, inflamação, remodelamento e estresse oxidativo nas vias aéreas e septos alveolares em um modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Vinte e quatro camundongos Balb/c machos, entre seis e sete semanas de vida, pesando em media 25 g foram divididos em quatro grupos: C (controle), OVA (sensibilizados com ovalbumina, 50 ug intraperironeal (i.p) nos dias 0 e 14 e desafiados nos dias 22, 24, 26, 28); C+EC (controle tratados com EcTI (2 mg/kg/i.p) nos dias 22 a 28); OVA+EC (sensibilizados e desafiados com ovalbumina e também tratados com EcTI (2 mg/kg -i.p) nos dias 22 a 28). No dia 29, foram realizadas realizadas: (i) hiperresponsividade à metacolina e obtidas as respostas máximas de resistência e elastância do sistema respiratório; (ii) análise histopatológica do pulmão para quantificação de eosinófilos, fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas (VA) e nos septos alveolares (SA); e (iii) imunohistoquímica para quantificação de células positivas para IFN-y, IL-4, IL-5, IL-13, MMP-9, TIMP-1, TGF-beta, iNOS, NF-kB e fração de volume de isoprostano nas VA e nos SA. Uma semana após o dia 29 foi realizada a técnica de anafilaxia cutanea passiva(PCA) para quantificar IgE e IgG1. A significância foi considerada quando p < 0,05. RESULTADOS: Houve aumento de todos os parâmetros avaliados no grupo OVA em relação ao grupo controle (p < 0,05). Houve atenuação da resposta máxima de Rrs e Ers no grupo OVA+EC comparado as grupo OVA (p < 0,05). O tratamento com EcTI nos animais sensibilizados atenuou o número de eosinófilos, células positivas para IL-4, IL-5, IL-13,IFN-y, iNOS, MMP-9, TIMP-1, NF-kB e TGF-beta e fração de volume de isoprostano, fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas e nos séptos alveolares quando comparado ao grupo OVA (p < 0,05).Houve reaçao de PCA nos animais sensibilizados com ovalbumina. CONCLUSÃO: EcTI atenuou a hiperresponsividade brônquica, a inflamação, o remodelamento e o estresse oxidativo nesse modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. Embora sejam necessários mais estudos, esse inibidor pode ser considerado uma futura ferramenta farmacológica para o tratamento de asma / BACKGROUND: The number of cases of asthma has grown in recent decades. People who have severe asthma are likely to have more attacks and are at greater risk of a fatal attack, which propose to keep up global attention and keep approaching for advances in asthma care. Proteinase inhibitors of vegetable origin have been studied as a modulator of inflammatory responses and diseases. Among these inhibitors is Enterolobium contortisiliquum Trypsin Inhibitor (EcTI). AIMS: To evaluate the effects of EcTI in pulmonary mechanical, eosinophilic recruitment, inflammatory cytokines, remodeling of extracellular matrix and oxidative stressin an experimental model of chronic allergic pulmonary inflammation. METHODS: Twenty-four young adult male pathogen-free mice BALB/c (6-7 weeks old, 25-30g) were divided into 4 groups: C (control), OVA (sensitized with ovalbumin, 50 ug intraperitoneal (i.p), on days 0 and 14 and challenged with ova 1%, on days 22, 24, 26, 28); C+EC (control treated with EcTI- 2 mg/kg/i.p. from days 22 to 28); OVA+EC (sensitized and challenged with ovalbumin and treated with EcTI (2 mg/kg/i.p) from days 22 to 28). At day 29, we performed: (i) Bronchial hyperresponsiveness to methacholine and obtained the maximum response of resistance (Rrs) and elastance (Ers) of the respiratory system; (ii) lung histopathological analysis by morphometry to quantify eosinophils, collagen and elastic fibers volume fraction in airways; and (iii) immunohistochemistry to quantify IFN-y, IL-4, IL-5, IL-13, MMP-9, TIMP-1, TGF-, iNOS, NF-kB positive cells and isoprostane volume fraction in airways. One week after the day 29 we performed PCA technique to quantify IgE and IgG1 antibodies. Significance was considered at p < 0.05. RESULTS: The EcTI treatment in the ovalbumin-sensitized animals attenuated the maximal response of resistance and elastance of respiratory system after methacholine, the number of eosinophils, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-y, NF-kB and iNOS-positive cells, isoprostane, elastic, collagen volume fraction, MMP-9, TIMP-1 and TGF-beta-positive cells compared to OVA group (p < 0.05). PCA was positive in sensitized animals. CONCLUSION: EcTI attenuates bronchial hyperresponsiveness, inflammation, remodeling and oxidative stress activation in this experimental asthma mice model. Although more studies are needed this inhibitor may be considered a future pharmacological tool for the treatment of asthma