Esta tesis se encuentra en proceso de registro como patente. / Antecedentes: La Enfermedad de Carrión es una patología importante que requiere un diagnóstico precoz para su manejo a fin de disminuir la morbimortalidad de la misma. Objetivo: Desarrollar una prueba inmunocromatográfica para la detección rápida de Bartonella bacilliformis usando anticuerpos policlonales de conejo etiquetados con oro coloidal. Metodología: Los anticuerpos policlonales contra Bartonella bacilliformis fueron obtenidos mediante la inmunización de conejos con la proteína GroEL de Bartonella bacilliformis. Se utilizó oro coloidal de 40 nm para la conjugación el anticuerpo primario obtenido. La sensibilidad analítica se evaluó con diferentes concentraciones de B. bacilliformis incluidas en un rango de 1x101 UFC/mL a 1x105 UFC/mL. La especificidad analítica o reacción cruzada se analizó con microorganismo de diferentes especies, incluyendo Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans, Chlamydophila pneumoniae, Escherichia coli y Candida spp. Resultados: Las concentraciones óptimas del anticuerpo de captura y el anticuerpo de revestimiento (línea T) fueron de 2 mg/mL y 0.2 mg/mL respectivamente. Se determinó que la sensibilidad analítica de la prueba se encuentra en un rango de 1x102 UFC/mL y 1x101 UFC/mL. No se evidenciaron reacciones cruzadas con los microorganismos evaluados. Se determinó que el tiempo de corrida óptimo para el registro de resultados es de 20 minutos y el volumen mínimo requerido de la muestra analizada fue de 50 µL. Conclusión: Se desarrolló la primera prueba inmunocromatográfica para la detección rápida, sensible y específica de Bartonella bacilliformis utilizando anticuerpos policlonales contra la proteína GroEL, la cual deberá ser validada mediante estudios posteriores. / Background: Carrión's disease is an important disease that requires a timely diagnosis and management to reduce its morbimortality. Objective: Develop a lateral flow assay for the rapid detection of Bartonella bacilliformis using colloidal gold-labeled rabbit polyclonal antibodies. Materials and methods: Polyclonal antibodies against Bartonella bacilliformis were produced by the immunization of rabbits with GroEL protein purified from Bartonella bacilliformis. Colloidal gold of 40 nm was used for the conjugation process with the rabbit polyclonal antibodies. The analytical sensitivity was evaluated by testing solutions of B. bacilliformis with different concentrations ranging between 1 x 101 to 1 x 105 CFU/mL. Analytical specificity was determined by testing cross-reactivity with microorganisms from different species, including Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans, Chlamydophila pneumoniae, Escherichia coli and Candida spp. Results: The optimal concentrations for the capture antibody and the coating antibody (T-line) were 2 mg / mL and 0.4 mg / mL, respectively. The analytical sensitivity was determined to be between 1x102 CFU/mL and 1x101 CFU/mL. There were no cross-reactions observed with the groups of bacteria used in this study. We determined that the flowing time and volume required for an optimum signal to be generated was 20 minutes and 50 µL, respectively. Conclusions: We developed the first gold-based lateral flow assay for the rapid, sensitive and specific detection of Bartonella bacilliformis using polyclonal antibodies against the protein GroEL, which needs to be validated in future studies. / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La infección por parvovirus canino tipo 2 (CPV-2) es una de las principales causas de enteritis hemorrágica en perros de todo el mundo y contar con una técnica de diagnóstico que sea altamente sensible es fundamental para Médicos Veterinarios, dueños y criadores de perros. En este trabajo se implementó un protocolo que utiliza la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) convencional para detectar un fragmento del ADN de CPV-2 a partir de heces de perros con signología clínica correspondiente a parvovirosis canina. En total se recolectaron y analizaron 12 muestras de heces que resultaron positivas con la PCR convencional, lo que fue confirmado mediante la secuenciación de los fragmentos obtenidos y contrastados con las secuencias de las distintas variantes de CPV-2 descritas en la base de datos GenBank. Las mismas muestras fueron analizadas con una prueba rápida, que corresponde a una técnica de inmunocromatografía (IC) de uso rutinario en la consulta veterinaria. En este caso de las 12 muestras analizadas, sólo un 41,7% resultaron positivas, evidenciando una menor sensibilidad que la técnica molecular para el diagnóstico de parvovirus canino. Adicionalmente, se hizo un análisis de las secuencias nucleotídicas obtenidas arrojando una variabilidad promedio de 0,7%. Los resultados de este trabajo permiten establecer que la PCR convencional es una técnica de diagnóstico recomendable para la detección de parvovirus canino, no así las pruebas rápidas utilizadas en la consulta veterinaria que en este y otros estudios han mostrado constantemente su baja sensibilidad. Es importante destacar que el presente trabajo es la primera aproximación molecular al parvovirus canino tipo 2 en Chile / Infection with canine parvovirus type 2 (CPV-2) is one of the main causes of hemorrhagic enteritis in dogs worldwide and having a diagnostic technique that is highly sensitive is essential for veterinarians, dog owners and breeders. In this work, a protocol was implemented that uses the conventional Polymerase Chain Reaction (PCR) to detect a CPV-2 DNA fragment from feces of dogs with clinical signology corresponding to canine parvovirus. In total, 12 stool samples that were positive with conventional PCR were collected and analyzed, which was confirmed by sequencing the fragments obtained and contrasted with the sequences of the different variants of CPV-2 described in the GenBank database. The same samples were analyzed with a rapid test, which corresponds to a routine immunochromatography (IC) technique in the veterinary practice. In this case of the 12 samples analyzed, only 41.7% were positive, showing a lower sensitivity than the molecular technique for the diagnosis of canine parvovirus. Additionally, an analysis of the nucleotide sequences obtained was made, yielding an average variability of 0.7%. The results of this work allow to establish that conventional PCR is a recommended diagnostic technique for the detection of canine parvovirus, but not the rapid tests used in the veterinary practice that in this and other studies have consistently shown low sensitivity. It is important to note that the present work is the first molecular approach to canine parvovirus type 2 in Chile

La rápida propagación mundial de un nuevo coronavirus denominado SARS-CoV-2, detectado en la cuidad de Wuhan, China, hace necesario del conocimiento e implementación de métodos de diagnóstico confiables para detectar y tratar adecuadamente a los pacientes. Para ello, los métodos más utilizados para el diagnóstico son: la técnica de inmunocromatografía (IC), la cual enmarca tanto a las pruebas detectoras de anticuerpos como a la prueba de detección de antígenos; y las pruebas de diagnóstico molecular basadas en tecnología de PCR, detectando cuantitativa y cualitativamente al virus, como por ejemplo qRT-PCR y al LAMP. Mediante la revisión de las bases de Scielo, Pubmed y Scopus se compara la utilidad diagnóstica de las pruebas LAMP, qRT-PCR e IC aplicadas al diagnóstico de SARS-CoV-2, y cómo las distintas variantes del virus han impactado sobre la confiabilidad de estas pruebas.

[ES] El objetivo de la presente tesis doctoral es el estudio, desarrollo y validación de diferentes métodos inmunoquímicos que permitan determinar contaminantes químicos en alimentos de origen vegetal y en agua, de manera que contribuyan a mejorar su calidad y por ende la seguridad del consumidor. Spirotetramat es un plaguicida de nueva generación altamente eficiente, comercializado mundialmente para su uso como insecticida en multitud de cultivos agrícolas. Tiene propiedades sistémicas, ya que después de la absorción se transloca tanto a través del xilema como del floema, gracias a que es transformado por la planta en spirotetramat-enol, mucho más polar. En consecuencia, la definición de residuo de este insecticida en alimentos de origen vegetal para fines analíticos incluye también dicho metabolito. Por otro lado, anatoxina-a es un alcaloide secundario con neurotoxicidad aguda que se pueden encontrar en agua dulce. Esta toxina es producida por siete géneros diferentes de cianobacterias, y se ha detectado en lagos y otras fuentes de agua de todos los continentes. El análisis de sustancias como spirotetramat y anatoxina-a se lleva a cabo actualmente mediante métodos cromatográficos como HPLC-MS. Estas técnicas presentan una elevada sensibilidad y fiabilidad; sin embargo, requieren personal altamente cualificado y un equipamiento caro y no portable. Una opción complementaria son los métodos inmunoquímicos, como el ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) o el inmunoensayo de flujo lateral (LFIA, Lateral Flow ImmunoAssay), ya que son métodos de análisis rápidos y económicos, y además son muy versátiles permitiendo adaptarlos a necesidades analíticas particulares, como los ensayos de cribado de numerosas muestras o los ensayos portátiles con lectura visual de los resultados. A partir de una colección de bioconjugados y de anticuerpos de spirotetramat y de anatoxina-a se caracterizó la afinidad y especificidad de los inmunorreactivos con el fin de seleccionar parejas conjugado/anticuerpo aptas para el desarrollo de inmunoensayos tipo ELISA y LFIA competitivos. Se optimizaron las condiciones de ensayo, y se llevó a cabo un estudio de la influencia de diferentes factores fisicoquímicos sobre los parámetros analíticos de los ensayos seleccionados. Posteriormente se evaluó la influencia de la matriz alimentaria, particularmente uva, zumo de uva y vino, así como de aguas de diferente procedencia, sobre la señal y la sensibilidad de los inmunoensayos. La diferente afinidad de los anticuerpos hacia spirotetramat y spirotetramat-enol nos llevó a optimizar el tratamiento de muestra, incluyendo una etapa de hidrólisis para transformar spirotetramat en spirotetramat-enol de manera controlada, rápida y cuantitativa. De este modo se hizo posible aportar resultados en forma de suma de la concentración de ambos compuestos en la muestra, tal y como exige la legislación vigente. Además, para la extracción de residuos de este insecticida a partir de muestras de uva se puso a punto un procedimiento empleando la tecnología QuEChERS, y para la reducción de interferencias de vinos y zumos se utilizó polivinilpolipirrolidona. En el caso de las aguas, se aplicó una simple filtración para eliminar partículas en suspensión. Los inmunoensayos enzimáticos en microplaca optimizados para determinar de manera competitiva residuos de spirotetramat presentaron valores de IC50 para spirotetramat-enol en torno a 0.1 ng/mL, y límites de detección alrededor de 0.02 ng/mL. El estudio de la precisión y exactitud del método empleando muestras de alimentos dopados reflejó límites de cuantificación de 2.5 ng/mL para uva, zumos de uva y vinos, tanto blancos como tintos, muy por debajo de los límites máximos de residuos autorizados en la Unión Europea para este insecticida en dichos alimentos. / [EN] The aim of this doctoral thesis is the study, development and validation of different immunochemical methods for determining chemical contaminants in produce and water, in a way that they may contribute to improving food quality and therefore to assure consumer safety. Spirotetramat is a highly efficient new-generation pesticide, marketed worldwide for use as insecticide in many agricultural crops. It has systemic properties, since short after absorption it translocates through both the xylem and the phloem, thanks to the fact that it is transformed by the plant into the much more polar spirotetramat-enol. Consequently, the residue definition for this insecticide in foods of plant origin with analytical purposes also includes said metabolite. On the other hand, anatoxin-a is a secondary alkaloid with acute neurotoxicity that can be found in fresh water. This toxin is produced by seven different genera of cyanobacteria, and has been detected in lakes and other water resources on all continents. The analysis of substances like spirotetramat and anatoxin-a is currently carried out by chromatographic methods like HPLC-MS. These techniques are highly sensitive and reliable; however, they require highly qualified personnel and expensive, non-portable equipment. Nowadays, the immunochemical methods, such as the ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) or the LFIA (Lateral Flow ImmunoAssay), constitute excellent complementary analytical options to instrumental strategies, since they are fast and inexpensive analytical methods, and are also very versatile so they can be adapted to particular analytical needs, such as screening assays for large numbers of samples or portable tests with visual reading of the results. The antibody affinity and specificity from a collection of spirotetramat and anatoxin-a immunoreagents was characterized in order to select conjugate/antibody pairs suitable for the development of competitive ELISA and LFIA tests. The assay conditions were optimized, and a study of the influence of different physicochemical factors over the analytical parameters of the selected immunoassays was carried out. Subsequently, the influence of the food matrix, particularly grape, grape juice and wine, as well as water from different sources, over the assay signal and sensitivity was evaluated. The different affinity of the available antibodies towards spirotetramat and spirotetramat-enol led us to optimize the sample treatment procedure, so a hydrolysis step to transform spirotetramat into spirotetramat-enol in a controlled, rapid and quantitative way, was included. Thus, it was possible to provide results in the form of the sum of the concentration of both compounds in the sample, as required by current legislation. In addition, a procedure using QuEChERS technology was developed to extract residues of this insecticide from grape samples, and polyvinylpolypyrrolidone was used to reduce interferences from wines and juices. In the case of waters, a simple filtration was applied to remove suspended particles. Microplate enzyme immunoassays that were optimized to competitively determine spirotetramat residues showed IC50 values for spirotetramat-enol around 0.1 ng/mL, and limits of detection around 0.02 ng/mL. Precision and accuracy studies with these immunoassays using fortified food samples reflected limits of quantification of 2.5 ng/mL for grapes, grape juices and wines, both white and red, well below the maximum residue limits authorized by the European Union for this insecticide in such foodstuffs. Finally, a comparative study with HPLC-MS/MS validated the studied immunoassay for analyzing spirotetramat residues in grape samples within a wide range of concentrations. / [CA] L’objectiu de la present tesi doctoral és l’estudi, desenvolupament i validació de diferents mètodes immunoquímics que permeten determinar contaminants químics en aliments d’origen vegetal i en aigua, de manera que contribuïsquen a millorar la seua qualitat i per tant la seguretat dels consumidors. Spirotetramat és un plaguicida de nova generació altament eficient, comercialitzat mundialment per a l’ús com insecticida en multitud de cultius agrícoles. Té propietats sistèmiques, ja que en ser absorbit es transloca tant a través del xilema com del floema, gràcies a que és transformat per la planta en spirotetramat-enol, molt més polar. Conseqüentment, la definició de residu d’aquest insecticida en aliments d’origen vegetal amb finalitats analítiques inclou també l’esmentat metabòlit. D’una altra banda, anatoxina-a és un alcaloide secundari amb neurotoxicitat aguda que es pot trobar en aigua dolça. Aquesta toxina és produïda per set gèneres de cianobacteris diferents, i s’ha detectat en llacs i altres fonts d’aigua de tots els continents. L’anàlisi de substàncies com spirotetramat i anatoxina-a es duu a terme actualment mitjançant mètodes cromatogràfics, com HPLC-MS. Aquestes tècniques presenten una elevada sensibilitat i fiabilitat; tanmateix, requereixen personal altament qualificat i un equipament car i no portable. Una opció complementària són els mètodes immunoquímics, com l’ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) o l’immunoassaig de flux lateral (LFIA, Lateral Flow Immunoassay), ja que són mètodes d’anàlisi ràpids i econòmics, i a més són molt versàtils, la qual cosa permet adaptar-los a necessitats analítiques particulars, com són els assaigs per destriar nombroses mostres o els assaigs portàtils amb lectura visual dels resultats. A partir d’una col·lecció de bioconjugats i d’anticossos de spirotetramat i d’anatoxina-a es va caracteritzar l’afinitat i especificitat dels immunorreactius amb la finalitat de seleccionar parelles conjugat/anticòs aptes per desenvolupar immunoassaigs tipus ELISA i LFIA competitius. S’optimitzaren les condicions d’assaig, i es va dur a terme un estudi de la influència de diferents factors fisicoquímics sobre els paràmetres analítics dels assaigs seleccionats. Posteriorment, es va avaluar la influència de la matriu alimentària, particularment raïm, suc de raïm i vi, així com d’aigües de diferent procedència, sobre el senyal i la sensibilitat dels assaigs. La diferent afinitat dels anticossos cap a spirotetramat i spirotetramat-enol ens va dur a optimitzar el tractament de mostra mitjançant la inclusió d’una etapa d’hidròlisi per transformar spirotetramat en spirotetramat-enol de manera ràpida, controlada i quantitativa. D’aquesta manera es va fer possible aportar resultats en forma de suma de la concentració d’ambdós composts en la mostra, tal i com exigeix la legislació vigent. A més a més, per extraure residus d’aquest insecticida a partir de mostres de raïm es va posar a punt un procediment emprant la tecnologia QuEChERS, i per reduir interferències de vins i sucs es va utilitzar polivinilpolipirrolidona. En el cas de les aigües, es va aplicar una simple filtració per eliminar partícules en suspensió. Els immunoassaigs enzimàtics en microplaca optimitzats per determinar de manera competitiva residus de spirotetramat presentaren valors d’IC50 per spirotetramat-enol al voltant de 0.1 ng/mL, i límits de detecció propers a 0.02 ng/mL. L’estudi de la precisió i exactitud del mètode emprant mostres d’aliments dopats va reflectir límits de quantificació de 2.5 ng/mL per raïm, sucs de raïm i vins, tant blancs com negres, molt per sota dels límits màxims de residus autoritzats per la Unió Europea per a aquest insecticida en els esmentats aliments. Finalment, un estudi comparatiu amb HPLC-MS/MS va validar l’immunoassaig estudiat per analitzar residus de spirotetramat en mostres de raïm en un ampli rang de concentracions. En el cas d’anatoxina-a, es van optimitzar dos immunoassaigs tipus ELISA competitiu, els valors d’IC50 dels quals van estar entre 0.5 i 1.0 ng/mL, amb límits de detecció per davall de 0.1 ng/mL. L’anàlisi de diferents tipus d’aigües fortificades amb anatoxina-a ens va revelar que els immunoassaigs desenvolupats permeten quantificar aquesta cianotoxina entre 0.5 i 500 ng/mL. Addicionalment es van optimitzar i caracteritzar assaigs immunocromatogràfics, tipus tires reactives, tant per spirotetramat com per anatoxina-a, vàlids com a tècniques portables i ràpides per determinar semi-quantitativament aquestes substàncies tòxiques en vi i aigües, respectivament. Seguint la normativa europea per a mètodes ràpids front a petites molècules orgàniques, es va determinar el senyal indicatiu del llindar per distingir les mostres positives, que superen la concentració de destriament establerta, de les negatives. En el cas de spirotetramat, el mètode desenvolupat permet el triatge, tant instrumental com visual, amb un interval de confiança del 99%, de mostres de vi amb una concentració de residu de 1000 ng/mL, equivalent al límit màxim de residus, expressada como la suma de spirotetramat més spirotetramat-enol. Per anatoxina-a, les tires immunocromatográfiques desenvolupades van poder detectar mostres d’aigua amb 2 ng/mL de l’esmentada cianotoxina amb una fiabilitat del 99%, i mostres amb 1 ng/mL amb una probabilitat del 40%, mentre que el límit de detecció visual va ser de 3 ng/mL. / A la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación (SENESCYT), del gobierno de la República de Ecuador que al adjudicarme la beca bajo el “PROGRAMA DE BECAS PARA DOCTORADO (PHD) PARA DOCENTES DE UNIVERSIDADES Y DE ESCUELAS POLITÉCNICAS 2015”, permitió formarme como persona y profesional en mis estudios de doctorado. / Cevallos Cedeño, RE. (2020). Desarrollo de métodos inmunoquímicos para la determinación de sustancias tóxicas en alimentos y aguas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/149570 / TESIS