Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-24Bitstream added on 2014-12-02T11:21:40Z : No. of bitstreams: 1 000791297.pdf: 1848335 bytes, checksum: 85cf68793dae3a372222dfd097f4d5f2 (MD5) / Objetivou-se, mediante o presente estudo, avaliar a eficácia da aplicação foliar de boro (B) associado, ou não, aos maturadores etil-trinexapac, etefon e sulfometuron metil na pré colheita da cana-de-açúcar, as alterações fisiológicas e suas implicações na qualidade e produtividade de colmos. O presente projeto foi composto de três subprojetos, sendo o primeiro abordando o uso de B associado ao etil-trinexapac, o segundo ao etefon e o terceiro ao sulfometuron metil. Para cada subprojeto foram conduzidos 4 experimentos em início e 4 em final de safra (2 locais e 2 anos), totalizando 12 experimentos em início de safra e 12 em final de safra, ou seja, 24 experimentos. Nos experimentos em início de safra, foi utilizada a variedade de cana-de-açúcar RB855453 (maturação precoce) nos dois locais e em final de safra foi utilizada a variedade SP80-3280 (maturação tardia) no Grupo Raízen e a variedade RB867515 (maturação média-tardia) no Grupo Tereos. Os tratamentos foram constituídos da aplicação dos maturadores etil-trinexapac, etefon, sulfometuron metil e do controle (maturação natural), associados à aplicação de B foliar. As doses empregadas foram, respectivamente, 200 g i.a. ha-1 (0,8 L p.c. Moddus ha-1), 480 g i.a. ha-1 (0,66 L p.c. Ethrel ha-1), 0,15 g i.a. ha-1 (0,20 g p.c. Curavial ha-1) e para o B, a dose foi 0,18 kg ha-1 (1060 g ácido bórico ha-1). Foram avaliados os parâmetros bioquímicos, biométricos, tecnológicos e nutricionais. Concluiu-se que a deficiência de B limita o acúmulo de sacarose em início e final de safra; a aplicação de maturadores em início de safra, isoladamente ou em associação ao B, possibilitou antecipação no corte da matéria-prima em cerca de 15 dias e o B aplicado isoladamente foi ainda mais eficiente, antecipando a maturação em cerca de 18 dias; em final de ... / The aim, through this study, was to evaluate the effectiveness of foliar application of boron (B), associated or not to the ripeners trinexapac-ethyl, ethephon and sulfometuron methyl in pre harvest of sugarcane, the physiological changes and their implications on quality and stalk yield. This project was composed of three subprojects, the first evaluating the use of B associated with trinexapac-ethyl, the second to ethephon and the third to sulfometuron methyl. For each subproject 4 experiments were carried out at the early and at the late season (2 places and 2 years), so were 12 experiments at early season and 12 at late season, totaling 24 experiments. In the experiments at early season, was used the variety of sugarcane RB855453 (early ripening) in both locations and at late season was used the variety SP80-3280 (late ripening) in Raízen Group and variety RB867515 (middle-late season) in Tereos group. The treatments consisted in the application of the ripeners trinexapac-ethyl, ethephon, sulfometuron methyl and control (natural ripening) associated with the application of B. The doses used were, respectively, 200 g i.e. ha-1 (0,8 L c.p. Moddus ha-1), 480 g i.e. ha-1 (0,66 L c.p. Ethrel ha-1), 0,15 g i.e. ha-1 (0,20 g c.p. Curavial ha-1) and for B the dose was 0,18 kg ha-1 (1060 g boric acid ha-1). Biochemical, biometric, technological and nutritional parameters were evaluated. It was concluded that B deficiency in pre-harvest of sugarcane limits the accumulation of sucrose at early and at late season; at early season the ripeners applied alone or in association with B enabled anticipation in the raw material harvesting in about 15 days and B applied alone was even more efficient, anticipating in about 18 days; at late season the ripeners were effective in maintaining the high sucrose concentration longer than control treatment, as well as B applied alone or in association with ...

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-09-04Bitstream added on 2015-03-03T12:06:35Z : No. of bitstreams: 1 000806921_20151027.pdf: 88769 bytes, checksum: ee2079f5c5af519526da722d146280cb (MD5) Bitstreams deleted on 2015-11-03T14:39:15Z: 000806921_20151027.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-11-03T14:40:16Z : No. of bitstreams: 1 000806921.pdf: 1901089 bytes, checksum: 19ea9e2e9292aca8fe31cea875b9a490 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A imobilização da invertase em resíduos agroindustriais traz diversas vantagens, como a criação de uma inovação biotecnológica, reaproveitamento de matérias e obtenção de açúcar invertido de alta qualidade e alto grau de pureza. O objetivo do trabalho foi analisar métodos físicos de extração da invertase de Saccharomyces cerevisiae e protocolos de ativação de pó de sabugo de milho para imobilização da enzima, e posteriormente avaliar os derivados quanto à potencialidade para produção de açúcar invertido. A levedura foi submetida a seis tratamentos físicos de rompimento: (1) congelamento, (2) congelamento com água, (3) ultrassom, (4) agitação na presença de abrasivos, (5) maceração sem solventes orgânicos e (6) maceração com éter. O extrato do melhor método foi parcialmente purificado. O pó de sabugo de milho foi ativado (1) com a formação de grupos glioxil, amino e glutaraldeído subsequentes, ou (2) com oxidação direta, formação de grupos amino e glutaraldeído, também subsequentes. A estabilidade térmica, inativação térmica e meia vida dos derivados foram avaliadas. O melhor derivado foi então estocado úmido, em água destilada, tampão fosfato de sódio pH 7 e tampão acetato de sódio pH 4,5, e submetido a experimentos de carga máxima enzimática e utilizado em reator de batelada e de leito fluidizado com solução de sacarose 40%. Dos seis tratamentos de extração da invertase, a agitação na presença de abrasivos foi capaz de extrair maior quantidade de proteínas (3,3 ± 0,4 mg.mL-1) e unidades enzimáticas (509,0 ± 81,3 U.mL-1), entretanto o tratamento com maior atividade específica foi o ultrassom (1696,5 ± 528,7 U.mg-1). O método escolhido como melhor foi o congelamento puro, que após purificação parcial resultou em extrato com 1.101,27 U, atividade específica de 1.324,28 U.mg-1, velocidade máxima de 3.333,3 ?mols.min-1.mg-1 e Km de 54,7 mM. A imobilização foi ... / Immobilization of invertase on agro-industrial byproducts has many advantages, such as a biotechnology innovation, reuse of materials and obtaining of high quality and purity invert sugar. The objective of this work was to analyze physical methods for invertase extraction from Saccharomyces cerevisiae and the activation of powdered corncobs for enzyme immobilization protocols, and then evaluate the potential of the derivatives for the production of invert sugar. The yeast was subjected to six physical disruption treatments: freezing, freezing with water, ultrasound, stirring in presence of abrasives, maceration without organic solvents and maceration with ether. The extract from the best extraction method was partially purified. The powdered corncobs were activated (1) with the formation of glyoxyl, amine and glutaraldehyde groups, subsequently, or (2) direct oxidation, formation of amine and glutaraldehyde groups, also subsequently. The thermal stability, thermal inactivation and half-life of the products were evaluated. The best derivative was then stored dampened, in distilled water, sodium phosphate buffer pH 7 and sodium acetate buffer pH 4.5, and subjected to maximum enzyme load test, in batch reactor and fluidized bed reactor with 40% sucrose solution. Among the six invertase extraction treatments, the agitation in the presence of abrasive extracted greater amounts of protein (3.3 ± 0.4 mg.mL-1) and enzymatic units (509.0 ± 81.3 U.mL-1), however treatment with higher specific activity was ultrasound (1696.5 ± 528.7 U.mg-1). The method chosen as the best was freezing, that after partial purification resulted in extracts with 1101.27 U, specific activity of 1,324.28 U.mg-1, Vmax of 3,333.3 ?mols.min-1.mg-1 and Km of 54.7 mM. Immobilization was completed after 90 minutes of reaction, whereas the derivative from direct oxidized was capable of retaining higher enzyme activity and was the more stable at 60oC. Both derivatives showed ...

Orientador: Antonio José Goulart / Banca: Ariela Veloso de Paula / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Resumo: A imobilização da invertase em resíduos agroindustriais traz diversas vantagens, como a criação de uma inovação biotecnológica, reaproveitamento de matérias e obtenção de açúcar invertido de alta qualidade e alto grau de pureza. O objetivo do trabalho foi analisar métodos físicos de extração da invertase de Saccharomyces cerevisiae e protocolos de ativação de pó de sabugo de milho para imobilização da enzima, e posteriormente avaliar os derivados quanto à potencialidade para produção de açúcar invertido. A levedura foi submetida a seis tratamentos físicos de rompimento: (1) congelamento, (2) congelamento com água, (3) ultrassom, (4) agitação na presença de abrasivos, (5) maceração sem solventes orgânicos e (6) maceração com éter. O extrato do melhor método foi parcialmente purificado. O pó de sabugo de milho foi ativado (1) com a formação de grupos glioxil, amino e glutaraldeído subsequentes, ou (2) com oxidação direta, formação de grupos amino e glutaraldeído, também subsequentes. A estabilidade térmica, inativação térmica e meia vida dos derivados foram avaliadas. O melhor derivado foi então estocado úmido, em água destilada, tampão fosfato de sódio pH 7 e tampão acetato de sódio pH 4,5, e submetido a experimentos de carga máxima enzimática e utilizado em reator de batelada e de leito fluidizado com solução de sacarose 40%. Dos seis tratamentos de extração da invertase, a agitação na presença de abrasivos foi capaz de extrair maior quantidade de proteínas (3,3 ± 0,4 mg.mL-1) e unidades enzimáticas (509,0 ± 81,3 U.mL-1), entretanto o tratamento com maior atividade específica foi o ultrassom (1696,5 ± 528,7 U.mg-1). O método escolhido como melhor foi o congelamento puro, que após purificação parcial resultou em extrato com 1.101,27 U, atividade específica de 1.324,28 U.mg-1, velocidade máxima de 3.333,3 μmols.min-1.mg-1 e Km de 54,7 mM. A imobilização foi ... / Abstract: Immobilization of invertase on agro-industrial byproducts has many advantages, such as a biotechnology innovation, reuse of materials and obtaining of high quality and purity invert sugar. The objective of this work was to analyze physical methods for invertase extraction from Saccharomyces cerevisiae and the activation of powdered corncobs for enzyme immobilization protocols, and then evaluate the potential of the derivatives for the production of invert sugar. The yeast was subjected to six physical disruption treatments: freezing, freezing with water, ultrasound, stirring in presence of abrasives, maceration without organic solvents and maceration with ether. The extract from the best extraction method was partially purified. The powdered corncobs were activated (1) with the formation of glyoxyl, amine and glutaraldehyde groups, subsequently, or (2) direct oxidation, formation of amine and glutaraldehyde groups, also subsequently. The thermal stability, thermal inactivation and half-life of the products were evaluated. The best derivative was then stored dampened, in distilled water, sodium phosphate buffer pH 7 and sodium acetate buffer pH 4.5, and subjected to maximum enzyme load test, in batch reactor and fluidized bed reactor with 40% sucrose solution. Among the six invertase extraction treatments, the agitation in the presence of abrasive extracted greater amounts of protein (3.3 ± 0.4 mg.mL-1) and enzymatic units (509.0 ± 81.3 U.mL-1), however treatment with higher specific activity was ultrasound (1696.5 ± 528.7 U.mg-1). The method chosen as the best was freezing, that after partial purification resulted in extracts with 1101.27 U, specific activity of 1,324.28 U.mg-1, Vmax of 3,333.3 μmols.min-1.mg-1 and Km of 54.7 mM. Immobilization was completed after 90 minutes of reaction, whereas the derivative from direct oxidized was capable of retaining higher enzyme activity and was the more stable at 60oC. Both derivatives showed ... / Mestre

Orientador: Marystela Ferreira / Banca: Debora Terezia Balogh / Banca: Débora Gonçalves / O Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Materiais, PosMat, tem caráter institucional e integra as atividades de pesquisa em materiais de diversos campi da Unesp / Resumo: Neste trabalho, investigou-se a fabricação e caracterização de filmes ultrafinos de poli(alilamina hidroclorada) PAH com as enzimas glicose oxidase (GOx) e invertase (INV) no desenvolvimento de biossensores amperométricos para a detecção de glicose e sacarose. Filmes nanoestruturados obtidos pela técnica layer-by-layer (LbL) possibilitaram estudar a imobilização de cada enzima juntamente com o polieletrólito, além de diversas arquiteturas bienzimáticas mais complexas, em eletrodos modificados com Azul da Prússia, no desenvolvimento do biossensor. O crescimento dos filmes produzidos foi acompanhado por técnicas de espectroscopia UV-vis e fluorescência; além de técnicas eletroquímicas de voltametria cíclica e amperometria na avaliação das propriedades e resposta do biossensor. Por fim, investigou-se o aprimoramento do biossensor e análises qualitativas preliminares na avaliação de bebidas comerciais / Abstract: In this work, we investigated the fabrication and characterization of ultrathin films of poly(allylamine hydrochloride) PAH and the enzymes glucose oxidase (GOx) and invertase (INV) in the development of amperometric biosensors for glucose and sucrose detection. Nanostructured films obtained by layer-by-layer (LbL) technique were able to study the immobilization of each enzyme coupled with the polyelectrolyte, beyond different and more complex bienzimatic architectures, in Prussian Blue modified electrodes, for the biosensor development. The films' growth was monitored by fluorescence and UV-vis spectroscopic techniques; moreover electrochemical techniques such as cyclic voltammetry and amperometry were used on the evaluation of biosensor properties and response. At last, we investigated the biosensor improvement and qualitative initial analysis on the evaluation of commercial beverages / Mestre

A enzima β-D- frutofuranosídeo frutohidrolase (E.C. 3.2.1.26), também conhecida como invertase, é uma hidrolase capaz de clivar o dissacarídeo sacarose, gerando mistura equimolar de glicose e frutose (‘açúcar invertido’). A aplicação deste, bem como a dos monossacarídeos de modo isolado é bastante comum na indústria alimentícia, por exemplo na manufatura de recheios de doces, além de outras aplicações, como na indústria farmacêutica. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes suportes e métodos de imobilização de uma invertase de Saccharomyces cerevisiae. Os experimentos feitos com filmes de celulose, macroesferas de quitosana, e o suporte comercial Immobead não apresentaram resultados conclusivos. A imobilização covalente unipontual da invertase em mistura de nano e agregados de nanopartículas de quitosana possibilitou a obtenção dos seguintes resultados: além desse suporte ser de fácil preparação e ativação, oferecendo grande área superficial para a imobilização, o derivado imobilizado apresentou alta recuperação da atividade, sendo utilizado o protocolo que permitiu obter 74,3 % de rendimento e 61,6 % de eficiência de imobilização. A temperatura (55 ºC) e o pH ótimos de atividade (4,5), estabilidade térmica e ao armazenamento não foram modificados pós-imobilização. A afinidade da invertase pelo substrato decaiu cerca de 3 vezes, devido à reduzida acessibilidade da sacarose ao sítio ativo da enzima. Porém, o parâmetro Vmax manteve-se constante, indicando que não houve perda na máxima conversão da sacarose em seus monossacarídeos. Através da imobilização foi possível obter excelente estabilidade operacional: 59 reusos com 100 % da atividade catalítica da enzima (bateladas de 30 min, sob suave agitação, com solução de sacarose 8 %, a 55 ºC). / The enzyme β-D- fructofuranoside fructohydrolase (E.C. 3.2.1.26), also known as invertase, is one hydrolase able to cleave the sucrose disaccharide, generating an equimolar mixture of glucose and fructose (‘invert sugar’). The application of invert sugar, as well the isolated monosaccharides is very common in the food industry, for example in the manufacture of filling of sweets, besides other applications, as in the pharmaceutical industry. The objective of this work was to evaluate different supports and immobilization methods of an invertase from Saccharomyces cerevisiae. The experiments performed with cellulose films, chitosan macrospheres and the commercial support Immobead did not present conclusive results. The unipoint covalent immobilization of invertase in a mixture of chitosan nano and aggregated nanoparticles made possible to obtain the following results: besides the easy preparation and activation of this support, offering high superficial area for enzyme immobilization, the immobilized derivative presented high activity recovery, which allowed getting 74.3 % of immobilization yield and 61.6 % of immobilization efficiency. The optimal temperature (55 ºC) and pH (4.5) for activity, thermal and storage stabilities were not modified after immobilization. The enzyme affinity for its substrate decreased about 3 folds, mainly due to the reduced accessibility of sucrose to the catalytic site of the enzyme. However the parameter Vmax remained constant, indicating that there was not loss in the maximal conversion of sucrose in its monosaccharides. Through the immobilization was possible to obtain excellent operational stability: 59 reuses with 100 % of the catalytic enzyme activity (batches of 30 min, under genlte stirring, with sucrose solution 8 %, 55 ºC).

A enzima β-D- frutofuranosídeo frutohidrolase (E.C. 3.2.1.26), também conhecida como invertase, é uma hidrolase capaz de clivar o dissacarídeo sacarose, gerando mistura equimolar de glicose e frutose (‘açúcar invertido’). A aplicação deste, bem como a dos monossacarídeos de modo isolado é bastante comum na indústria alimentícia, por exemplo na manufatura de recheios de doces, além de outras aplicações, como na indústria farmacêutica. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes suportes e métodos de imobilização de uma invertase de Saccharomyces cerevisiae. Os experimentos feitos com filmes de celulose, macroesferas de quitosana, e o suporte comercial Immobead não apresentaram resultados conclusivos. A imobilização covalente unipontual da invertase em mistura de nano e agregados de nanopartículas de quitosana possibilitou a obtenção dos seguintes resultados: além desse suporte ser de fácil preparação e ativação, oferecendo grande área superficial para a imobilização, o derivado imobilizado apresentou alta recuperação da atividade, sendo utilizado o protocolo que permitiu obter 74,3 % de rendimento e 61,6 % de eficiência de imobilização. A temperatura (55 ºC) e o pH ótimos de atividade (4,5), estabilidade térmica e ao armazenamento não foram modificados pós-imobilização. A afinidade da invertase pelo substrato decaiu cerca de 3 vezes, devido à reduzida acessibilidade da sacarose ao sítio ativo da enzima. Porém, o parâmetro Vmax manteve-se constante, indicando que não houve perda na máxima conversão da sacarose em seus monossacarídeos. Através da imobilização foi possível obter excelente estabilidade operacional: 59 reusos com 100 % da atividade catalítica da enzima (bateladas de 30 min, sob suave agitação, com solução de sacarose 8 %, a 55 ºC). / The enzyme β-D- fructofuranoside fructohydrolase (E.C. 3.2.1.26), also known as invertase, is one hydrolase able to cleave the sucrose disaccharide, generating an equimolar mixture of glucose and fructose (‘invert sugar’). The application of invert sugar, as well the isolated monosaccharides is very common in the food industry, for example in the manufacture of filling of sweets, besides other applications, as in the pharmaceutical industry. The objective of this work was to evaluate different supports and immobilization methods of an invertase from Saccharomyces cerevisiae. The experiments performed with cellulose films, chitosan macrospheres and the commercial support Immobead did not present conclusive results. The unipoint covalent immobilization of invertase in a mixture of chitosan nano and aggregated nanoparticles made possible to obtain the following results: besides the easy preparation and activation of this support, offering high superficial area for enzyme immobilization, the immobilized derivative presented high activity recovery, which allowed getting 74.3 % of immobilization yield and 61.6 % of immobilization efficiency. The optimal temperature (55 ºC) and pH (4.5) for activity, thermal and storage stabilities were not modified after immobilization. The enzyme affinity for its substrate decreased about 3 folds, mainly due to the reduced accessibility of sucrose to the catalytic site of the enzyme. However the parameter Vmax remained constant, indicating that there was not loss in the maximal conversion of sucrose in its monosaccharides. Through the immobilization was possible to obtain excellent operational stability: 59 reuses with 100 % of the catalytic enzyme activity (batches of 30 min, under genlte stirring, with sucrose solution 8 %, 55 ºC).

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-17T15:27:34Z No. of bitstreams: 2 TESE Mariana Cabrera.pdf: 5580819 bytes, checksum: 0dc4140c6f92f1a1ba8fa8392c66b340 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T15:27:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Mariana Cabrera.pdf: 5580819 bytes, checksum: 0dc4140c6f92f1a1ba8fa8392c66b340 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-02-15 / CAPES; CNPq / O uso de enzimas imobilizadas em aplicações industriais permite o desenvolvimento de processos de produção com alta produtividade, fácil separação do produto e reutilização do biocatalisador. Alguns grupos de enzimas apresentam muitas vantagens quando imobilizadas em suportes insolúveis em água, devido à melhoria de suas propriedades catalíticas e estabilidade ou pela síntese de baixo custo. Tendo em vista tais vantagens, enzimas de aplicabilidade industrial como α-Lramnosidase e invertase foram imobilizadas em diferentes suportes magnéticos. A α-L-ramnosidase de Aspergillus terreus foi imobilizada covalentemente nos seguintes suportes ferromagnéticos: polietileno tereftalato (Dacron-hidrazida), polisiloxano/álcool polivinílico (POS/PVA) e quitosana. A atividade da enzima imobilizada em Dacron-hidrazida (0,53 nkat/g de proteína) e POS/PVA (0,59 nkat/g de proteína) foi significativamente maior do que a encontrada para o derivado de quitosana (0,06 nkat/mg de proteína). Os perfis de pH e temperatura para todas as enzimas imobilizadas não mostraram diferença em relação à enzima livre, exceto o derivado de quitosana que apresentou maior temperatura máxima. O derivado enzimático Dacron-hidrazida mostrou melhor desempenho que a enzima livre para hidrolisar a naringina 0,3% (91% e 73% após 1 h, respectivamente) e na síntese de ramnósidos (0,116 e 0,014 mg narirutina após 1 h, respectivamente). Além disso, minerais como argilas e terra de diatomáceas foram utilizados para produzir compósitos com partículas de magnetita. Esses compósitos foram caracterizados por meio de diferentes técnicas físico-químicas a fim de elucidar suas propriedades estruturais, morfológicas e magnéticas. Três tipos de materiais foram sintetizados: argila montmorilonita magnética (mMMT), terra de diatomáceas magnética (mTD) e terra de diatomáceas magnética revestida com polianilina (mTD-PANI). Os compósitos magnéticos foram tratados com 3- aminopropiltrietoxisilano ou polianilina, disponibilizando grupamentos químicos para ocorrência de ligação covalente entre a matriz e a biomolécula. Após funcionalização dos suportes e ativação com glutaraldeído, os materiais foram utilizados como matriz para imobilização covalente de invertase. A invertase imobilizada em mMMT apresentou igual pH ótimo, maior temperatura máxima e estabilidade térmica quando comparada com a enzima livre, e manteve 91% da sua atividade inicial após 7 ciclos consecutivos de reutilização. No estudo da hidrólise de sacarose pela mTD-invertase, foi realizado um planejamento fatorial completo 24, sendo observadas como melhores condições experimentais para este processo: pH 4,5; temperatura de 45°C; concentração de sacarose 0,25 M e concentração de invertase 0,05 mg mL-1. A mTD-invertase mostrou bom desempenho quanto à termoestabilidade, estabilidade de armazenamento, tempo de prateleira e reuso quando comparada à enzima livre. A mTD-PANI-invertase apresentou igual pH ótimo e temperatura máxima e maior termoestabilidade que a enzima livre, e manteve 55% da sua atividade inicial após 10 ciclos consecutivos de reutilização. Portanto, os resultados mostraram que os compósitos magnéticos produzidos a partir de materiais orgânicos e inorgânicos (minerais de baixo custo e altamente disponíveis na natureza) são matrizes promissoras para a imobilização covalente de α-L-ramnosidase e invertase, bem como para a imobilização de outras biomoléculas.

The SUC2 locus of Saccharomyces cerevisiae encodes two forms of invertase; a constitutively expressed cytoplasmic enzyme and a glucose-repressible secreted and glycosylated enzyme which is initially produced with an amino-terminal signal peptide. The coding sequence of the SUC2 locus has been placed under the control of the constitutive ADH1 promoter and transcription terminator in a centromere based yeast plasmid vector from which invertase is expressed in a Sue" strain of yeast. Oligonucleotide-directed mutagenesis has been used to create a PstI site in the gene at the point encoding the signal peptide cleavage site. An internal methionine codon, the translation start for the cytoplasmic invertase, has been replaced by a serine codon. Mutants in the signal peptide sequence have been produced by replacing the region of the gene upstream of the PstI site with synthetic oligonucleotide cassettes with mixtures of nucleotides at several positions. The mutants could be divided into three classes based on their ability to secrete invertase. The first class of mutants produced secreted invertase, but in reduced amount. There is no obvious correlation between mutation and phenotype. The second class, represented by mutant 4-55B, also exhibited a reduced level of invertase, but a significant fraction (30%) of the enzyme is intracellular. This mutant had a delay in signal peptide cleavage which retards passage of invertase through the secretory pathway. The third class was defective in secretion. Most were defective in translocation from the cytoplasm to the lumen of the endoplasmic reticulum (ER), and produced enzymatically active, non-glycosylated pre-invertase in the cytoplasm. This class of mutant invertases, when transcribed and translated in vitro, was not processed by canine pancreas signal recognition particle (SRP) and microsomes. Comparison of the sequences of the mutant signal peptides of this non-translocating class identifies amino acids at the extreme amino-terminus as the causative defect. / Medicine, Faculty of / Biochemistry and Molecular Biology, Department of / Graduate

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