Reward-related learning occurs when previously neutral stimuli acquires an enhanced ability to elicit approach and other responses. Studies in the past have shown that dopamine receptor-mediated 3’,5’-cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-dependent intracellular signalling is important for reward-related learning. Until recently, cAMP-dependent protein kinase (PKA) was the only known signalling molecule that was activated by cAMP. However, it has been discovered that another enzyme, exchange protein directly activated by cAMP (Epac), is also activated by cAMP. Thus, it is possible that cAMP mediates reward-related learning by an Epac-dependent signalling pathway. The present study used a conditioned place preference (CPP) paradigm to investigate whether Epac is involved in the acquisition of reward-related learning. Bilateral injections of amphetamine (20 µg/0.5μl/side) into the nucleus accumbens (NAc) have been shown in previous studies to reliably produce a CPP. Thus, amphetamine (20 µg) and Sp-adenosine 3’,5’-cyclic monophosphorothioate triethylamanine (Sp-cAMPS) (0.1, 1.0, 10, 15, 20 µg), an agent that activates both PKA and Epac, or amphetamine (20 µg) and 8-(4-chlorophenylthio)-2’-O-methyladenosine-3’,5’-cyclic monophosphate (8-pCPT) (0.73, 1.27, 1.45, 2.89, 5.78, 11.56 µg), an agent that selectively activates Epac, were co-injected into NAc to determine their effects on the acquisition of CPP. Results showed that 8-pCPT (1.45 µg), but not lower or higher doses, inhibited CPP. Sp-cAMPS (0.1, 15, 20 µg) also inhibited CPP, replicating the results of previous studies. The results implicate Epac in the acquisition of reward-related learning. / Thesis (Master, Neuroscience Studies) -- Queen's University, 2008-04-25 13:29:37.857

Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2014. / ENGLISH ABSTRACT: Ischaemic heart disease is a major contributor to global morbidity and mortality rates. Manoeuvres such as ischaemic preconditioning confer cardioprotection against ischaemia/reperfusion (I/R) injury by activating several intracellular signalling pathways. These pathways have been defined solely in terms of the kinases involved, despite the realization in recent years that protein phosphatase activity also contributes significantly to the attributes of the propagated signal. Protein phosphatase 2A (PP2A) is a heteromultimeric enzyme involved in an array of phosphatase reactions. We hypothesized that PP2A is an important participant in the myocardial response to I/R by regulating intracellular signalling. This project aimed to (i) characterize PP2A during myocardial I/R; (ii) determine the importance of its contribution to the cellular response to I/R; and (iii) investigate its role in the signalling pathways mediated by PKB/Akt, GSK-3β, ERK p42/p44 and p38 MAPK. Two models were used to characterize PP2A during I/R: (i) H9c2 cells exposed to simulated ischaemia (SI) buffer in conjunction with hypoxia (0.5% O2) for a maximum of 2 hours, followed by reoxygenation in standard growth medium for up to 30 minutes; and (ii) isolated working rat hearts exposed to a maximum of 20 minutes global ischaemia and 10 minutes reperfusion. In both models samples were collected at several time points during I/R for Western blotting analysis. PP2A-C (the catalytic subunit) accumulated in the nucleus during early ischaemia, but later redistributed to the cytosol. At the end of ischaemia there was an elevation of PP2A-C relative to PP2A-A in the unfractionated whole cell preparation concomitant with an increase in the inhibitory phosphorylation of PP2A-C. The impact of PP2A activity was evaluated by either inhibiting PP2A using okadaic acid (OA, 10 nM) or activating it by administering FTY720 (1 μM) in an isolated working rat heart model exposed to either 35 minutes of regional ischaemia (RI) with infarct size (IFS) as primary end-point, or 20 minutes global ischaemia (GI) with functional recovery as end-point. The results showed that the pre-ischaemic administration of OA or FTY720 reduced or exacerbated IFS respectively, indicating that PP2A activation during I/R favours cell death. OA and FTY720 were also employed to assess the contribution of PP2A to intracellular signalling in an isolated working rat heart exposed to I/R. Samples were collected at several timepoints and analyzed using Western Blotting. Pre-ischaemic administration of OA enhanced the phosphorylation of PKB/Akt, ERK p42/p44 and GSK-3β at the onset of reperfusion, while FTY720 given before ischaemia reduced the phosphorylation of GSK-3β, p38 MAPK and PKB/Akt at the end of ischaemia and onset of reperfusion. In summary, PP2A is part of an early nuclear-based response to ischaemia, while long-term ischaemia induces an increase in PP2A-C. A portion of this PP2A-C is stored in an inactive form, while an active portion acts as a regulator of the pro-survival signalling components PKB/Akt, GSK- 3β and ERK p42/p44 at the end of ischaemia and the onset of reperfusion. PP2A is therefore an important component of the myocardial response to I/R by regulating pro-survival signalling. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Iskemiese hartsiekte is een van die belangrikste komponente wat bydra tot globale morbiditeit en mortaliteit. Ingrepe soos iskemiese prekondisionering aktiveer veelvoudige intrasellulêre seintransduksiepaaie om kardiobeskerming teen iskemie/herperfusie (I/H)-besering te ontlok. Die kinases betrokke in hierdie seintransduksiepaaie is reeds deeglik nagevors, terwyl die potensiële belang van die proteïenfosfatases in seintransduksie tot onlangs misken is. Ons hipotese was dat Proteïenfosfatase 2A (PP2A), wat in ‘n wye verskeidenheid fosfatase reaksies betrokke is, ‘n belangrike rolspeler in die miokardiale reaksie op I/H-besering is, deur deelname aan die regulering van intrasellulêre seintransduksie. Hierdie projek het ten doel gehad om (i) PP2A te karakteriseer tydens miokardiale I/H; (ii) die belang van PP2A in die sellulêre reaksie op I/H-besering te bepaal; en (iii) PP2A se rol in die seintransduksiepaaie, gemedieer deur PKB/Akt, GSK-3β, ERK p42/p44 en p38 MAPK, te evalueer. Twee modelle is aangewend om PP2A tydens I/H te karakteriseer: (i) H9c2-selle blootgestel aan ‘n simuleerde iskemiebuffer tesame met hipoksie (0.5% O2) vir ‘n maksimum van 2 uur gevolg deur heroksiginasie in standaardgroeimedium vir verskillende tydsperiodes tot ‘n maksimum van 30 minute; en (ii) geïsoleerde, werkende rotharte blootgestel aan ‘n maksimum van 20 minute globale iskemie en 10 minute herperfusie. In beide modelle is monsters op verskillende tye versamel vir Western-kladanalise. Tydens vroeë iskemie het PP2A-C in die kern toegeneem, waarna dit met verloop van tyd na die sitosol herversprei het. Teen die einde van iskemie was daar ‘n toename in die vlakke van PP2A-C relatief tot PP2A-A in ongefraksioneerde weefselhomogenate, tesame met ‘n toename in die inhibitoriese fosforilering van PP2A-C. Die belang van PP2A-aktiwiteit is ondersoek deur die effek te bepaal van die inhibisie of aktivering daarvan op infarktgrootte (IFS) en funksionele herstel in ‘n geïsoleerde werkende rothartmodel, blootgestel aan onderskeidelik 35 minute streeksiskemie (RI) of 20 minute globale iskemie. Preiskemiese toediening van die PP2A-inhibitor okadaïensuur (OA, 10 nM), of aktiveerder FTY720 (1 μm) het infarktgrootte respektiewelik beperk of vergroot. PP2A-aktivering tydens I/H is dus nadelig. OA en FTY720 is ook aangewend om die bydrae van PP2A tot I/H-verwante, intrasellulêre seintransduksie in die geïsoleerde, werkende rothart te bepaal. Monsters is op verskeie tydintervalle versamel en ontleed deur gebruik te maak van die Western-kladtegniek. Preiskemiese toediening van OA het die fosforilering van PKB/Akt, ERK p42/p44 en GSK-3β by die aanvang van herperfusie bevoordeel, terwyl pre-iskemiese toediening van FTY720, die fosforilering van GSK-3β, p38 MAPK en PKB/Akt aan die einde van iskemie en die begin van herperfusie verminder het. Ter opsomming: PP2A is deel van ‘n vroeë gelokaliseerde kerngebaseerde reaksie op iskemie, terwyl langdurige iskemie ‘n toename in PP2A-C relatief tot PP2A-A induseer. ‘n Deel van hierdie PP2A-C is onaktief, terwyl die res funksioneer in die regulering van die seintransduksiekomponente PKB/Akt, GSK-3β en ERK p42/p44 wat oorlewing fasiliteer met die aanvang van herperfusie. PP2A is dus ‘n belangrike komponent in die miokardiale reaksie op I/H deurdat dit tot die beheer van seintransduksiepaaie bydra.

L’athérosclérose est une maladie vasculaire inflammatoire chronique qui se développe progressivement au cours de la vie. Les mécanismes impliqués sont complexes et la recherche de nouveaux candidats impliqués dans l'athérogénèse est toujours d'actualité. L’Angiopoietine-like 2 (Angptl2) est une protéine relativement peu connue, aux propriétés pro-angiogéniques et pro-inflammatoires, qui appartient par homologie à la grande famille des angiopoietines, mais dont le récepteur n'est pas encore clairement identifié. Les situations pathologiques dans lesquelles l’Angptl2 jouerait un rôle crucial sont diverses, mais sa contribution moléculaire dans le développement de l’athérosclérose est inconnue. Par differential display, nous avons initialement identifié l'Angptl2 comme étant surexprimée dans des cellules endothéliales sénescentes, isolées et cultivées à partir d'artères mammaires internes de patients athérosclérotiques ayant subi un pontage coronarien. Cette découverte a été la à base de mon projet, et mes objectifs ont été 1) de déterminer l'implication de l’Angptl2 vasculaire en présence de facteurs de risques tels que le tabagisme et la dyslipidémie, 2) de produire et de purifier une protéine recombinante fonctionnelle de l’Angptl2 afin d'identifier in vitro de nouvelles propriétés cellulaires de l'Angptl2 et 3) d'étudier in vivo le potentiel pro-athérogénique de l'Angptl2 recombinante dans un modèle murin de dyslipidémie sévère. Nous avons montré que l’Angptl2 est sécrétée préférentiellement dans des conditions pro-oxydantes et pro-inflammatoires, avec une augmentation de son expression endothéliale de l’ordre de 6 fois chez des patients coronariens fumeurs atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. Suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’Angptl2, en plus de ses fonctions pro-inflammatoires connues, possède des propriétés pro-oxydantes. Nous avons démontré que l’Angptl2 recombinante stimule en effet la production de radicaux libres dans des HUVEC en culture, via l’inhibition partielle de la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2/HO-1 et potentiellement via l'activation de kinase intracellulaire de type p38. A l'aide de souris dyslipidémiques LDLr-/-; hApoB-100+/+, nous avons démontré que le niveau d’Angptl2 plasmatique, vasculaire et dans les plaques athéromateuses, augmente parallèlement avec le développement de l’athérosclérose. De plus, une stimulation avec l’Angptl2 recombinante engendre chez ces souris une réponse inflammatoire évaluée par l’expression endothéliale de cytokines et de molécules d'adhésion et par l’infiltration de leucocytes sur l’endothélium vasculaire. Finalement, l’administration intraveineuse de la protéine recombinante d’Angptl2 pendant quatre semaines à des souris LDLr-/-; hApoB-100+/+ augmente de 10 fois l'expansion de la plaque athérosclérotique et double leur taux de cholestérol circulant. Nous avons aussi montré que chez des patients athérosclérotiques, l'Angptl2 plasmatique est 6 fois plus élevée que chez des sujets sains du même âge. Nos études semblent donc définir l’Angptl2 comme un facteur contribuant directement au développement de l'athérosclérose en favorisant la sénescence, l’inflammation et l’oxydation des cellules endothéliales. Ces propriétés pourraient globalement définir l'Angptl2, non seulement comme un nouveau biomarqueur circulant de l’athérosclérose, mais également comme l'un de ses promoteurs. / Atherosclerosis is a chronic vascular inflammatory disease that develops gradually during life. While the control mechanisms of this disease are complex and variable, research continues to identify new protein candidates involved in atherogenesis. Angiopoietin-like2 (Angptl2) is a relatively unknown protein, recently shown to display angiogenic and pro-inflammatory properties. Based upon structural homology, Angptl2 is a member of the angiopoietin family; however, the Angptl2 receptor has not yet been clearly identified. The reported pathological situations in which Angptl2 may play a crucial role are multiple, but its molecular contribution in the development of atherosclerosis remains unknown. By differential display, we initially identified Angptl2 as being overexpressed in senescent endothelial cells, isolated and cultivated from internal mammary arteries of atherosclerotic patients undergoing coronary bypass. This observation was at the basis of my project. My specific objectives were 1) to determine the abundance of vascular Angptl2 in the presence of risk factors such as smoking and dyslipidemia, 2) to produce and purify a functional recombinant human Angptl2 protein in order to examine its effects on cellular function in vitro, and 3) to study the pro-atherogenic potential of Angptl2 in vivo using a mouse model of severe dyslipidemia. We showed that Angptl2 is preferentially secreted under pro-oxidant and pro-inflammatory conditions, with a 6-fold increase in endothelial Angptl2 expression in smoker coronary patients with chronic obstructive pulmonary disease. Based on these results, we hypothesized that, in addition to its known pro-inflammatory functions, Angptl2 has pro-oxidant properties. Accordingly, we demonstrated that recombinant Angptl2 stimulates the production of free radicals by HUVEC, an action exerted, at least in part, by the inhibition of the cytoprotective antioxidant pathway, Nrf2/HO-1, and potentially via the activation of the intracellular p38 MAPK pathway. In dyslipidemic LDLr-/-; hApoB-100+/+ mice, we showed that the levels of endogenous Angptl2 in plasma, vascular tissue and atherosclerotic lesions increase in parallel with the development of atherosclerosis. In addition, stimulation with recombinant Angptl2 induces an inflammatory response, as assessed by the expression of cytokines and adhesion molecules and by infiltration of leukocytes into the vascular endothelium. Furthermore, intravenous infusion of purified recombinant Angptl2 for four weeks promoted a 10-fold increase in the formation of atherosclerotic plaques in LDLr-/-; hApoB-100+/+ mice and doubled their circulating cholesterol levels. Finally, we also demonstrated that plasma Angptl2 is 6-fold higher in atherosclerotic patients than in age-matched healthy subjects. These studies therefore strongly suggest that Angptl2 could directly contribute to the development of atherosclerosis by promoting senescence, inflammation and oxidation in endothelial cells. Such properties indicate that Angptl2 may be both a new biomarker of atherosclerosis, as well as one of its contributors.

L’athérosclérose est une maladie vasculaire inflammatoire chronique qui se développe progressivement au cours de la vie. Les mécanismes impliqués sont complexes et la recherche de nouveaux candidats impliqués dans l'athérogénèse est toujours d'actualité. L’Angiopoietine-like 2 (Angptl2) est une protéine relativement peu connue, aux propriétés pro-angiogéniques et pro-inflammatoires, qui appartient par homologie à la grande famille des angiopoietines, mais dont le récepteur n'est pas encore clairement identifié. Les situations pathologiques dans lesquelles l’Angptl2 jouerait un rôle crucial sont diverses, mais sa contribution moléculaire dans le développement de l’athérosclérose est inconnue. Par differential display, nous avons initialement identifié l'Angptl2 comme étant surexprimée dans des cellules endothéliales sénescentes, isolées et cultivées à partir d'artères mammaires internes de patients athérosclérotiques ayant subi un pontage coronarien. Cette découverte a été la à base de mon projet, et mes objectifs ont été 1) de déterminer l'implication de l’Angptl2 vasculaire en présence de facteurs de risques tels que le tabagisme et la dyslipidémie, 2) de produire et de purifier une protéine recombinante fonctionnelle de l’Angptl2 afin d'identifier in vitro de nouvelles propriétés cellulaires de l'Angptl2 et 3) d'étudier in vivo le potentiel pro-athérogénique de l'Angptl2 recombinante dans un modèle murin de dyslipidémie sévère. Nous avons montré que l’Angptl2 est sécrétée préférentiellement dans des conditions pro-oxydantes et pro-inflammatoires, avec une augmentation de son expression endothéliale de l’ordre de 6 fois chez des patients coronariens fumeurs atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. Suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’Angptl2, en plus de ses fonctions pro-inflammatoires connues, possède des propriétés pro-oxydantes. Nous avons démontré que l’Angptl2 recombinante stimule en effet la production de radicaux libres dans des HUVEC en culture, via l’inhibition partielle de la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2/HO-1 et potentiellement via l'activation de kinase intracellulaire de type p38. A l'aide de souris dyslipidémiques LDLr-/-; hApoB-100+/+, nous avons démontré que le niveau d’Angptl2 plasmatique, vasculaire et dans les plaques athéromateuses, augmente parallèlement avec le développement de l’athérosclérose. De plus, une stimulation avec l’Angptl2 recombinante engendre chez ces souris une réponse inflammatoire évaluée par l’expression endothéliale de cytokines et de molécules d'adhésion et par l’infiltration de leucocytes sur l’endothélium vasculaire. Finalement, l’administration intraveineuse de la protéine recombinante d’Angptl2 pendant quatre semaines à des souris LDLr-/-; hApoB-100+/+ augmente de 10 fois l'expansion de la plaque athérosclérotique et double leur taux de cholestérol circulant. Nous avons aussi montré que chez des patients athérosclérotiques, l'Angptl2 plasmatique est 6 fois plus élevée que chez des sujets sains du même âge. Nos études semblent donc définir l’Angptl2 comme un facteur contribuant directement au développement de l'athérosclérose en favorisant la sénescence, l’inflammation et l’oxydation des cellules endothéliales. Ces propriétés pourraient globalement définir l'Angptl2, non seulement comme un nouveau biomarqueur circulant de l’athérosclérose, mais également comme l'un de ses promoteurs. / Atherosclerosis is a chronic vascular inflammatory disease that develops gradually during life. While the control mechanisms of this disease are complex and variable, research continues to identify new protein candidates involved in atherogenesis. Angiopoietin-like2 (Angptl2) is a relatively unknown protein, recently shown to display angiogenic and pro-inflammatory properties. Based upon structural homology, Angptl2 is a member of the angiopoietin family; however, the Angptl2 receptor has not yet been clearly identified. The reported pathological situations in which Angptl2 may play a crucial role are multiple, but its molecular contribution in the development of atherosclerosis remains unknown. By differential display, we initially identified Angptl2 as being overexpressed in senescent endothelial cells, isolated and cultivated from internal mammary arteries of atherosclerotic patients undergoing coronary bypass. This observation was at the basis of my project. My specific objectives were 1) to determine the abundance of vascular Angptl2 in the presence of risk factors such as smoking and dyslipidemia, 2) to produce and purify a functional recombinant human Angptl2 protein in order to examine its effects on cellular function in vitro, and 3) to study the pro-atherogenic potential of Angptl2 in vivo using a mouse model of severe dyslipidemia. We showed that Angptl2 is preferentially secreted under pro-oxidant and pro-inflammatory conditions, with a 6-fold increase in endothelial Angptl2 expression in smoker coronary patients with chronic obstructive pulmonary disease. Based on these results, we hypothesized that, in addition to its known pro-inflammatory functions, Angptl2 has pro-oxidant properties. Accordingly, we demonstrated that recombinant Angptl2 stimulates the production of free radicals by HUVEC, an action exerted, at least in part, by the inhibition of the cytoprotective antioxidant pathway, Nrf2/HO-1, and potentially via the activation of the intracellular p38 MAPK pathway. In dyslipidemic LDLr-/-; hApoB-100+/+ mice, we showed that the levels of endogenous Angptl2 in plasma, vascular tissue and atherosclerotic lesions increase in parallel with the development of atherosclerosis. In addition, stimulation with recombinant Angptl2 induces an inflammatory response, as assessed by the expression of cytokines and adhesion molecules and by infiltration of leukocytes into the vascular endothelium. Furthermore, intravenous infusion of purified recombinant Angptl2 for four weeks promoted a 10-fold increase in the formation of atherosclerotic plaques in LDLr-/-; hApoB-100+/+ mice and doubled their circulating cholesterol levels. Finally, we also demonstrated that plasma Angptl2 is 6-fold higher in atherosclerotic patients than in age-matched healthy subjects. These studies therefore strongly suggest that Angptl2 could directly contribute to the development of atherosclerosis by promoting senescence, inflammation and oxidation in endothelial cells. Such properties indicate that Angptl2 may be both a new biomarker of atherosclerosis, as well as one of its contributors.