Ácaros Brevipalpus yothersi Baker (1949) são vetores do citrus leprosis virus C (CiLV-C), o mais comum causador da leprose dos citros. Esta é considerada, atualmente, a doença viral de maior importância na cultura dos citros no Brasil e ocorre também em países da América do Sul e Central, além do México, na América do Norte. A doença prejudica a vida útil da planta, devido à queda de folhas e frutos, e seca de ramos, podendo levá-la à morte quando o ataque é demasiadamente severo. O controle e manejo da leprose são basicamente atribuídos ao uso de acaricidas, demandando dos produtores um acréscimo significativo no orçamento por defensivos agrícolas e potencial risco ao ambiente. Nos últimos anos, análises de expressão gênica (transcriptoma), envolvendo ácaros praga da agricultura, resultaram em informações importantes como o envolvimento de genes específicos no processo de resistência a acaricidas e desenvolvimento biológico. No entanto, ainda pouco se sabe sobre a interação do ácaro B. yothersi com o CiLV-C, tornando o estudo de transcriptoma muito significativo para a obtenção de informações aprofundadas sobre o atípico padrão vírus-vetor do patossistema leprose. Assim, através do sequenciamento de RNA (RNAseq), foi investigado o perfil de expressão diferencial entre ácaros B. yothersi virulíferos e avirulíferos. O RNAseq foi realizado em sistema Illumina HiSeq 2500, e os dados analisados com base em linguagem R e ferramentas do software Bioconductor. Os reads sequenciados foram mapeados no genoma de B. yothersi e foi feita análise de expressão utilizando DESeq2. Foram observados 5.690 genes diferencialmente expressos (GDE), sendo 2.736 transcritos induzidos em ácaros virulíferos. Os GDE foram analisados em banco de dados do NCBI, buscando por proteínas similares em artrópodes. Dentre os transcritos induzidos em B. yothersi, potencialmente em resposta ao CiLV-C, foram encontrados genes relacionados ao processo de detoxificação de xenobióticos, metabolismo primário e imunidade, com possível envolvimento na interação vírus-vetor. A expressão de 23 genes foi verificada por RT-PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). As análises indicaram que os genes envolvidos em detoxificação são induzidos durante a interação entre o ácaro da leprose e o CiLV-C. / The false spider mite Brevipalpus yothersi Baker (1949) is recognized as vector of citrus leprosis virus C (CiLV-C), the most common causal agent of citrus leprosis disease. Currently, it is considered the viral disease of major importance in citrus in Brazil and occurs in countries of South and Central America, as well as in Mexico, North America. It reduces the lifespam of the plants due to leaf and fruit drop, dried branches, and can lead to death when the attack is severe. The management of leprosis is based primarily on the chemical control of the mite vector, increasing significantly the cost of production and harming the environment. On the last years, gene expression (transcriptome) analyzes involving phytophagous mites resulted in important data, such as the involvement of specific genes in the process of resistance to acaricides and biological development. However, there is little information about B. yothersi-CiLV-C interaction, making the transcriptome a very interesting tool to obtaining data regarding the atypical virus-vector relationship of the leprosis pathosystem. RNA sequencing (RNAseq) was used to investigate the differential expression profiles between viruliferous and aviruliferous B. yothersi mites. The RNAseq was performed using the Illumina HiSeq 2500 system, the data were analyzed using the R language and Bioconductor software packages. The sequenced reads were mapped on the genome of B. yothersi and expression analysis was performed in DESeq2. We identified 5.690 differentially expressed genes (DEGs), of which 2.736 transcripts were induced in viruliferous mites. The DEGs were analyzed in NCBI database, searching for similar proteins in arthropods. Among the transcripts induced in response to CiLV-C, there are genes related to the detoxification of xenobiotics, primary metabolism, immunity and possible involvement in the virus-vector interaction. Expression of 23 genes was verified by quantitative real-time RT-PCR (RT-qPCR). The analyzes indicate that detoxification genes are induced during the interaction between the false spider mite and CiLV-C.

Ácaros Brevipalpus yothersi Baker (1949) são vetores do citrus leprosis virus C (CiLV-C), o mais comum causador da leprose dos citros. Esta é considerada, atualmente, a doença viral de maior importância na cultura dos citros no Brasil e ocorre também em países da América do Sul e Central, além do México, na América do Norte. A doença prejudica a vida útil da planta, devido à queda de folhas e frutos, e seca de ramos, podendo levá-la à morte quando o ataque é demasiadamente severo. O controle e manejo da leprose são basicamente atribuídos ao uso de acaricidas, demandando dos produtores um acréscimo significativo no orçamento por defensivos agrícolas e potencial risco ao ambiente. Nos últimos anos, análises de expressão gênica (transcriptoma), envolvendo ácaros praga da agricultura, resultaram em informações importantes como o envolvimento de genes específicos no processo de resistência a acaricidas e desenvolvimento biológico. No entanto, ainda pouco se sabe sobre a interação do ácaro B. yothersi com o CiLV-C, tornando o estudo de transcriptoma muito significativo para a obtenção de informações aprofundadas sobre o atípico padrão vírus-vetor do patossistema leprose. Assim, através do sequenciamento de RNA (RNAseq), foi investigado o perfil de expressão diferencial entre ácaros B. yothersi virulíferos e avirulíferos. O RNAseq foi realizado em sistema Illumina HiSeq 2500, e os dados analisados com base em linguagem R e ferramentas do software Bioconductor. Os reads sequenciados foram mapeados no genoma de B. yothersi e foi feita análise de expressão utilizando DESeq2. Foram observados 5.690 genes diferencialmente expressos (GDE), sendo 2.736 transcritos induzidos em ácaros virulíferos. Os GDE foram analisados em banco de dados do NCBI, buscando por proteínas similares em artrópodes. Dentre os transcritos induzidos em B. yothersi, potencialmente em resposta ao CiLV-C, foram encontrados genes relacionados ao processo de detoxificação de xenobióticos, metabolismo primário e imunidade, com possível envolvimento na interação vírus-vetor. A expressão de 23 genes foi verificada por RT-PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). As análises indicaram que os genes envolvidos em detoxificação são induzidos durante a interação entre o ácaro da leprose e o CiLV-C. / The false spider mite Brevipalpus yothersi Baker (1949) is recognized as vector of citrus leprosis virus C (CiLV-C), the most common causal agent of citrus leprosis disease. Currently, it is considered the viral disease of major importance in citrus in Brazil and occurs in countries of South and Central America, as well as in Mexico, North America. It reduces the lifespam of the plants due to leaf and fruit drop, dried branches, and can lead to death when the attack is severe. The management of leprosis is based primarily on the chemical control of the mite vector, increasing significantly the cost of production and harming the environment. On the last years, gene expression (transcriptome) analyzes involving phytophagous mites resulted in important data, such as the involvement of specific genes in the process of resistance to acaricides and biological development. However, there is little information about B. yothersi-CiLV-C interaction, making the transcriptome a very interesting tool to obtaining data regarding the atypical virus-vector relationship of the leprosis pathosystem. RNA sequencing (RNAseq) was used to investigate the differential expression profiles between viruliferous and aviruliferous B. yothersi mites. The RNAseq was performed using the Illumina HiSeq 2500 system, the data were analyzed using the R language and Bioconductor software packages. The sequenced reads were mapped on the genome of B. yothersi and expression analysis was performed in DESeq2. We identified 5.690 differentially expressed genes (DEGs), of which 2.736 transcripts were induced in viruliferous mites. The DEGs were analyzed in NCBI database, searching for similar proteins in arthropods. Among the transcripts induced in response to CiLV-C, there are genes related to the detoxification of xenobiotics, primary metabolism, immunity and possible involvement in the virus-vector interaction. Expression of 23 genes was verified by quantitative real-time RT-PCR (RT-qPCR). The analyzes indicate that detoxification genes are induced during the interaction between the false spider mite and CiLV-C.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-17T12:01:04Z No. of bitstreams: 1 Frank Magno da Costa.pdf: 2036897 bytes, checksum: 7498ff1cf68c11e56e2e3d7ce12c8e57 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-17T12:01:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Frank Magno da Costa.pdf: 2036897 bytes, checksum: 7498ff1cf68c11e56e2e3d7ce12c8e57 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Brevipalpus mites are vectors of several plant viruses called Brevipalpus transmitted virus –BrTV. Among these, Citrus leprosis virus C (CiLV-C) and Coffee ringspot virus (CoRSV) are important due to the damages caused in Citrus spp. and Coffea spp., respectively. The symptoms occur as localized infection on both leaves and fruits. The interactions between vector and virus are of particular interest both from the scientific perspective and on the development of control measures. However, for these and other BrTV, the mode interactions are still unknown. Preliminary study suggests that CoRSV replicates in the vector tissue, while CiLV-C is mode circulates manner. The aim of this study was to investigate the interactions established between CiLV-C and CoRSV with B. phoenicis. Adult females aviruliferous of B. phoenicis were submitted to acquisition access period of respective virus during five days. After this time they were transferred to hosts (treatments): mungbean (Canavalia ensiformis, non-host of the virus), symptomatic and healthy (citrus and coffee plants) and collected after four different periods of time: 0; 7; 14 and 21 days. The interactions were investigated by real time quantitative polymerase chain reaction (qPCR), transmission electron microscopy (TEM) and transmission assays. The qPCR revealed that there was no increase in viral load over time in all treatments for any of the virus in question. The TEM, it was not possible to detect particles of CiLV-C or CoRSV. CiLV-C transmission rate was 83, 75% and 58% for the treatments symptomatic citrus, mungbean and healthy citrus, respectively. The first symptoms of the leprosis were observed after 30±5 days after mites infestation. In the CoRSV transmission assays no symptoms of coffee ringspot were observed during a period of six months. These results suggest that a long incubation period was be necessary before CoRSV transmission by the vector. By the CiLV-C the results indicate that interaction type virus-vector is of the circulative mode. / Ácaros Brevipalpus são vetores de inúmeros vírus, comumente chamados de vírus transmitidos por Brevipalpus- VTB. Dentre esses, o vírus da leprose dos citros (Citrus leprosis virus C, CiLV-C) e o vírus da mancha anular do cafeeiro (Coffee ringspot virus - CoRSV) são importantes devido aos danos que causam em Citrus spp. e Coffea spp., respectivamente. Os sintomas ocorrem de maneira localizada em folhas e frutos. As interações entre os vírus e seus vetores apresentam particular interesse, tanto do ponto de vista científico quanto no desenvolvimento de novas abordagens para o controle das doenças por eles causadas. Entretanto, para esses e outros VTB, as interações são ainda pouco conhecidas. Estudos preliminares sugerem que o CoRSV se replica no interior do ácaro vetor, enquanto o CiLV-C apenas circula. O objetivo deste trabalho foi investigar os tipos de interações estabelecidas entre o CiLV-C e o CoRSV com B. phoenicis. Fêmeas adultas de B. phoenicis avirulíferas foram submetidas a um período de acesso para aquisição dos respectivos vírus durante cinco dias. Após esse tempo foram transferidas para hospedeiros (tratamentos): feijão-de-porco (não hospedeira dos vírus), plantas suscetíveis, sintomáticas e/ou sadias (laranja doce e cafeeiro) e coletadas após quatro diferentes períodos de tempo: 0; 7; 14 e 21 dias. As interações foram investigadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e testes de transmissão. A qPCR revelou que não houve aumento da carga viral ao longo do tempo em nenhum dos tratamentos avaliados para nenhum dos vírus em questão. A MET não detectou partículas de CiLV-C e CoRSV. A taxa de transmissão do CiLV-C foi de 83; 75 e 58% para os tratamentos frutos de laranja sintomáticos, feijão-de-porco e frutos de laranja sadio, respectivamente. Os primeiros sintomas de leprose dos citros foram observados após 30±5 dias após a infestação dos ácaros. Nos testes de transmissão de CoRSV nenhum sintoma da mancha anular foi observado durante um período de seis meses. Estes resultados indicam a necessidade de longo período é necessário antes da transmissão do CoRSV pelo vetor. Para o CiLV-C os resultados indicam que o tipo de interação vírus-vetor é persistente circulativa.

SANTOS, C. D. G. Caracterização molecular e biológica de um begomovírus isolado de tomateiro, Lycopersicon esculentum Mill., no estado de Goiás e sua interação com o vetor Bemisia argentifolii Bellows & Perring. 2001. 174 f. Tese (Doutorado em Agronomia/Fitotecnia) - Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2001. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-06-30T19:54:23Z No. of bitstreams: 1 2001_tese_cdgsantos.pdf: 2566273 bytes, checksum: 11a904889bfaa1c1d29f07be24985442 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-07-02T17:55:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2001_tese_cdgsantos.pdf: 2566273 bytes, checksum: 11a904889bfaa1c1d29f07be24985442 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-02T17:55:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2001_tese_cdgsantos.pdf: 2566273 bytes, checksum: 11a904889bfaa1c1d29f07be24985442 (MD5) Previous issue date: 2001 / The whitefly-transmitted viruses from the family Geminiviridae, genus Begomovirus, have been reported as an economically important pathogen group that affect important crops in tropical and subtropical countries. Since the beginning of the 1980 decade, the occurrence of the whitefly associated to Begomovirus infection has drastically increased worldwide. In Brazil, these pathogens have been responsable for severe economical losses in tomato (Lycopersicon esculentum) orchards and the production has hampered since 1994. In this work, infected tomato plants showing symptoms, such as mosaic, intervein clearing, leaf curling and growth reduction were collected in tomato orchards in Anápolis, State of Goiás. The virus was identified as a member of the genus Begomovirus by PCR reaction, using specific primers to amplify fragments of A and B components of the virus DNA genome. The Chapter I of this thesis presents the results of the molecular characterization of the virus and the Chapter II shows the determination of its host range and the relationship with its natural vector Bemisia argentifolii. The virus isolate denoted GO-ANPL was cloned and partially sequenced. Part of the sequenced genome (2.180 nucleotides long) corresponded to the coat protein and Rep genes and comprised the entire intergenic region. Sequence comparison revealed that the GO-ANPL isolate is distantly related to the begomoviruses found in Asia, Europe and Africa, and it is related to other begomoviruses reported in Brazil. The virus isolate showed to be more closely related to viruses found in the State of Minas Gerais (TRMV isolate) and in the Federal District (isolate DF-Br2). The highest homology was observed with the isolate DF-Br2 and it may represent a new specie of the genus Begomovirus. In order to determine the virus host range, 46 plant species from nine different botanical families were mechanically and using the virus vector inoculated. The GO-ANPL isolate preferentially infected plants of the family Solanaceae as Nicotiana benthamiana, Datura stramonium and Nicandra physalodes. The number of infected plants was higher when they were inoculated by the virus vector, and the results were distinct from those obtained for other begomoviruses reported in Brazil. Viruses infections were all confirmed by dot blot hybridization using specific molecular probes to the virus. 4 To study virus/vector interaction, the acquisition access period (AAP), inoculation access period (IAP), and the latent period were determined transfering five whiteflies per plant and using tomato cv. Santa Clara as the host. For the AAP and IAP, nine different time periods were tested: 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 20 and 24 h. The minimal AAP determined was 0.25 h, after which, 6% of the tested plants became infected. The number of infected plants increased to 65% with an AAP of24h.Afteran IAP of 0.5 h, 18% of the plants were infected and their number increased to 67% after an IAP of 24 hours. The latent period was considered to be 16 h, after which, 3% of the inoculated plants became infected. The results of AAP, IAP and latent period seem to indicate an early interaction between virus and vector starting at early stages of vector development. The presence of the GOANPL was determined in all stages of the vector (eggs, 1st to 4th instar and adults) in infected plants, in adults under different AAPs, in the progenies of viruliferous females, and in adults originated from nymphs developed from infected plants. More than 2.500 insects were tested by PCR to detect the GO-ANPL isolate. The virus was detected in nymphs from the 1st to 4th instar that had fed in infected plants and no virus was found in eggs from aviruliferous female that had been laid in infected plants. Transmission to the progenies was observed, since the virus was detected in all stages of insect development from eggs to adults. High level transmission was also observed in newly emerged adults that had acess to virus-infected plants as immatures. This fact, in addition to the transmission to the progenies, suggests that virus retention is an important part of virus/vector interaction. No transmission was observed from adults originated from viruliferous females. However, 33% of virus transmission was obtained when adults that retained virus from their early larval stages were employed. 2001. / Os begomovírus, vírus da família Geminiviridae transmitidos por mosca branca, têm emergido como sérios patógenos de culturas agronômicas e hortícolas em regiões tropicais e subtropicais de muitos países em todo o mundo. A partir da década de 80, têm aumentado os relatos da disseminação da mosca branca, Bemisia argentifolii, e de begomovírus provocando impacto devastador nas regiões em que ocorrem. No Brasil, estes patógenos têm sido limitantes para a produção de tomate (Lycopersicon esculentum) em várias áreas de cultivo com incidência crescente desde 1994. No presente trabalho, plantas de tomate exibindo sintomas de infecção provocada por vírus como mosaico, clorose internerval, enrolamento do limbo foliar e redução do crescimento, foram coletadas em lavouras de tomate indústria em Anápolis-GO. O vírus foi identificado como pertencente ao gênero Begomovirus mediante técnica de PCR usando oligonucleotídeos específicos que amplificaram fragmentos dos componentes A e B do genoma viral. No capítulo I são apresentados os resultados da caracterização molecular e no capítulo II, os dados da determinação do círculo de hospedeiros e da investigação da relação do begomovírus com o vetor Bemisia argentifolii. O isolado denominado GOANPL, foi clonado e parcialmente seqüenciado tendo sido obtidas as seqüências nucleotídicas dos genes da capa proteica, Rep e de toda a região intergênica, em um total de 2.130 nucleotídeos. A análise comparativa das seqüências revelou que, em geral, o GOANPL possui relacionamento genético distante com begomovírus da Ásia, Europa e África sendo mais próximo das espécies do Brasil, particularmente, com os begomovírus identificados em Minas Gerais (TRMV) e no Distrito Federal (DF-BR2). Com este último, apresentou alta homologia em todo o genoma podendo vir a constituir, com o mesmo, uma nova espécie. A determinação do círculo de hospedeiros do GO-ANPL foi realizada inoculando-se 46 espécies vegetais pertencentes a nove famílias botânicas, sob duas modalidades de inoculação: mecânica e com a mosca branca. Constatou-se que o GO-ANPL infecta, preferencialmente, plantas da família Solanaceae como Nicotiana benthamiana, Datura stramonium e Nicandra physalodes. O número de espécies infectadas com o inseto vetor foi superior ao obtido pela inoculação mecânica e diferiu dos resultados obtidos para outros isolados de begomovírus de tomate no Brasil. Os testes foram todos confirmados com hibridização com sondas moleculares, em \"dot blot\"No estudo da relação vírus-vetor, foram investigados o período de acesso de aquisição do vírus (PAA), o período de acesso de inoculação do vírus (PAI), e o período de latência do vírus na fase adulta do vetor, empregando-se cinco moscas/planta de tomate \'Santa Clara\' em todos os tratamentos. Para a definição do PAA e do PAI, foram testados nove diferentes períodos de tempo: 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 20 e 24 horas. Nos testes para determinação do PAA, após cada um desses períodos seguiu-se uma inoculação de 48 horas e para definição do PAI, antes de cada período antecedeu-se um período de acesso de aquisição fixo de 72 horas. Constatou-se que o PAA mínimo da mosca branca foi de apenas 0,25 hora, com o qual foram obtidas 6% de plantas infectadas. O percentual de plantas aumentou de 6 para 65% com a extensão do PAA de 0,25 para 24 horas. Com relação ao período de acesso de inoculação do vírus, foram registrados 18% de plantas infectadas com o PAI de 0,5 hora. O percentual elevou-se para 67% quando 24 horas de PAI foram concedidos. Valores isolados de 90 e 100% na transmissão viral, também foram observados. O término do período latente do vírus no vetor ocorreu 16h após a aquisição do mesmo em planta infectada, considerando os 3% de infecção observados nas plantas inoculadas. Os dados obtidos indicam que a interação vírus-vetor é estabelecida desde a fase inicial de desenvolvimento do inseto. Como parte do estudo dessa interação, avaliou-se a presença do begomovírus GO-ANPL em todas as fases de desenvolvimento do inseto vetor (ovo, 1º ao 4º ínstar e adulto) na planta infectada, em adultos com diferentes PAA, na progênie de fêmeas virulíferas e em adultos cujos estágios ninfais desenvolveram-se em tomateiro infectado. A técnica PCR foi empregada para a detecção do GO-ANPL em mais de 2.500 espécimens testados. O vírus foi detectado em ninfas do 1º ao 4º ínstar que se alimentaram em plantas de tomate infectada, contudo, em ovos provenientes de avirulíferas, os quais foram ovipositados em planta infectada e coletados após sete dias, o vírus não foi detectado. A transmissão à progênie foi constatada pela detecção do vírus em ovos, ninfas e adultos que se desenvolveram em planta não hospedeira do vírus. A transmissão transestadial ocorreu com índice elevado e, ao lado da transmissão à progênie, indica que a retenção do vírus é uma etapa importante da interação vírus–vetor. A transmissão do vírus para mudas de tomate, a partir de adultos da progênie de fêmeas virulíferas, não foi constatada. Contudo, transmissão para tomateiro em um percentual de 33% foi verificado nos casos em que a inoculação das plantas foi realizada pelos adultos que retiveram o vírus da sua fase imatura (transestadial).