O Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) é a doença do neurodesenvolvimento mais comum na infância, afetando cerca de 5,8% de crianças e adolescentes no mundo. Muitos estudos vêm tentando investigar a suscetibilidade genética em TDAH, mas sem muito sucesso. Este estudo teve como objetivo analisar variantes raras e comuns contribuindo para a arquitetura genética do TDAH. Foram gerados os primeiros dados de exoma de TDAH de 30 trios brasileiros em que o filho foi diagnosticado com TDAH esporádico. Foram analisados tanto variações de único nucleotídeo (ou SNVs, single-nucleotide variants) quanto variações de número de cópias (ou CNVs, copy-number variants), tanto nesses trios quanto em outros conjuntos de dados, incluindo uma amostra brasileira de 503 crianças/adolescentes controles, bem como resultados previamente publicados em quatro estudos com variação de número de cópias e uma meta-análise de estudos de associação ao longo do genoma. Tanto os trios quanto os controles fazem parte da Coorte de Escolares de Alto Risco para o desenvolvimento de Psicopatologia e Resiliência na Infância do Instituto Nacional de Psiquiatria do Desenvolvimento (INPD). Os resultados de trios brasileiros mostraram três padrões marcantes: casos com variações herdadas e somente SNVs de novo ou CNVs de novo, e casos somente com variações herdadas. Embora o tamanho amostral seja pequeno, pudemos ver que diferentes comorbidades são mais frequentes em casos somente com variações herdadas. Após explorarmos a composição de variações nos probandos brasileiros, foram selecionados genes recorrentes entre amostras do nosso estudo ou em bancos de dados públicos. Além disso, usando somente genes expressos no cérebro (amostras pós-mortem dos projetos Brain Atlas e Genotype-Tissue Expression), construímos uma rede de interação proteína-proteína \"in silico\" com interações físicas confirmadas por pelo menos duas fontes. Análises topológicas e funcionais dos genes da rede mostraram genes relacionados a sinapse, adesão celular, vias glutamatérgicas e serotonérgicas, o que confirma achados de trabalhos independentes na literatura indicando ainda novos genes e variantes genéticas nessas vias. / Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD) is the most common neuro-developmental disorder in children, affecting 5.8% of children and adolescents in the world. Many studies have attempted to investigate the genetic susceptibility of ADHD without much success. The present study aimed to analyze rare and common variants contributing to the genetic architecture of ADHD. We generated exome data from 30 Brazilian trios where the children were diagnosed with sporadic ADHD. We analyzed both single-nucleotide variants (SNVs) and copy-number variants (CNVs) in these trios and across multiple datasets, including a Brazilian sample of 503 children/adolescent controls from the High Risk Cohort Study for the Development of Childhood Psychiatric Disorders, and also previously published results of four CNV studies of ADHD involving children/adolescent Caucasian samples. The results from the Brazilian trios showed 3 major patterns: cases with inherited variations and de novo SNVs or de novo CNVs and cases with only inherited variations. Although the sample size is small, we could see that various comorbidities are more frequent in cases with only inherited variants. After exploring the rare variant composition in our 30 cases we selected genes with variations (SNVs or located in CNV regions) in our trio analysis that are recurrent in the families analyzed or in public data sets. Moreover, using only genes expressed in brain (post-mortem samples from Brain Atlas and The Genotype-Tissue Expression project), we constructed an in silico protein-protein interaction (PPI) network, with physical interactions confirmed by at least two sources. Topological and functional analyses of genes in this network uncovered genes related to synapse, cell adhesion, glutamatergic and serotoninergic pathways, both confirming findings of previous studies and capturing new genes and genetic variants in these pathways.

Doenças complexas são caracterizadas por serem poligênicas e multifatoriais, o que representa um desafio em relação à busca de genes relacionados a elas. Com o advento das tecnologias de sequenciamento em larga escala do genoma e das medições de expressão gênica (transcritoma), bem como o conhecimento de interações proteína-proteína, doenças complexas têm sido sistematicamente investigadas. Particularmente, baseando-se no paradigma Network Medicine, as redes de interação proteína-proteína (PPI -- Protein-Protein Interaction) têm sido utilizadas para priorizar genes relacionados às doenças complexas segundo suas características topológicas. Entretanto, as redes PPI são afetadas pelo viés da literatura, em que as proteínas mais estudadas tendem a ter mais conexões, degradando a qualidade dos resultados. Adicionalmente, métodos que utilizam somente redes PPI fornecem apenas resultados estáticos e não-específicos, uma vez que as topologias destas redes não são específicas de uma determinada doença. Neste trabalho, desenvolvemos uma metodologia para priorizar genes e vias biológicas relacionados à uma dada doença complexa, através de uma abordagem integrativa de dados de redes PPI, transcritômica e genômica, visando aumentar a replicabilidade dos diferentes estudos e a descoberta de novos genes associados à doença. Após a integração das redes PPI com dados de expressão gênica, aplicamos as hipóteses da Network Medicine à rede resultante para conectar genes sementes (relacionados à doença, definidos a partir de estudos de associação) através de caminhos mínimos que possuam maior co-expressão entre seus genes. Dados de expressão em duas condições (controle e doença) são usados separadamente para obter duas redes, em que cada nó (gene) dessas redes é pontuado segundo fatores topológicos e de co-expressão. Baseado nesta pontuação, desenvolvemos dois escores de ranqueamento: um que prioriza genes com maior alteração entre suas pontuações em cada condição, e outro que privilegia genes com a maior soma destas pontuações. A aplicação do método a três estudos envolvendo dados de expressão de esquizofrenia recuperou com sucesso genes diferencialmente co-expressos em duas condições, e ao mesmo tempo evitou o viés da literatura. Além disso, houve uma melhoria substancial na replicação dos resultados pelo método aplicado aos três estudos, que por métodos convencionais não alcançavam replicabilidade satisfatória. / Complex diseases are characterized as being poligenic and multifactorial, so this poses a challenge regarding the search for genes related to them. With the advent of high-throughput technologies for genome sequencing and gene expression measurements (transcriptome), as well as the knowledge of protein-protein interactions, complex diseases have been sistematically investigated. Particularly, Protein-Protein Interaction (PPI) networks have been used to prioritize genes related to complex diseases according to its topological features. However, PPI networks are affected by ascertainment bias, in which the most studied proteins tend to have more connections, degrading the quality of the results. Additionally, methods using only PPI networks can provide just static and non-specific results, since the topologies of these networks are not specific of a given disease. In this work, we developed a methodology to prioritize genes and biological pathways related to a given complex disease, through an approach that integrates data from PPI networks, transcriptomics and genomics, aiming to increase replicability of different studies and to discover new genes associated to the disease. The methodology integrates PPI network and gene expression data, and then applies the Network Medicine Hypotheses to the resulting network in order to connect seed genes (obtained from association studies) through shortest paths possessing larger coexpression among their genes. Gene expression data in two conditions (control and disease) are used to obtain two networks, where each node (gene) in these networks is rated according to topological and coexpression aspects. Based on this rating, we developed two ranking scores: one that prioritizes genes with the largest alteration between their ratings in each condition, and another that favors genes with the greatest sum of these scores. The application of this method to three studies involving schizophrenia expression data successfully recovered differentially co-expressed gene in two conditions, while avoiding the ascertainment bias. Furthermore, when applied to the three studies, the method achieved a substantial improvement in replication of results, while other conventional methods did not reach a satisfactory replicability.

O Vírus Respiratório Sincicial Humano, do inglês human Respiratory Syncytial Virus (hRSV), é uma das maiores causas de doenças respiratórias agudas, principalmente em crianças e bebês entre seis meses e dois anos de idade. Não há drogas eficazes ou vacina aprovada até o momento para esse vírus, apesar das décadas de intensa pesquisa e grande quantidade de dados sobre ele acumulados. O genoma do hRSV codifica onze proteínas e a compreensão das interações entre essas proteínas virais e as proteínas do hospedeiro é essencial para que possíveis alvos terapêuticos contra o hRSV sejam identificados. No laboratório, anteriormente, foi dado enfoque às interações entre as proteínas celulares e as proteínas virais de matriz (M), nucleoproteína (N) e fosfoproteína (P). Neste trabalho, analisamos as interações da proteína viral M2-1 (cofator essencial para a transcrição) através da mesma estratégia utilizada naqueles experimentos, de fusão a FLAG (gerando FLAG-M2-1) e imunoprecipitação com anticorpos contra esse peptídeo. As proteínas co-imunoprecipitadas, identificadas por espectrometria de massas, foram: poly(A)-binding protein cytoplasmic 1 (PABPC1), Y-box binding protein 3 (YBX3), e Nuclease-sensitive element-binding protein 1 (YBX1). M2-1 é capaz de integrar-se ao complexo chamado de semelhante a corpúsculos de inclusão (IB like, do inglês), formado por N e P, que é similar estruturalmente aos corpúsculos de inclusão encontrados em células infectadas (IBs). Essa propriedade foi usada para analisar que proteínas celulares seriam recrutadas para esse outro nível de organização dessas três proteínas virais, envolvidas na transcrição. O complexo FLAG-N/P/M2-1 co-imunoprecipitou as proteínas celulares: Hsp70, Hsp90 (Heat shock proteins 70 e 90), Npm (Nucleophosmin), que podemos agrupar como chaperonas; PABPC1, YBX1, YBX3, ligantes de RNA; e sub-unidade pICIn do metilossomo, associada a modificação pós-tradução. Detalhamos a análise para YBX3, obtendo evidências adicionais de sua interação com M2-1 em ensaios de complementação de proteína fragmentada (Split-NanoLuc), e de co-localização por imunofluorescência indireta. Finalmente, utilizamos a metodologia de expressão em bactérias para demonstrar a interação entre M2-1 e os domínios funcionais de PABPC1, porém esses ensaios não foram conclusivos. / Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is one of the leading causes of acute respiratory diseases, especially in children and infants between six months and two years of age. There is no effective drug or vaccine approved so far for this virus, despite decades of intensive research and large amount of data on it. The genome of hRSV encodes 11 proteins and the understanding of the interactions between these viral proteins and host proteins is essential to identify possible therapeutic targets against hRSV. In the lab, previously, was given focus to the interactions between cellular proteins and viral proteins matrix (M), nucleoprotein (N) and phosphoprotein (P). In this paper, we analyze the viral M2-1 (cofactor essential for transcription) protein interactions through the same strategy used in those experiments: fusion with FLAG (generating FLAG-M2-1) and immunoprecipitation with antibodies against this peptide. The co-immunoprecipitated proteins, identified by mass spectrometry, were: Poly (A)-binding protein cytoplasmic 1 (PABPC1), Y-box binding protein 3 (YBX3), and Nuclease-sensitive element-binding protein 1 (YBX1). M2-1 is able to integrate the complex called similar to inclusion bodies (IB like), formed by N and P, which is similar structurally to the inclusion bodies found in infected cells (IBs). This property has been used to analyze which cellular proteins would be recruited for this new level of organization of these three viral proteins involved in transcription. The cellular proteins co-immunoprecipitated with the complex FLAG-N/P/M2-1, were: Hsp70, Hsp90 (Heat shock proteins 70 and 90), Npm (Nucleophosmin), that we can group as chaperones; PABPC1, YBX1, YBX3, RNA ligands; and the methylosome sub-unit pICIn, post-translational modification-associated. We detailed the analysis for YBX3, obtaining additional evidence of its interaction with M2-1 in fragmented protein complementation tests (Split-NanoLuc), and co-localization by indirect immunofluorescence. Finally, we used the methodology of expression in bacteria to demonstrate the interaction between M2-1 and functional domains of PABPC1, but these tests were not conclusive.

A proteína Cdc42 (Cell Division Cycle 42) é um membro da família das Rho GTPases, sinalizadores intracelulares conhecidos pelo seu papel na regulação do citoesqueleto. Essa proteína e capaz de ciclar entre um estado ativo (ligado à GTP) e um estado inativo (ligado à GDP) e essa ativação é modulada por diversas proteínas, conhecidas como GEFs (guanine nucleotide-exchange factors), GAPs (GTPase-activating proteins) e GDIs (guanine nucleotide-dissociation inhibitors). Trabalhos recentes têm demonstrado um papel de Cdc42 na apoptose e na senescência, respostas relacionadas e comumente desencadeadas por estresse genotóxico. Neste contexto este trabalho procurou identificar interações de Cdc42 com outras proteínas, que podem ou não estar envolvidas nos mecanismos de resposta ao dano do DNA. Para isso foram utilizadas as linhagens celulares HeLa e MRC-5 submetidas a tratamento com radiação ultravioleta tipo C, a fim de provocar danos no DNA. Foram realizados dois diferentes tratamentos em cada uma das linhagens com diferentes tempos de incubação pós radiação UV, visando a busca de proteínas envolvidas em uma resposta rápida ou tardia ao dano causado. Os lisados celulares desses tratamentos foram submetidos ao pull-down com proteínas recombinantes GST, GST-Cdc42WT (Selvagem) e GST-Cdc42V12 (Mutação constitutivamente ativa). As proteínas purificadas foram digeridas e submetidas à análise por espectrometria de massa e os dados obtidos foram utilizados para a construção de redes de interação proteica. Dentre as proteínas identificadas as que despertaram maior atenção foram: Proibitina-2 (PHB2) encontrada nas amostras incubadas por 48 horas pós irradiação e Cullina-4A (CUL4A) e P53, encontradas em amostra incubada por 5 minutos pós radiação. Essas proteínas possuem papéis em apoptose e reparo de DNA e foram observadas em posições muito próximas de Cdc42 nas redes de interação, fazendo delas interessantes alvos para futuras validações de interação proteica por análises experimentais distintas / The Cdc42 protein (Cell Division Cycle 42) is a member of the Rho family of GTPases, intracellular signalling molecules well known for their role in the cytoskeleton regulation. This protein cycles between an active state (GTP-bound) and an inactive state (GDP-bound) and this regulation is modulated by proteins known as GEFs, GAPs and GDIs. Recent studies demonstrated roles for Cdc42 in apoptosis and senescence, cellular responses commonly triggered by genotoxic stress. This work sought to identify Cdc42 interactions with other proteins that possibly involved in response to DNA damage mechanisms. To reach this aims we used HeLa and MRC-5 cell lines submitted to treatments with ultraviolet C radiation to induce DNA damage. Two experimental conditions were used in each cell line with different times and doses post UV irradiation in order to search for proteins involved in either rapid or delayed response to the installed DNA damage. Cell lysates obtained from these treatments were subjected to pull-down experiments using recombinant proteins GST, GST-Cdc42-WT (Wild type) and GST-Cdc42-V12 (constitutively active mutant). Purified proteins were digested by trypsin, analyzed by mass spectrometry and th obtained data were used for the construction of protein-protein interaction (PPI) networks. Among the identified proteins those that seem more relevant to the aims of this project were: Prohibitin-2 (PHB2), found in samples incubated 48 hours post irradiation; Cullin-4A (CUL4A) and P53, found in samples incubated 5 minutes after radiation. These proteins have roles in apoptosis and DNA repair and were observed in close proximity to Cdc42 in PPI networks, making them interesting targets for future validation by different experimental approaches

Made available in DSpace on 2015-03-05T13:56:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 6 / Hewlett-Packard Brasil Ltda / Um dos mais importantes desafios para a biologia pós-genômica é atender a estrutura e o comportamento das interações moleculares complexas que controlam o comportamento celular. Para tanto é essencial à integração dos dados biológicos referentes a estas interações armazenadas em diversos banco de dados. Este é um problema difícil, pois estes dados estão disponíveis em banco de dados públicos espalhados geograficamente na rede mundial de computadores e cada um destes possui um sistema diferente de gerenciamento, formato ou visão de como representar os dados. Os principais problemas para a realização desta tarefa são:a necessidade de se desenvolver e aplicar parsers para cada banco de dados sem ausência de um vocabulário unificado. Como uma alternativa para facilitar estes problemas, este trabalho propõe a ontologia MONET (Molecular Network Ontology) que tem como objetivo ser um modelo integrado para a rede de redes que existe dentro da celula. Tal visão integrada ajuda a entender as interações de larga escala / One of the most important challenges for biology in the post-genomic is to understand the structure and behavior of the molecular interactions that controls cell behavior. Therefore is essential to integrate biological data concerning these interactions, which are stored in different databases. The integration task is dificult because these data are distributed in public databases on the world wide web and each database has diferent management systems, formats and views of how to represent biological data. The two main problems involved here are the dificulty in parsing the data when dealing with heterogeneous at file formats and the inconsistencies due to the absence of an united vocabulary. As an alternative to facilitate these problems this work proposes MONET (the Molecular Network) ontology, an integration model for the unifying of diferent molecular networks that exist inside the cell. Such integrated view facilitates the understanding of the large-scale interactions responsible for the behavior of

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arielifernandagavioligomes_dissert.pdf: 1557143 bytes, checksum: 898e0714fcf73f6bc8ba53f5719efc71 (MD5) Previous issue date: 2011-12-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Introduction: The Yellow Fever is characterized by severe hepatitis, renal failure, hemorrhage, and rapid terminal events that lead to shock and death. This disease is caused by the infection with the Yellow Fever Virus (YFV), considered the prototype of the Flavivirus genus. Its mechanism of replication is not well known but includes interactions of viral RNA with cellular and viral proteins. The nonstructural protein 5 (NS5) is the largest and most conserved protein of the Flavivirus genus; it encodes RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) domains, besides possessing many important functions during viral replication, such as genic regulation of host cells. The protein hSlu7 is a homologous human protein, which was isolated interacting with the U5 that is involved in the second the step of alternative splicing. The hSlu7 is a predominantly nuclear protein and participates at the alternative splicing, influencing the correct choice of the alternative AGs of exon 3' so that the spliceossome is able to bind and start alternative splicing. Objective: To characterize the interaction of the hSlu7 protein with the YFV-NS5 protein and its cellular localization during viral infection. Material and Method: We confirmed the interaction of various NS5 with human proteins by two-hybrid assays. Deletion mutants were constructed and co-transformed with hSlu7 in yeast to determine the minimal domain of NS5 required for interaction. The cellular localization of the hSlu7 fused with GFP during the response of vaccine strain 17D of YFV in cells Vero E6, marked with anti-NS4AB and anti-NS5 for detection of the infection was also tested. Results: hSlu7 interacts with initial and final portions of the RdRp and the cytoplasmic sublocalization of hSlu7 occurs in the cells infected with YFV. Conclusions: Our results suggest that hSlu7 interacts with the YFV by two-hybrid system and the cellular sublocalization occurs due to the presence of viral infection. Further studies using RNA interference should be addressed to confirm the cellular function of hSlu7 , and to evaluate which alterations that infected and uninfected cells will suffer with low levels of hSlu7. / Introdução: A Febre Amarela é uma doença decorrente da infecção pelo Vírus da Febre Amarela (YFV) que é um protótipo do gênero Flavivirus que provoca uma severa hepatite, falência renal, hemorragia, e eventos que rapidamente levam ao choque e morte do indivíduo. Os mecanismos de replicação genômico do YFV não são bem conhecidos. A proteína não estrutural 5 (NS5) é a maior proteína e a mais conservada dos Flavivirus, ela codifica a RNA polimerase dependente de RNA (RdRp). A hSlu7 é uma proteína celular, predominantemente nuclear, e foi isolada interagindo com a U5 no segundo passo do splicing alternativo. A hSlu7 auxilia na correta seleção dos AGs alternativos do exon 3 para a realização da reação de splicing. Objetivo: Caracterizar a interação de hSlu7 com a proteína NS5 de YFV, quanto a sua localização celular durante a infecção. Material e Método: Pelo sistema duplo-híbrido em leveduras utilizando plasmid-linkage avaliamos a interação de hSlu7 com deleções mutantes da RdRp de YFV, e a localização celular de GFP-hSlu7 durante a replicação da cepa vacinal 17D de YFV em cultura de células Vero E6, marcadas com anticorpos NS4AB e NS5 para detecção da infecção. Resultados: A hSlu7 interage com as porções inicial e final da RdRp, e a sublocalização citoplasmática de hSlu7, ocorre nas células infectadas com YFV. Conclusão: Nossos resultados sugerem que a hSlu7 possui uma sublocalização celular durante a replicação do YFV, além de interagir com a RdRp viral. Ainda será necessária a confirmação da função celular de hSlu7 utilizando RNA de interferência para avaliar quais as alterações que a célula não infectada e infectada sofrerá diante dos níveis baixos de hSlu7.

A proteína fosfatase do tipo-1 (PP1) é uma das principais proteínas serina/treonina fosfatases (PSTPs) e desempenha papeis fisiológicos tão diversos quanto importantes, tais como a regulação do metabolismo de carboidratos e do ciclo celular. A holoenzima PP1 é constituída por uma subunidade catalítica conservada (PP1c) que está associada a subunidades não-catalíticas que modulam sua localização subcelular, especificidade de substrato e atividade enzimática. Mais de 100 proteínas que interagem com a PP1c já foram identificadas em distintos organismos eucarióticos. Proteínas que interagem com a PP1c são, portanto, a chave para compreender os diferentes papéis biológicos da PP1. A subunidade catalítica da PP1 da ameba social Dictyostelium discoideum (DdPP1c) é codificada por um gene em cópia única o qual é expresso ao longo de todo o ciclo de vida desse organismo. Algumas proteínas que interagem e possivelmente modulam a atividade da PP1 de D. discoideum já foram identificadas, utilizando-se tanto buscas por similaridades na sequência genômica deste microorganismo como ensaios utilizando o sistema de duplo-híbrido em leveduras, utilizando-se a PP1c como isca. Com esta última abordagem, foram selecionados mais de 25 clones distintos de cDNA que codificam proteínas que potencialmente interagem com a DdPP1c, após varreduras de bibliotecas de cDNA de diferentes estágios de desenvolvimento de D. discoideum. Neste trabalho, nós confirmamos que o produto protéico de 11 destes clones interagem com a isca DdPP1c com base em novos ensaios de duplo-híbrido. Os demais clones codificam proteínas que não interagem com DdPP1c ou promovem auto-ativação do gene repórter. Selecionamos para estudos adicionais um clone do gene DDB_G0269300 cujo produto protéico predito de 423 de aminoácidos não tem função ainda conhecida. A sequência codificadora completa de DDB_G0269300 foi clonada para realização de novos ensaios de duplo-híbrido em leveduras, os quais confirmaram a especificidade de sua interação com DdPP1c. A proteína recombinante rDDB_G0269300 foi obtida com sucesso em bactérias, possibilitando a obtenção de anticorpos policlonais em camundongos. O anti-soro anti-rDDB_G0269300 é aparentemente específico no reconhecimento da proteína correspondente em extratos celulares de D. discoideum coletados em 12h e 16 da fase de desenvolvimento. Estes resultados coincidem com dados obtidos através de RT-qPCR que mostram aumento nos níveis dos transcritos de DDB_G0269300 entre 8h e 12h da fase de desenvolvimento, o que é indicativo da sua importância desta proteína durante esta fase do ciclo de vida de Dictyostelium como uma potencial parceira molecular da DdPP1c / Protein phosphatase type-1 (PP1) is a major protein serine/threonine phosphatase (PSTP) which plays as diverse as important physiological roles, such as regulation of carbohydrate metabolism and of cell cycle. The PP1 holoenzyme comprises a conserved catalytic subunit (PP1c) associated with non-catalytic subunits that modulate its subcellular localization, substrate specificity and enzymatic activity. More than 100 proteins that interact with PP1c have been identified in different eukaryotic organisms. Therefore proteins that interact with PP1c are key to the understanding of PP1 different biological roles. The catalytic subunit of PP1 the social amoeba Dictyostelium discoideum (DdPP1c) is encoded by a single copy gene which is expressed throughout the life cycle of this organism. Some proteins that interact with and possibly modulate the activity of D. discoideum PP1 have been identified, using both similarity searches in the genome sequence of this microorganism as yeast two-hybrid screenings using PP1c as bait. With the latter approach, we have selected more than 25 distinct cDNA clones encoding proteins that potentially interact with DdPP1c after screening D. discoideum cDNA libraries from different developmental stages. In this study, we confirmed that the protein product from 11 of these clones interact with the bait DdPP1c based on two-hybrid assays. The other clones encode proteins that either does not interact or promote self-activation of the reporter gene. The clone related to DDB_G0269300 gene that encodes a predicted protein of 423 amino acids with unknown function was selected for further studies. DDB_G0269300 full-length coding sequence was cloned and new yeast two-hybrid assays were performed confirming the specificity of the interaction with DdPP1c. The recombinant protein rDDB_G0269300 was successfully obtained in bacteria and further used for polyclonal antibodies production in mice. The antiserum anti-rDDB_G0269300 is apparently specific for recognition of the corresponding protein in D. discoideum cell extracts collected after 12h and 16h of development. These results agree with RT-qPCR data showing that the levels of DDB_G0269300 transcripts are increased between 8 h and 12 h during the development, which is indicative of its importance during this phase in Dictyostelium life cycle as a DdPP1c potential molecular partner.

Orientador: Marcos Roberto de mattos Fontes / Resumo: Ainda nos dias de hoje, o envenenamento ofídico é um problema de saúde pública, afetando, sobretudo, regiões de clima tropical, subtropical, particularmente áreas rurais de países da África, Ásia, Oceania e América Latina. No Brasil, os gêneros de serpentes Bothrops e Crotalus são responsáveis por quase 95% dos acidentes ofídicos, enquanto o segundo gênero apresenta alta taxa de morbidade. O veneno das serpentes do gênero Bothrops contem fosfolipases A2 ácidas que causam uma considerada mionecrose e severas reações anticoagulantes. De outro lado, os venenos das serpentes do gênero Crotalus possuem o complexo crotoxina, o qual é formado pela crotoxina A (não catalítica) e a crotoxina B (PLA2 catalítica) que possui potente ação neurotóxica. As serpentes peçonhentas, grupo que inclui ambas as famílias citadas, utilizam esse veneno tanto para a captura de sua presa como para sua própria defesa. Inevitavelmente, essas serpentes terão contato com o seu próprio veneno, como por exemplo, na alimentação, pois as presas estarão envenenadas. Por tal fato, as serpentes peçonhentas apresentam alguns mecanismos de defesa, inclusive algumas proteínas encontradas em seu sangue que são chamadas de proteínas inibitórias de PLA2 (PLIs). Para entender melhor o mecanismo de inibição desses compostos plasmáticos, foi desenvolvido neste trabalho um novo protocolo de docking molecular que consiste em analisar as estruturas ao longo dos modos normais, docking molecular, simulação de dinâmica molecula... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays, snake envenomation is a public health issue that mostly affects tropical and subtropical regions, particularly rural areas of countries from Africa, Asia, Oceania and Latin America. In Brazil, the Bothrops and Crotalus snake genre are responsible for approximately 95% of all snake bites, and the accidents caused by the latter have a relatively high mortality rate. The venom of Bothrops snakes contains a acid phospholipases A2 that causes drastic local myonecrosis and several anticoagulant reactions. On the other hand, the Crotalus genus snake venom contains the the crotoxin complex, which is formed by crotoxin A (non-catalytic) and crotoxin B (catalytic PLA2), that have up a strong neurotoxic action. Venomous snakes, including the two afore mentioned genre, use their venoms for capturing their prey and for their own defense. These snakes will inevitably get in contact with their own venom, for example, in alimentation, for the prey itself will be poisoned. For this fact, the poison snakes features in your blood the so-called PLA2 inhibiting proteins (PLIs). In order to understand the inhibition mechanism of these plasmatic components, it has developed in this study a new molecular docking protocol that consists in analyzing the structures using normal modes, molecular docking, molecular dynamics simulation and other bioinformatics tools. The results of this work was the proposition of a new flexible molecular docking protocol between two or more proteins and your... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A proteína Cdc42 (Cell Division Cycle 42) é um membro da família das Rho GTPases, sinalizadores intracelulares conhecidos pelo seu papel na regulação do citoesqueleto. Essa proteína e capaz de ciclar entre um estado ativo (ligado à GTP) e um estado inativo (ligado à GDP) e essa ativação é modulada por diversas proteínas, conhecidas como GEFs (guanine nucleotide-exchange factors), GAPs (GTPase-activating proteins) e GDIs (guanine nucleotide-dissociation inhibitors). Trabalhos recentes têm demonstrado um papel de Cdc42 na apoptose e na senescência, respostas relacionadas e comumente desencadeadas por estresse genotóxico. Neste contexto este trabalho procurou identificar interações de Cdc42 com outras proteínas, que podem ou não estar envolvidas nos mecanismos de resposta ao dano do DNA. Para isso foram utilizadas as linhagens celulares HeLa e MRC-5 submetidas a tratamento com radiação ultravioleta tipo C, a fim de provocar danos no DNA. Foram realizados dois diferentes tratamentos em cada uma das linhagens com diferentes tempos de incubação pós radiação UV, visando a busca de proteínas envolvidas em uma resposta rápida ou tardia ao dano causado. Os lisados celulares desses tratamentos foram submetidos ao pull-down com proteínas recombinantes GST, GST-Cdc42WT (Selvagem) e GST-Cdc42V12 (Mutação constitutivamente ativa). As proteínas purificadas foram digeridas e submetidas à análise por espectrometria de massa e os dados obtidos foram utilizados para a construção de redes de interação proteica. Dentre as proteínas identificadas as que despertaram maior atenção foram: Proibitina-2 (PHB2) encontrada nas amostras incubadas por 48 horas pós irradiação e Cullina-4A (CUL4A) e P53, encontradas em amostra incubada por 5 minutos pós radiação. Essas proteínas possuem papéis em apoptose e reparo de DNA e foram observadas em posições muito próximas de Cdc42 nas redes de interação, fazendo delas interessantes alvos para futuras validações de interação proteica por análises experimentais distintas / The Cdc42 protein (Cell Division Cycle 42) is a member of the Rho family of GTPases, intracellular signalling molecules well known for their role in the cytoskeleton regulation. This protein cycles between an active state (GTP-bound) and an inactive state (GDP-bound) and this regulation is modulated by proteins known as GEFs, GAPs and GDIs. Recent studies demonstrated roles for Cdc42 in apoptosis and senescence, cellular responses commonly triggered by genotoxic stress. This work sought to identify Cdc42 interactions with other proteins that possibly involved in response to DNA damage mechanisms. To reach this aims we used HeLa and MRC-5 cell lines submitted to treatments with ultraviolet C radiation to induce DNA damage. Two experimental conditions were used in each cell line with different times and doses post UV irradiation in order to search for proteins involved in either rapid or delayed response to the installed DNA damage. Cell lysates obtained from these treatments were subjected to pull-down experiments using recombinant proteins GST, GST-Cdc42-WT (Wild type) and GST-Cdc42-V12 (constitutively active mutant). Purified proteins were digested by trypsin, analyzed by mass spectrometry and th obtained data were used for the construction of protein-protein interaction (PPI) networks. Among the identified proteins those that seem more relevant to the aims of this project were: Prohibitin-2 (PHB2), found in samples incubated 48 hours post irradiation; Cullin-4A (CUL4A) and P53, found in samples incubated 5 minutes after radiation. These proteins have roles in apoptosis and DNA repair and were observed in close proximity to Cdc42 in PPI networks, making them interesting targets for future validation by different experimental approaches

A proteína fosfatase do tipo-1 (PP1) é uma das principais proteínas serina/treonina fosfatases (PSTPs) e desempenha papeis fisiológicos tão diversos quanto importantes, tais como a regulação do metabolismo de carboidratos e do ciclo celular. A holoenzima PP1 é constituída por uma subunidade catalítica conservada (PP1c) que está associada a subunidades não-catalíticas que modulam sua localização subcelular, especificidade de substrato e atividade enzimática. Mais de 100 proteínas que interagem com a PP1c já foram identificadas em distintos organismos eucarióticos. Proteínas que interagem com a PP1c são, portanto, a chave para compreender os diferentes papéis biológicos da PP1. A subunidade catalítica da PP1 da ameba social Dictyostelium discoideum (DdPP1c) é codificada por um gene em cópia única o qual é expresso ao longo de todo o ciclo de vida desse organismo. Algumas proteínas que interagem e possivelmente modulam a atividade da PP1 de D. discoideum já foram identificadas, utilizando-se tanto buscas por similaridades na sequência genômica deste microorganismo como ensaios utilizando o sistema de duplo-híbrido em leveduras, utilizando-se a PP1c como isca. Com esta última abordagem, foram selecionados mais de 25 clones distintos de cDNA que codificam proteínas que potencialmente interagem com a DdPP1c, após varreduras de bibliotecas de cDNA de diferentes estágios de desenvolvimento de D. discoideum. Neste trabalho, nós confirmamos que o produto protéico de 11 destes clones interagem com a isca DdPP1c com base em novos ensaios de duplo-híbrido. Os demais clones codificam proteínas que não interagem com DdPP1c ou promovem auto-ativação do gene repórter. Selecionamos para estudos adicionais um clone do gene DDB_G0269300 cujo produto protéico predito de 423 de aminoácidos não tem função ainda conhecida. A sequência codificadora completa de DDB_G0269300 foi clonada para realização de novos ensaios de duplo-híbrido em leveduras, os quais confirmaram a especificidade de sua interação com DdPP1c. A proteína recombinante rDDB_G0269300 foi obtida com sucesso em bactérias, possibilitando a obtenção de anticorpos policlonais em camundongos. O anti-soro anti-rDDB_G0269300 é aparentemente específico no reconhecimento da proteína correspondente em extratos celulares de D. discoideum coletados em 12h e 16 da fase de desenvolvimento. Estes resultados coincidem com dados obtidos através de RT-qPCR que mostram aumento nos níveis dos transcritos de DDB_G0269300 entre 8h e 12h da fase de desenvolvimento, o que é indicativo da sua importância desta proteína durante esta fase do ciclo de vida de Dictyostelium como uma potencial parceira molecular da DdPP1c / Protein phosphatase type-1 (PP1) is a major protein serine/threonine phosphatase (PSTP) which plays as diverse as important physiological roles, such as regulation of carbohydrate metabolism and of cell cycle. The PP1 holoenzyme comprises a conserved catalytic subunit (PP1c) associated with non-catalytic subunits that modulate its subcellular localization, substrate specificity and enzymatic activity. More than 100 proteins that interact with PP1c have been identified in different eukaryotic organisms. Therefore proteins that interact with PP1c are key to the understanding of PP1 different biological roles. The catalytic subunit of PP1 the social amoeba Dictyostelium discoideum (DdPP1c) is encoded by a single copy gene which is expressed throughout the life cycle of this organism. Some proteins that interact with and possibly modulate the activity of D. discoideum PP1 have been identified, using both similarity searches in the genome sequence of this microorganism as yeast two-hybrid screenings using PP1c as bait. With the latter approach, we have selected more than 25 distinct cDNA clones encoding proteins that potentially interact with DdPP1c after screening D. discoideum cDNA libraries from different developmental stages. In this study, we confirmed that the protein product from 11 of these clones interact with the bait DdPP1c based on two-hybrid assays. The other clones encode proteins that either does not interact or promote self-activation of the reporter gene. The clone related to DDB_G0269300 gene that encodes a predicted protein of 423 amino acids with unknown function was selected for further studies. DDB_G0269300 full-length coding sequence was cloned and new yeast two-hybrid assays were performed confirming the specificity of the interaction with DdPP1c. The recombinant protein rDDB_G0269300 was successfully obtained in bacteria and further used for polyclonal antibodies production in mice. The antiserum anti-rDDB_G0269300 is apparently specific for recognition of the corresponding protein in D. discoideum cell extracts collected after 12h and 16h of development. These results agree with RT-qPCR data showing that the levels of DDB_G0269300 transcripts are increased between 8 h and 12 h during the development, which is indicative of its importance during this phase in Dictyostelium life cycle as a DdPP1c potential molecular partner.