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L’étude de la structure de complexes non-covalents présente un intérêt fondamental dans la recherche en chimie des protéines. Le premier objectif est de caractériser les interactions physico-chimiques sur lesquelles repose l’adoption d’une structure tridimensionnelle fonctionnelle par un édifice multimoléculaire. Le second objectif est de mettre en évidence les changements structuraux induits par le phénomène de complexation, et leur influence sur la fonction du système. Le couplage entre la spectrométrie de masse et la mobilité ionique (IM/MS) est une technique d’étude structurale en phase gazeuse, dont le principe repose sur la séparation d’ions selon leur forme et leur rapport masse sur charge, et qui permet en outre de mesurer leurs sections efficaces de diffusion. Grâce à cette technique, nous avons réalisé l’étude structurale de trois complexes non-covalents : l’agrégation de molécules de tanin sur la protéine salivaire humaine IB5, la fixation du ligand Ac2KAA sur la vancomycine, et la complexation de cations métalliques sur des polymères poly-lactide. L’évolution des sections efficaces en fonction de la taille du système ou de l’état de complexation met en évidence la présence de transitions structurales. De plus, utilisé avec de la modélisation moléculaire ou de la spectroscopie laser, le couplage IM/MS s’avère pertinent pour caractériser les interactions responsables de la stabilisation de tels complexes. Ces travaux de thèse montrent que cette technique , au-delà du simple aspect analytique (séparation d’isomères), peut également être utilisée au sein d’études plus globales, mettant en jeu plusieurs techniques afin de résoudre la structure de systèmes complexes / Knowing the structure of non-covalent complexes is essential to understand many biological processes. The first step is the characterization of the interactions leading to the adoption of a functional tridimensional structure by a multimeric assembly. The second step consists of underlining the structural modifications induced by the complexation, and their influence on the system’s function. The Ion Mobility/Mass Spectrometry (IM/MS) is a gas-phase method that is used to separate ions according to their geometry and their masse-to-charge ratio. IM/MS also provides insights on their intrinsic properties, by measuring their collision cross sections. Using this method, we have studied the structure of three different non-covalent complexes: the aggregation of tannins on the human salivary protein IB-5, the fixation of a small ligand (Ac2KAA) on vancomycin, and the complexation between metallic cations and poly-lactid polymers. The evolution of the collision cross-sections as a function of the size of the system or the complexation state clearly shows structural transitions. Moreover, combined with molecular modeling or laser spectroscopy, the IM/MS technique reveals to be a powerful tool to characterize the relevant interactions in such systems. This work proves that IM/MS, besides a powerful analytical aspect, can also be used in global studies that involve several structural methods to resolve the structure of large multimeric assemblies

Les voies de transduction du signal cellulaire permettent aux cellules de répondre aux signaux de l'environnement et de les traiter. Les voies de transduction de kinases MAP (MAPK) sont bien conservées dans toutes les cellules eucaryotes et sont impliquées dans la régulation de nombreux processus cellulaires importants. Les régions intrinsèquement désordonnées (RID), présentes dans de nombreuses MAPK, n'étaient pas encore structurellement caractérisées. Les RID de MAPK sont particulièrement importantes car elles contiennent des motifs de liaison qui contrôlent les interactions entre les protéines MAPK elles-mêmes et aussi entre les protéines MAPK et d'autres protéines contenant les mêmes motifs. La résonance magnétique nucléaire (RMN) en combinaison avec d'autres techniques biophysiques a été utilisée pour étudier les RID de kinase des voies de transduction du signal MAPK. La spectroscopie RMN est bien adaptée pour l'étude des protéines intrinsèquement désordonnées à l'échelle atomique. Les déplacements chimiques et couplages dipolaires résiduels peuvent être utilisés conjointement avec des méthodes de sélection d'ensemble pour étudier la structure résiduelle dans les RID. La relaxation de spin nucléaire nous renseigne sur les mouvements rapides. Des titrations par RMN et des techniques de spectroscopie d'échange peuvent être utilisées pour surveiller la cinétique d'interactions protéine-protéine. Cette étude contribuera à la compréhension du rôle des RID dans les voies de transduction du signal cellulaire. / Protein signal transduction pathways allow cells respond to and process signals from the environment. A group of such pathways, called mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal transduction pathways, is well conserved in all eukaryotic cells and is involved in regulating many important cell processes. Long intrinsically disordered region (IDRs), present in many MAPKs, have remained structurally uncharacterised. The IDRs of MAPKs are especially important as they contain docking-site motifs which control the interactions between MAPK proteins themselves and also between MAPKs and other interacting proteins containing the same motifs. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in combination with other biophysical techniques was used to study IDRs of MAPKs. NMR spectroscopy is well suited for studying intrinsically disordered proteins (IDPs) at atomic-level resolution. NMR observables, such as for example chemical shifts and residual dipolar couplings, can be used together with ensemble selection methods to study residual structure in IDRs. Nuclear spin relaxation informs us about fast pico-nanosecond motions. NMR titrations and exchange spectroscopy techniques can be used to monitor kinetics of protein-protein interactions. The mechanistic insight into function of IDRs and motifs will contribute to understanding of how signal transduction pathways work.

Les objectifs de cette thèse étaient d'apporter une percée conceptuelle pour une compréhension en profondeur des mécanismes moléculaires des protéines intrinsèquement désordonnées (IDPs) et de leurs rôles dans la physiologie cellulaire de Chlamydomonas reinhardtii. La combinaison d’approches expérimentale et bioinformatique m’a permis d’identifier 682 protéines thermorésistantes chez C. reinhardtii. Parmi celles-ci, 299 protéines sont systématiquement prédites comme potentielles IDP par quatre algorithmes de prédiction de désordre. Nos résultats indiquent que le pourcentage désordonné moyen de ces protéines prédites comme étant des IDPs est d'environ 20%, et la plupart d'entre elles (~70%) sont adressées à d'autres compartiments que la mitochondrie et le chloroplaste. Leur composition en acides aminés est biaisée par rapport à d'autres IDPs de la base de données de protéines désordonnées (DisProt). Ces IDPs potentielles jouent des fonctions moléculaires diverses, et 54% d'entre elles sont des cibles de phosphorylation.Notre travail a également augmenté l’état des connaissances sur l'adénylate kinase 3 (ADK3), une enzyme contenant une région intrinsèquement désordonnée (IDR). Cette enzyme a été isolée par notre approche globale pour caractériser les IDPs de l’algue verte. L’extension C-terminale désordonnée (CTE) de cette enzyme lui confère de nouvelles fonctions comme par exemple, la formation d’un complexe bi-enzymatique avec la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), la régulation (négative) de l'activité GAPDH avec le NADPH comme cofacteur, et le rôle de chaperon pour la GAPDH en la protégeant de la dénaturation par traitement thermique et de l’agrégation. / The objectives of this work were to bring a conceptual breakthrough for an in-depth understanding of the molecular mechanisms of intrinsically disordered proteins (IDPs) and their roles in the cellular physiology of Chlamydomonas reinhardtii. Using experimental approaches, 682 heat-resistant proteins were identified as putative IDPs. Among them, 299 proteins were consistently predicted as IDPs by all four disordered predictors. The mean percentage of disordered residues content of these IDPs is about 20%, and most of them (~70%) are addressed to other compartments than mitochondrion and chloroplast. These newly identified IDPs from C. reinhardtii have a biased amino acid composition as regard to other IDPs from the Database of protein disorder (DisProt). Furthermore, they play diverse molecular functions, and 54% of them are the targets for phosphorylation. Our work also revealed more knowledge of the IDR-containing protein adenylate kinase 3 (ADK3) that was extracted by heat-treatment. Its disordered C-terminal extension (CTE) brought new functions to this protein. For instance, via its CTE, ADK3 can form a bi-enzyme complex with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), down-regulates the NADPH-dependent GAPDH activity, and behaves as a chaperone for GAPDH against its aggregation and inactivation under heat-treatment.

La sélénocystéine est incorporée co-traductionnellement dans les sélénoprotéines en réponse à un codon UGA habituellement l'un des 3 codons stop. La protéine SBP2 joue un rôle majeur dans ce mécanisme de recodage en se liant à une structure en tige-boucle (SECIS) située dans la région 3'UTR de l'ARNm des sélénoprotéines. Nous avons isolé et caractérisé fonctionnellement SBP2 de Drosophila melanogaster. Par comparison avec SBP2 humaine, nous avons identifié un domaine de liaison à l'ARN additionnel essentiel à la liaison au SECIS et à la sous-unité ribosomique 60S et permettant une sélectivité structurale du SECIS. Des prédictions structurales et des analyses biophysiques ont établi que SBP2 était une protéine globalement désordonnée ou “Intrinsically Disordered Protein” qui ne se replie qu'en présence de partenaires. Enfin, nous avons établi que l'assemblage des mRNP de sélénoprotéines faisait appel à des facteurs communs et présentait de multiples similarités avec celui des sn/snoRNP.

Proteins are the fundamental macromolecules within a cell that carry out most of the biological functions. The computational study of protein structure and its functions, using machine learning and data analytics, is elemental in advancing the life-science research due to the fast-growing biological data and the extensive complexities involved in their analyses towards discovering meaningful insights. Mapping of protein’s primary sequence is not only limited to its structure, we extend that to its disordered component known as Intrinsically Disordered Proteins or Regions in proteins (IDPs/IDRs), and hence the involved dynamics, which help us explain complex interaction within a cell that is otherwise obscured. The objective of this dissertation is to develop machine learning based effective tools to predict disordered protein, its properties and dynamics, and interaction paradigm by systematically mining and analyzing large-scale biological data. In this dissertation, we propose a robust framework to predict disordered proteins given only sequence information, using an optimized SVM with RBF kernel. Through appropriate reasoning, we highlight the structure-like behavior of IDPs in disease-associated complexes. Further, we develop a fast and effective predictor of Accessible Surface Area (ASA) of protein residues, a useful structural property that defines protein’s exposure to partners, using regularized regression with 3rd-degree polynomial kernel function and genetic algorithm. As a key outcome of this research, we then introduce a novel method to extract position specific energy (PSEE) of protein residues by modeling the pairwise thermodynamic interactions and hydrophobic effect. PSEE is found to be an effective feature in identifying the enthalpy-gain of the folded state of a protein and otherwise the neutral state of the unstructured proteins. Moreover, we study the peptide-protein transient interactions that involve the induced folding of short peptides through disorder-to-order conformational changes to bind to an appropriate partner. A suite of predictors is developed to identify the residue-patterns of Peptide-Recognition Domains from protein sequence that can recognize and bind to the peptide-motifs and phospho-peptides with post-translational-modifications (PTMs) of amino acid, responsible for critical human diseases, using the stacked generalization ensemble technique. The involved biologically relevant case-studies demonstrate possibilities of discovering new knowledge using the developed tools.

Les oreillons sont une maladie très contagieuse causée par le virus ourlien. La méthode préventive (le vaccin) contre ce virus a été déjà mise au point. Par contre, les épidémies récentes restent incontrôlables. Il est donc très important de comprendre le mécanisme moléculaire de son cycle de vie afin d’élaborer le traitement effectif et spécifique. Ce virus appartient à la famille des Paramyxoviridae. Son génome, l’ARN non segmenté monocaténaire de polarité négative, est protégé par la nucléoprotéine (N) en formant des structures filamenteuses nucléocapsides. N joue un rôle essentiel dans la synthèse du génome viral. En effet, cette protéine avec la polymérase et son cofacteur phosphoprotéine (P) constitue la machinerie de transcription-réplication du virus. La N et la P sont composées des régions pliées et dépliées. Malgré que la morphologie du virus ourlien est conservée parmi les autres membres de la famille, il existe quelques différences. Il a été démontré que la P est un oligomère antiparallel avec les deux extrémités d’un côté qui interagissent avec la partie structurale de N (Ncore). Tandis que la fonction de la région désordonnée (Ntail) est compliquée à identifier pour le moment. En comparant avec les autres paramyxovirus connus, Ntail n’interagit pas avec le domaine C-terminal de la P. Le rôle des régions déstructurées de P n’a pas été défini. Dans ce projet, nous dévoilons les mécanismes des interactions entre diverses régions de N et P et nous expliquons comment les domaines intrinsèquement désordonnés de N et P sont impliqués dans la régulation de la machine complexe de réplication virale. Nous avons utilisé la résonance magnétique nucléaire qui est la méthode la plus puissante afin de déterminer la structure, la dynamique et les partenaires d’interaction dont la fonction des protéines dépliées virales. / Mumps is a highly contagious disease caused by the mumps virus. The prevention treatment (vaccine) against it is already in the routine use. However, recent outbreaks still remain uncontrollable. Therefore, it is important to understand the molecular mechanism of the mumps virus life cycle. This virus belongs to the family of Paramyxoviridae. Its genome, negative strand non-segmented RNA is protected by the nucleoprotein (N) by forming filamentous structures called nucleocapsids. N plays an important role in viral genome synthesis. Together with the polymerase and its cofactor phosphoprotein (P) they constitute the transcription-replication machinery. Both N and P contain folded and unfolded regions. Despite mumps virus common morphology with other paramyxovirus, there are some differences. It has been proposed that P is an antiparallel oligomer with two extremities on the one side being in interaction with the structural part of N (Ncore). The function of the disordered domain (Ntail) remains unclear, as it does not seem to bind to the C-terminal part of P, as is the case for other paramyxoviruses. The role of the disordered domains of P is also not known. In this project we revealed mechanisms of interaction between different regions of N and P and we explain how disordered regions of N and P are implicated in the regulation of the complex machinery of viral replication. We used the nuclear magnetic resonance which is the most powerful method to determine structure, dynamics and potential interaction partners, and therefore, function of disordered viral proteins.

ErbB2/HER2 est un récepteur tyrosine kinase de la famille d'EGFR (ErbB1) surexprimé dans plus de 20% des cancers du sein et associé à une forme particulièrement agressive de la maladie. Les récepteurs ErbBs sont actifs seulement sous forme de dimères, permettant la phosphorylation de leur queue C-terminale par leur domaine tyrosine kinase. La phosphorylation entraine l'interaction avec des protéines adaptatrices et l'activation de voies de signalisation, Ras/MAPK et PI3K/Akt principalement. Ces voies contrôlent la prolifération, la motilité cellulaire et la résistance à l'apoptose. Contrairement à ErbB1/3/4, ErbB2 dimérise en l'absence de ligand. Comprendre les autres mécanismes de régulation de la phosphorylation de ses tyrosines et de ses interactions est donc particulièrement intéressant.ErbB2 a fait l'objet de nombreuses études structurales et fonctionnelles. Elles ont permis la mise au point de traitements ciblés efficaces mais sujets à l'apparition de résistance, dont l'anticorps Trastuzumab, ciblant sa partie extracellulaire. La queue C-terminale d'ErbB2 (CtErbB2) a été très souvent ignorée dans ces études. Cette partie étant intrinsèquement désordonnée, il a fallu attendre ces dernières années pour que les concepts et les outils permettant de l'étudier émergent.Dans cette thèse, j'ai d'abord effectué la caractérisation structurale et dynamique de CtErbB2. J'ai montré que bien qu'étant dépourvue de toute structure stable, cette région riche en prolines possède plusieurs structures secondaires transitoires et un contact longue-distance participant très probablement à la régulation de ses interactions intra- et inter-moléculaires. Dans une deuxième partie je me suis intéressée à la caractérisation de la protéine adaptatrice Grb2, partenaire essentiel de ErbB2 pour l'activation de la voie des MAP kinases. L'organisation en solution des domaines de cette protéine modulaire dans sa forme libre était jusque là inconnue. J'ai ensuite étudié l'interaction entre Grb2 et CtErbB2, et montré que CtErbB2 interagit non seulement avec le domaine SH2 de Grb2 (par l'intermédiaire d'une phosphotyrosine), mais aussi avec son domaine SH3 N-terminal (grâce à un motif polyproline). Enfin, j'ai mis en place plusieurs stratégies de phosphorylation des tyrosines de CtErbB2, dans le but d'étudier plus largement l'effet des phosphorylations sur l'ensemble de cette région. / ErbB2/HER2 is a receptor tyrosine kinase of the EGFR (ErbB1) family overexpressed in 20% of breast cancers and associated to a particularly aggressive form of the disease. ErbB receptors are only active upon dimerization that enables phosphorylation of their C-terminal tail by their tyrosine kinase domain. Phosphorylation then triggers interaction with adaptor proteins and activation of signaling pathways, mainly Ras/MAPK and Akt/PI3K. Those pathways control cell proliferation, motility and resistance to apoptosis. Contrary to ErbB1/3/4, ErbB2 can dimerize without any ligand. Understanding other mechanisms of regulation of its tyrosine phosphorylation and of its interactions is thus particularly interesting.ErbB2 structure and function have been extensively studied. This has led to the development of several FDA-approved targeted drugs, that are effective but to which resistance occurs, amongst which the Trastuzumab antibody that targets ErbB2 extracellular domain. The C-terminal tail of ErbB2 (CtErbB2) has been widely ignored in these studies. Since it is intrinsically disordered, the concepts and tools to study it have only emerged in the last few years.In the present work, I have performed the structural and dynamic study of CtErbB2. I showed that despite its lack of any stable structure, this proline-rich region exhibits several transient secondary structures and a long-range contact that might participate in the regulation of its intra- and inter-molecular interactions. Then, I characterized the adaptor protein Grb2, which is a partner of ErbB2 that is essential for the activation of the MAPK pathway. The solution organization of the domains of this modular protein in its apo-form was unknown so far. I also studied the interaction between Grb2 and CtErbB2, showing that in addition to the known SH2-phosphotyrosine interaction, a polyproline motif of CtErbB2 binds to the N-terminal SH3 domain of Grb2. Finally, I implemented several strategies to phosphorylate CtErbB2 tyrosines, to study more extensively the effect of phosphorylation on the whole tail.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Intrinsically disordered proteins (IDPs) are flexible proteins without defined 3D structures. Studies show that IDPs are abundant in nature and actively involved in numerous biological processes. Two crucial subjects in the study of IDPs lie in analyzing IDPs’ functions and identifying them. We thus carried out three projects to better understand IDPs. In the 1st project, we propose a method that separates IDPs into different function groups. We used the approach of CH-CDF plot, which is based the combined use of two predictors and subclassifies proteins into 4 groups: structured, mixed, disordered, and rare. Studies show different structural biases for each group. The mixed class has more order-promoting residues and more ordered regions than the disordered class. In addition, the disordered class is highly active in mitosis-related processes among others. Meanwhile, the mixed class is highly associated with signaling pathways, where having both ordered and disordered regions could possibly be important. The 2nd project is about identifying if an unknown protein is entirely disordered. One of the earliest predictors for this purpose, the charge-hydropathy plot (C-H plot), exploited the charge and hydropathy features of the protein. Not only is this algorithm simple yet powerful, its input parameters, charge and hydropathy, are informative and readily interpretable. We found that using different hydropathy scales significantly affects the prediction accuracy. Therefore, we sought to identify a new hydropathy scale that optimizes the prediction. This new scale achieves an accuracy of 91%, a significant improvement over the original 79%. In our 3rd project, we developed a per-residue C-H IDP predictor, in which three hydropathy scales are optimized individually. This is to account for the amino acid composition differences in three regions of a protein sequence (N, C terminus and internal). We then combined them into a single per-residue predictor that achieves an accuracy of 74% for per-residue predictions for proteins containing long IDP regions.

Proteins are an important component of living organisms, composed of one or more polypeptide chains, each containing hundreds or even thousands of amino acids of 20 standard types. The structure of a protein from the sequence determines crucial functions of proteins such as initiating metabolic reactions, DNA replication, cell signaling, and transporting molecules. In the past, proteins were considered to always have a well-defined stable shape (structured proteins), however, it has recently been shown that there exist intrinsically disordered proteins (IDPs), which lack a fixed or ordered 3D structure, have dynamic characteristics and therefore, exist in multiple states. Based on this, we extend the mapping of protein sequence not only to a fixed stable structure but also to an ensemble of protein conformations, which help us explain the complex interaction within a cell that was otherwise obscured. The objective of this dissertation is to develop effective ab initio methods and tools for protein un/structure prediction by developing effective statistical energy function, conformational search method, and disulfide connectivity patterns predictor. The key outcomes of this dissertation research are: i) a sequence and structure-based energy function for structured proteins that includes energetic terms extracted from hydrophobic-hydrophilic properties, accessible surface area, torsion angles, and ubiquitously computed dihedral angles uPhi and uPsi, ii) an ab initio protein structure predictor that combines optimal energy function derived from sequence and structure-based properties of proteins and an effective conformational search method which includes angular rotation and segment translation strategies, iii) an SVM with RBF kernel-based framework to predict disulfide connectivity pattern, iv) a hydrophobic-hydrophilic property based energy function for unstructured proteins, and v) an ab initio conformational ensemble generator that combines energy function and conformational search method for unstructured proteins which can help understand the biological systems involving IDPs and assist in rational drugs design to cure critical diseases such as cancer or cardiovascular diseases caused by challenging states of IDPs.