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Regulation of lipid signaling at the Golgi by the lipid phosphatases hSAC1 and OCRL1Cheong, Fei Ying. January 2007 (has links)
Heidelberg, Univ., Diss., 2007.
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Analysis and Quantification of Inositol Poly- and Pyrophosphates by NMR Spectroscopy and Mass SpectrometryPuschmann, Robert 22 January 2020 (has links)
Inositolpyrophosphate (PP-InsP) sind eine Gruppe sekundärer Signalmoleküle, die in einer Vielzahl zellulärer Prozesse, von Phosphathomeostase über Insulinsignalisierung bis Apoptose eine Rolle spielen. Die Art und Weise, wie PP-InsPs ihre Funktion ausführen, noch weitgehend unbekannt. Deshalb wurden zwei neue analytische Methoden basierend auf Kernspinresonanzspektroskopie und Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (LCMS) entwickelt.
Um die limitierende Sensitivität der Kernresonanzspektroskopie zu umgehen, wurde die Synthese von kernspinresonanzaktivem, 13C-markiertem Inositol optimiert. Des Weiteren wurde eine chemoenzymatische Synthese für alle Säugetier-PP-InsP-Isomere entwickelt, die auf der skalierbaren Ausfällung mittels Mg2+ Ionen basiert. Menschliche Zellen wurden mit 13C-Inositol isotopenmarkiert und in den Spektren der Zellextrakte wurde, basierend auf den PP-InsP-Standards, Fingerabdrucksignale identifiziert mit denen die Konzentrationen der dazugehörigen Moleküle bestimmt werden konnte.
Die LCMS basierte Methode wurde auf dem Prinzip der Umsetzung von hochgeladenen Inositolpyrophosphaten zu ihren korrespondieren Methylestern mittels Trimethylsilyldiazomethan geplant. Die ungeladenen, permethylierten PP-InsPs wären geeignet für LC-Auftrennungen und MS-Messungen und sollten eine von Kernspinresonanzspektroskopie nicht erreichbare Sensitivität ermöglichen. Die Methode wurde mittels Inositolhexakisphosphat (InsP6), einem einfacheren PP-InsP-Analog, etabliert und methyliertes InsP6 konnte in Mengen von 10 femtomol detektiert werden. Die Adaption der Methode für die PP-InsPs gestaltete sich jedoch herausfordernd, da der Analyt während der Reaktion zersetzt wurde. Ein Wechsel zu Diazomethan als Methylierungsagens zeigte vielversprechende Resultate. / Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are a well conserved group of second messengers that are involved in a plethora of cellular processes including phosphate homeostasis, insulin signaling, and apoptosis. Despite much effort, it is still mostly unknown how PP-InsPs exert their diverse functions. In order to decipher the mechanisms, researchers have relied either on metabolic labeling with radioactive inositol or on electrophoretic separation on polyacrylamide gels but these methods either lack ease of use or sensitivity. Therefore, two new analytical tools, based on nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, and liquid chromatography coupled mass spectrometry (LCMS), were developed.
To overcome the limited sensitivity provided by NMR spectroscopy, a high yielding synthesis of NMR-active 13C-labeled inositol was designed and optimized. Furthermore, a chemoenzymatic synthesis of all mammalian PP-InsPs isomers was developed that relied on a scalable purification strategy utilizing precipitation with Mg2+ ions. Human cells were metabolically labeled with 13C-inositol and the prepared PP-InsPs were used as standards to identify peaks in the NMRspectra. These fingerprint signals enabled the quantification of the corresponding molecules.
The LCMS-based method was based on the derivatization of the highly charged inositol pyrophosphates to their corresponding methyl esters by trimethylsilyldiazomethane. The permethylated InsPs and PP-InsPs were suitable for LC separation and MS measurement, and provide a sensitivity unmatched by NMR spectroscopy. The method was established using inositol hexakisphosphate, a simpler analog of PP-InsPs, and methylated InsP6 could be detected at quantities as low as 10 femtomole. However, the adaptation of the derivatization for PP-InsPs proved challenging as the reaction caused degradation of the analyte but strategies to circumvent the decay by changing the derivatization agent to diazomethane were promising.
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Requirement of phosphoinositol-derived signals in the wounding response of Arabidopsis thaliana / Die Rolle von Phosphoinositol-Signalen in der Verwundungsantwort von Arabidopsis thalianaMosblech, Alina 04 October 2010 (has links)
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New Analytical Tools to Interrogate Inositol Pyrophosphate SignalingHarmel, Robert Klaus 26 June 2020 (has links)
Inositolpyrophosphate (PP-InsPs) sind eine wichtige Gruppe eukaryotischer Botenstoffe, die mit verschiedenen Prozessen wie Apoptose, Phosphathomeostase und Insulinsignalkaskaden verknüpft sind. Trotz ihrer Entdeckung vor mehr als 20 Jahren bleibt es eine Herausforderung, die Signalmechanismen dieser Moleküle zu verstehen. Ursachen dafür sind der limitierte Zugang zu synthetischen PP-InsPs und ein Mangel an allgemein zugänglichen analytischen Methoden. Daher wurden in dieser Arbeit chemische und analytische Verfahren entwickelt, um unser Verständnis von diesen Molekülen sowohl auf ein biochemischer als auch auf zelluläre Ebene zu verbessern.
Um der Knappheit an synthetischen PP-InsPs entgegen zu wirken, wurde eine hocheffiziente chemoenzymatische Synthese entwickelt, bei der mehr als 100 mg aller wesentlichen PP-InsPs aus Säugern hergestellt werden konnten. Parallel wurde ein neues analytisches Werkzeug entwickelt, dass Konzentrationen von PP-InsPs in komplexen Proben quantifizieren konnte. Mittels Enzymkatalyse konnten 13C-markiertes myo-inositol und 13C-markierte PP-InsPs hergestellt werden und niedrige Konzentrationen mit nuklearer Magnetresonanzspektroskopie detektiert werden. In vitro waren diese Verbindungen sehr nützlich, um PP-InsP Kinasen von Pflanzen und Säugern zu charakterisieren. Endogene Konzentrationen von PP-InsPs konnten durch metabolisches Markieren mit 13C-markiertem myo-inositol in humanen Zelllinien quantifiziert werden. Letztendlich wurde mittels eines neuen entwickelten proteomischen Ansatzes endogene Proteinpyrophosphorilierung, eine von PP-InsP eingebaute posttranslationale Proteinmodifikation, in menschlichen Zelllinien zum ersten Mal nachgewiesen.
Zusammenfassend haben die aufgelisteten chemischen und analytischen Werkzeuge ein hohes Potenzial unser Verständnis der Signalmechanismen hinter den diversen Phänotypen der PP-InsPs zu stärken und Forschungsarbeit in dieser Richtung zu beschleunigen. / Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of second messengers that intersect with a wide range of processes in eukaryotic cells including phosphate homeostasis, insulin signaling and apoptosis. Despite their discovery more than two decades ago, elucidating the underlying signaling mechanisms remains a significant challenge. Therefore, a new set of chemical and analytical methods was developed here to improve our understanding of these intriguing molecules on the biochemical and cellular level.
To overcome the shortage of synthetic PP-InsPs, a highly efficient and scalable chemoenzymatic approach was designed and the major mammalian PP-InsPs could be obtained in hundreds of milligram quantities and in high purity. In parallel, a new analytical tool was developed to quantify levels of PP-InsPs in complex samples. Chemoenzymatic access to 13C-labeled myo-inositol and 13C-labeled PP-InsPs enabled the detection of low concentrations of PP-InsPs using nuclear magnetic resonance spectroscopy. In vitro, these compounds were of great use for the biochemical characterization of PP-InsPs kinases from mammals and plants. Endogenous pools of PP-InsPs from human cell lines were identified and quantified by metabolic labeling with 13C-labeled myo-inositol. Finally, a new proteomics workflow towards the detection of protein pyrophosphorylation, a posttranslational modification mediated by PP-InsPs, using mass spectrometry was optimized and endogenously modified mammalian proteins could be identified for the first time and with high confidence.
Taken together, the chemical and analytical tools presented here have great potential to accelerate the understanding of PP-InsP signaling and metabolism. Access to large amounts of PP-InsPs together with a reliable quantification method and the detection of endogenous protein pyrophosphorylation sites will be essential to unravel the signaling mechanisms underlying the diverse phenotypes associated with these metabolites.
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Elucidation of Inositol Polyphosphate Dephosphorylation Pathways using Stable-Isotope Labelling and NMR spectroscopyNguyen Trung, Minh 29 September 2023 (has links)
Inositolpolyphosphate (InsPs) bilden eine ubiquitäre Gruppe an hochphosphorylierten, intrazellulären Signalmolekülen in eukaryotischen Zellen. Trotz deren Beteiligung an unzähligen biologischen Prozessen bleibt die Detektion von InsPs (insb. einzelner Enantiomere) eine Herausforderung, da die momentan verfügbaren Analysemethoden immer noch limitiert sind. In der vorliegenden Arbeit wird die stabile Isotopenmarkierung von myo-Inositol (Ins) und InsPs in Kombination mit Kernspinresonanzspektroskopie (engl. Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, NMR) erkundet, um diese Lücke zu schließen. Die Abhängigkeit von NMR-Daten und chemischer Struktur erlaubte die Analyse komplexer Mixturen aus InsPs aus in vitro-Experimenten und biologischen Proben. Durch stereospezifische 13C-Markierung konnten sogar Enantiomere voneinander unterschieden werden. Mit Hilfe dieser Methode wurden mehrere InsP-Stoffwechselwege untersucht. Als Erstes wurde das menschliche, Phytase-artige Enzym MINPP1 (engl. Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatase 1) detailliert in vitro und in lebenden Zellen charakterisiert. Dabei wurde ein bisher unbeschriebener InsP-Stoffwechselweg in menschlichen Zellen erstmals beschrieben. Als Zweites wurden InsP verdauende Bakterien aus der menschlichen Darmflora untersucht, sodass der Abbauweg von Inositolhexakisphosphat beleuchtet werden konnte. Als Drittes wurden DUSP-Enzyme (engl. Dual-Specificity Phosphatases) identifiziert und in vitro charakterisiert, die in der Lage sind, die Phosphoanhydrid-Bindung von Inositolpyrophosphaten (PP-InsPs) zu spalten. Die vorliegende Arbeit demonstriert, dass 13C-Markierung in Verbindung mit NMR ein mächtiges Werkzeug darstellt, um InsP-Stoffwechselvorgänge zu untersuchen. / Inositol polyphosphates (InsPs) comprise a ubiquitous group of densely phosphorylated intracellular messengers in eukaryotic cells. Despite their contributions to a myriad of biological processes the detection of InsPs remains challenging to this day, especially with regards to differentiating enantiomers, as the available analytical toolset is still limited. In this thesis the use of stable isotope labelling of myo-inositol (Ins) and InsPs is explored to address this shortcoming. Combining 13C-labelling and nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) provides both enhanced sensitivity and makes use of NMR’s strong structure-data dependency. This enabled the deconvolution of complex mixtures of InsPs from in vitro experiments or biological samples. With stereo-specific 13C-labels InsP mixtures could be resolved to individual enantiomers. Using this technique several InsP metabolic pathways were examined. Firstly, the human phytase-like enzyme Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatase (MINPP1) was characterized in depth in vitro and in living cells, establishing a hitherto undescribed inositol polyphosphate metabolic path in humans. Secondly, inositol phosphate digesting bacteria isolated from the human gut microbiome were investigated, shedding light on the metabolic fate of inositol hexakisphosphate in the digestive track. Thirdly, a set of Dual-Specificity Phosphatases (DUSPs) were identified to be able to hydrolyze the phosphoanhydride bond of inositol pyrophosphates (PP-InsPs) and characterized in vitro. The 13C-labelling approach of InsPs in junction with NMR represents a powerful tool for the study of inositol polyphosphate metabolism. In the thesis at hand, this method has facilitated our understanding of inositol polyphosphate pathways and it will be continuing doing so in the future in several biological contexts.
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