<p>During brain activity neurons release the major excitatory transmitter glutamate, which is taken up by astrocytes and converted to glutamine. Glutamine returns to neurons for re-conversion to glutamate. This glutamate-glutamine cycle is energy demanding. Glutamate turnover in injured brain was studied using an animal iron-induced posttraumatic epilepsy model and using neurointensive care data from 33 patients with spontaneous subarachnoid hemorrhage (SAH). Immunoblotting revealed that the functional form of the major astrocytic glutamate uptake protein GLT-1 was decreased 1-5 days following a cortical epileptogenic iron-injection, presumably due to oxidation-induced aggregation. Using microdialysis it was shown that the GLT-1 decrease was associated with increased interstitial glutamate levels and decreased interstitial glutamine levels. The results indicate a possible posttraumatic and post-stroke epileptogenic mechanism. Analysing 3600 microdialysis hours from patients it was found that the interstitial lactate/pyruvate (L/P) ratio correlate with the glutamine/glutamate ratio (r =-0.66). This correlation was as strong as the correlation between L/P and glutamate (r=0.68) and between lactate and glutamate (r=0.65). Pyruvate and glutamine correlated linearly (r=0.52). Energy failure periods, defined as L/P>40, were associated with high interstitial glutamate levels. Glutamine increased or decreased during energy failure periods depending on pyruvate. Energy failure periods were clinically associated with delayed ischemic neurological deficits (DIND) or development of radiologically verified infarcts, confirming that L/P>40 is a pathological microdialysis pattern that can predict ischemic deterioration after SAH. DIND-associated microdialysis patterns were L/P elevations and surges in interstitial glutamine. Glutamine and pyruvate correlated with the cerebral perfusion pressure (r=0.25, r=0.24). Glutamine and the glutamine/glutamate ratio correlated with the intracranial pressure (r=-0.29, r=0.40). Glutamine surges appeared upon substantial lowering of the intracranial pressure by increased cerebrospinal fluid drainage. Increased interstitial glutamine and pyruvate levels may reflect augmented astrocytic glycolysis in recovering brain tissue with increased energy demand due to a high glutamate-glutamine turnover.</p>

La réaction inflammatoire post-ischémique est dominée par les cellules mononuclées phagocytaires : la microglie, cellules immunocompétentes du parenchyme cérébral, et les macrophages dérivant du sang et infiltrant le tissu cérébral lésé. L’imagerie cellulaire par IRM avec injection de nanoparticules superparamagnétiques d’oxydes de fer (USPIO) a contribué à la description dynamique de cette infiltration macrophagique tardive. Cependant, la séquence spatio-temporelle de l’activation microgliale et du recrutement macrophagique, intriqués avec des altérations de la barrière hématoencéphalique au cours des premières heures post-ischémie, reste mal élucidée. Nous avons tenté de mieux comprendre la relation entre les signaux IRM après injection d’USPIO et la réaction phagocytaire aux temps précoces post-ischémie dans un modèle d’accident vasculaire cérébral chez la souris. Nos résultats suggèrent que les modifications précoces de signal après injection d’USPIO reflètent principalement des mécanismes non spécifiques d’entrée des particules dans le tissu lésé. Pour étudier les interactions entre les cellules neurales et les macrophages périphériques au cours de la réaction inflammatoire post-ischémique précoce, nous avons développé un modèle in vivo d’ischémie globale chez la souris et un modèle in vitro d’hypoxie sur cultures organotypiques d’hippocampe. Ce dernier modèle nous a permis d’analyser les effets de co-cultures macrophagiques sur la survie des cellules neurales au sein du parenchyme cérébral ischémié et d’analyser les profils d’expressions cytokiniques impliqués dans ces interactions à médiation humorale. Nous avons observé un effet neuroprotecteur sur la perte neurale post-hypoxique des co-cultures macrophagiques. Cet effet à médiation humorale est associé à un profil d’activation macrophagique de type alternatif (M2). / Clinical outcome in cerebral ischemia may be influenced by innate immune cells of myeloid lineage : central nervous system (CNS)-infiltrating peripheral macrophages and CNS-resident microglia. Noninvasive monitoring of these cells may improve the understanding of postischemic inflammation. Accumulation of Ultrasmall Superparamagnetic Particles of Iron Oxide (USPIO) has been observed in infarcted areas at the subacute stage of experimental stroke. However, the exact route of USPIO uptake and early brain distribution remain elusive, hampering the interpretation of USPIO-relatedsignals. Therefore, we compared MRI signal changes after intravenous USPIO injection with the histological distribution of iron particles and macrophagic cells 6 to 24 hours after permanent middle cerebral artery occlusion in mice. Our results suggest that in this model, early USPIO-related MR signal changes are mainly related to passive diffusion of free USPIO through a damaged blood-brain barrier and to intravascular trapping rather than peripheral phagocyte infiltration. To understand the complex interactions between microglia, hypoxic neurons and CNS-infiltrating macrophages, we setup an in vitro model where primary macrophages were co-cultured with hippocampal slices submitted to hypoxia and glucose deprivation (OGD). Our results indicate that under these experimental conditions, cultured macrophages engage in a M2 activation pattern and afford partial protection from OGD-induced neuronal loss through paracrine mechanisms. We also conclude that microglia is susceptible to hypoxia-induced cell death in vitro and in vivo

In addition to host defense, alternative functions of immune cells are emerging. Immune cells are crucial during healing of injured tissue, in formation of new blood vessels, angiogenesis, and also in maintaining the balance in inflammation having immune regulating functions. Over the last decade a higher degree of heterogeneity and plasticity of immune cells have been reported and immune cells develop different characteristics in different situations in vivo. This thesis investigates roles for immune cells in situations of muscle hypoxia and reduced blood perfusion, wound healing in skin and at sites of transplantation of allogeneic islets of Langerhans and on top of this, ways to steer immune cell function for future therapeutic purposes. A specific neutrophil subset (CD49d+VEGFR1+CXCR4high) was found to be recruited to VEGF-A released at hypoxia and these neutrophils were crucial for functional angiogenesis. In muscle with restricted blood flow macrophages were detected in perivascular positions and started to express aSMA and PDGFR1b and were found to directly assist in blood flow regulation by iNOS-dependent NO production. This essential function in muscle regain of function could be boosted by plasmid overexpression of CXCL12 where the effect of these macrophages chaperoning the vasculature was amplified improving limb blood flow regulation. The effect on macrophages accelerating tissue regeneration being amplified by CXCL12 was tested in a model of cutaneous wound healing where the administration of CXCL12 was optimized for high bioavailability. In the skin, CXCL12-treatment induced accumulation of TGFb-expressing macrophages close to the wound driving the healing process, and subsequently the wounds healed with an efficiency never reported before. In the last study means to circumvent systemic immune suppressive therapy required in allogeneic transplantation was investigated. Allogeneic islets of Langerhans transplanted to muscle were immediately destroyed by the host immune system. Co-transplanting islets and CCL22-encoding plasmids we could curb this fast rejection for 10 days by accumulating CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T lymphocytes at the site for transplantation preventing islet grafts from being attacked by the host cytotoxic T lymphocytes. In summary this thesis outlines distinct immune cell subsets being essential for regain of tissue function in hypoxia, ischemia and post injury and ways to amplify specific immune cell functions in these situations that are feasible for clinical use.

Résumé : Les patients diabétiques ont plus de risques d’être amputés d’une jambe en raison d’une plus faible néovascularisation suite à une ischémie. Nous avons montré une association entre une plus faible réponse angiogénique du VEGF chez les souris diabétiques (DM) et une augmentation de l’expression de SHP-1, pouvant être activée par les récepteurs (AT[indice inférieur 1]/AT[indice inférieur 2]). La délétion du récepteur AT[indice inférieur 2] chez des souris favorise l’angiogenèse dans le muscle ischémique, mais son rôle en condition diabétique demeure inconnu. Notre objectif est de vérifier si la délétion du récepteur AT[indice inférieur 2] chez des souris DM favorise l’angiogenèse suivant l’induction d’une ischémie. Des souris DM de type 1 déficientes (KO) ou non pour le récepteur AT[indice inférieur 2] ont été utilisées. L’ischémie a été induite par la ligature de l'artère fémorale. La perfusion sanguine a été mesurée pendant 2 ou 4 semaines avant la récolte des tissus. Les effets de l’ischémie sur l’expression des récepteurs AT[indice inférieur 1] et AT[indice inférieur 2], des phosphatases SHP-1, SHP-2 et PTP1B, ainsi que l’état de la voie de signalisation du VEGF ont été mesurés. Un essai phosphatase a aussi été effectué suite à l’immunoprécipitation de SHP-1 chez des BAECs stimulés au CGP42112A. Quatre semaines après la chirurgie, le flot sanguin dans le muscle ischémique des souris DM AT[indice inférieur 2]KO s’est rétabli plus rapidement (80%) comparativement à une récupération de 47% chez les souris DM contrôles. L’expression des facteurs pro-angiogéniques (HIF-1α et VEGF) était similaire dans tous les groupes après 2 semaines d’ischémie, mais diminuée chez les DM et retournait à un niveau basal chez les DM-AT[indice inférieur 2]KO après 4 semaines, suggérant un reperfusion plus rapide chez ces souris. La phosphorylation de Akt était aussi plus faible chez les souris DM contrôles mais était rétablie chez les souris AT[indice inférieur 2]KO après 4 semaines d’ischémie. L'expression de SHP-1 était doublée dans le muscle ischémique des souris DM, en comparaison aux souris non DM, un effet absent chez les souris DM AT[indice inférieur 2]KO. L’expression de SHP-2 et PTP1B ne variait pas chez les souris DM sauvages et AT[indice inférieur 2]KO. De plus, l’expression des récepteurs AT[indice inférieur 1] et AT[indice inférieur 2] est augmentée chez les souris DM sauvages en comparaison aux souris NDM. La stimulation du récepteur AT[indice inférieur 2] chez les BAECs a permis d’augmenter l’activité phosphatase de SHP-1. Nos résultats suggèrent que l’expression élevée d’AT[indice inférieur 2] chez les souris DM mène à la surexpression et/ou l’activation de SHP-1, inhibant le signal angiogénique issu du VEGF et empêchant la reperfusion sanguine suite à l’ischémie. / Abstract : Ischemia due to narrowing of femoral artery and distal vessels is a major cause of peripheral arterial disease and morbidity affecting patients with diabetes. We have previously reported that the inhibition of the angiogenic response to PDGF and VEGF in diabetic mice (DM) is associated with the increase expression of SHP-1, a protein that can be activated by the AT[subscript 2] receptor. It has been shown that the deletion of AT[subscript 2] receptor in mice promotes angiogenesis within the ischemic muscle, but its role in diabetic condition remains unknown. Our hypothesis is that AT[subscript 2] receptor induced SHP-1 which contributed to inhibition of pro-angiogenic factor actions in DM mice during ischemia. Non-DM and DM AT[subscript 2] null mice underwent femoral artery ligation. Blood perfusion was measured every week up to 4 weeks post-surgery. Expression of AT[subscript 1] and AT[subscript 2] receptors, SHP-1, SHP-2 and PTP1B, and VEGF pathway was evaluated. A phosphatase assay was executed to assess SHP-1 activity in bovine aortic endothelial cells (BAECs) following CGP42112A stimulation. Blood flow in the ischemic muscle of DM AT[subscript 2]KO mice recovered faster and up to 80% four weeks following the surgery, compared to a 47% recovery in DM mice. After four weeks, the expression of pro-angiogenic factors (HIF-1α and VEGF) was similar in each group after two weeks but diminished in the DM and remained at a basal state in the DM-AT[subscript 2]KO after four weeks suggesting a faster recovery process in these mice. Akt phosphorylation was also diminished in the DM mice but restored in DM AT[subscript 2]KO after four weeks of ischemia. SHP-1 expression was two times more elevated in DM compared to NDM mice, an effect that was not seen in AT[subscript 2]KO mice. SHP-2 and PTP1B expression did not varied in DM wildtype and AT[subscript 2]KO mice. Also, expression of AT[subscript 1] and AT[subscript 2] receptor was upregulated by diabetes in wildtype mice. Stimulation of AT[subscript 2] receptor in BAECs caused increased SHP-1 activity. Our results suggest that elevated expression of the AT[subscript 2] receptor in DM mice lead to up-regulation/activation of SHP-1, inhibiting the VEGF angiogenic signal causing diminished blood flow reperfusion following ischemia.

Cette étude a été conçue afin d’évaluer l’effet d’un pré-traitement à long terme au célécoxib sur la taille d’infarctus suite à un infarctus du myocarde. Sachant que le célécoxib est un anti-inflammatoire et que des dommages myocardiques peuvent découler des processus inflammatoires, l’inhibition de l’inflammation devrait hypothétiquement réduire la taille d’un éventuel infarctus. Pour ce faire, un traitement au célécoxib (3 mg/kg/jour i.p.) ou au véhicule (DMSO 50% ; EtOH 15% ; eau distillée) a été administré chroniquement pendant 28 jours à des rats mâles Sprague-Dawley (n=18 par groupe) par pompes osmotiques ALZET. Après avoir été anesthésiés, les animaux ont été sujets à l’occlusion de l’artère coronaire gauche descendante, suivie d’une période de reperfusion de 24 heures. Les résultats démontrent que la taille de l’infarctus des animaux traités au célécoxib est significativement réduite comparativement à celle du groupe témoin (37,5±2,5% versus 48,0±2,6% de la zone à risque, p < 0,05). Par la suite, l’accumulation de neutrophiles indique une hausse de ces leucocytes pour la zone ischémique, sans toutefois discriminer entre les groupes traité et non-traité, qui contenaient aussi les couches sub-endocardique et sous-épicardique. Cependant, aucune différence significative est notée entre les groupes traité et témoin au niveau de l’expression de la prostaglandine E2 plasmatique et du facteur de nécrose tumorale alpha. D’un autre côté, l’apoptose, déterminée par le ratio de Bax/Bcl2 et par un essai TUNEL est significativement réduite pour la couche sub-endocardique de la zone à risque des animaux traités au célécoxib. Enfin, l’agrégation plaquettaire, induite à l’adénosine diphosphate et analysée dans le sang complet, suggère que le célécoxib diminue l’agrégation plaquettaire. Cette étude indique alors qu’un pré-traitement au célécoxib peut réduire la taille d’infarctus par un mécanisme impliquant l’apoptose. / This study was designed to evaluate the effect of long-term pre-treatment with celecoxib, a cyclooxygenase-2 inhibitor, on myocardial infarct size. Since celecoxib is an anti-inflammatory and that myocardial damages can be present in the occurrence of inflammatory processes, inhibition of inflammation should hypothetically reduce the size of an eventual infarct. Celecoxib (3 mg/kg/day i.p.) or vehicle (DMSO 50%; EtOH 15%; distilled water) was administered chronically to male Sprague-Dawley rats (n=18 per group) through ALZET osmotic pumps for 28 days. Under anaesthesia, the animals were then subjected to left anterior descending coronary artery occlusion for 40 minutes, followed by 24-hour reperfusion. The results show that myocardial infarct size in celecoxib-treated rats was significantly reduced compared to the control group (37.5±2.5% versus 48.0±2.6% of the area at risk, p < 0.05). Accumulation of neutrophils, estimated by myeloperoxidase levels, indicated an increase in the ischemic area without any significant difference between groups. No significant difference was observed between the treated and vehicle groups in terms of plasma prostaglandin E2 and tumour necrosis factor-alpha. Apoptosis, evaluated by Bax/Bcl-2 and terminal dUTP nick-end labelled-positive cells, was significantly decreased in the subendocardial layer of the ischemic area in celecoxib-treated rats. Adenosine diphosphate-induced platelet aggregation in whole blood suggested that celecoxib diminished platelet aggregation. This study indicates that pre-treatment with celecoxib can reduce infarct size by a mechanism which may involve apoptosis.

Introduction : La prévention de la mort de cellules cardiaques contractiles suite à un épisode d'infarctus du myocarde représente le plus grand défi dans la récupération de la fonction cardiaque. On a démontré à maintes reprises que l'ocytocine (OT), l'hormone bien connue pour ses rôles dans le comportement social et reproductif et couramment utilisée dans l’induction de l’accouchement, diminue la taille de l'infarctus et améliore la récupération fonctionnelle du myocarde blessé. Les mécanismes de cette protection ne sont pas totalement compris. Objectif : Étudier les effets d'un traitement avec de l'ocytocine sur des cardiomyocytes isolés en utilisant un modèle in vitro qui simule les conditions d'un infarctus du myocarde. Méthodes : La lignée cellulaire myoblastique H9c2 a été utilisée comme modèle de cardiomyocyte. Pour simuler le dommage d'ischémie-reperfusion (IR), les cellules ont été placées dans un tampon ischémique et incubées dans une chambre anoxique pendant 2 heures. La reperfusion a été accomplie par la restauration du milieu de culture régulier dans des conditions normales d'oxygène. L'OT a été administrée en présence ou en absence d'inhibiteurs de kinases connues pour être impliquées dans la cardioprotection. La mortalité cellulaire a été évaluée par TUNEL et l'activité mitochondriale par la production de formazan pendant 1 à 4 heures de reperfusion. La microscopie confocale a servie pour localiser les structures cellulaires. Résultats : Le modèle expérimental de l'IR dans les cellules H9c2 a été caractérisé par une diminution dans la production de formazan (aux alentours de 50 à 70 % du groupe témoin, p < 0.001) et par l'augmentation du nombre de noyaux TUNEL-positif (11.7 ± 4.5% contre 1.3 ± 0.7% pour le contrôle). L'addition de l'OT (10-7 a 10-9 M) au commencement de la reperfusion a inversé les effets de l'IR jusqu'aux niveaux du contrôle (p < 0.001). L'effet protecteur de l'OT a été abrogé par : i) un antagoniste de l'OT ; ii) le knockdown de l'expression du récepteur à l'OT induit par le siRNA ; iii) la wortmannin, l'inhibiteur de phosphatidylinositol 3-kinases ; iv) KT5823, l'inhibiteur de la protéine kinase dépendante du cGMP (PKG); v) l'ODQ, un inhibiteur du guanylate cyclase (GC) soluble, et A71915, un antagoniste du GC membranaire. L'analyse confocale des cellules traitées avec OT a révélé la translocation du récepteur à l'OT et la forme phosphorylée de l'Akt (Thr 308, p-Akt) dans le noyau et dans les mitochondries. Conclusions : L'OT protège directement la viabilité des cardiomyocytes, lorsqu'elle est administrée au début de la reperfusion, par le déclenchement de la signalisation du PI3K, la phosphorylation de l'Akt et son trafic cellulaire. La cytoprotection médiée par l'OT implique la production de cGMP par les deux formes de GC. / Introduction: The prevention of the death of contractile cardiac cells following an episode of myocardial infarction represents the largest challenge in the recovery of myocardial function. Oxytocin, the hormone best known for its roles in reproduction and social behaviour and used commonly for the induction of parturition, has been repeatedly demonstrated to decrease the infarct size and to ameliorate the functional recovery of the injured myocardium. The mechanisms for this protection are incompletely understood. Objective: To study the effects of oxytocin treatment on isolated cardiomyocytes using an in vitro model simulating the conditions of a myocardial infarction. Methods: The cardiomyoblastic cell line H9c2 was used as a model of cardiomyocyte. For IR injury, the cells were placed in ischemic buffer and incubated in an anoxic chamber for 2 hours. Reperfusion was achieved by restoring cell media under normoxic conditions. OT was administered in the presence or absence of enzyme inhibitors. Cell death was evaluated by TUNEL and mitochondrial activity by formazan production during 1-4 hours of reperfusion. Confocal microscopy served for localization of cell structures. Results. The experimental model of IR in H9c2 cells was characterized by decreased formazan production (at the range of 50-70% of normoxic control, p < 0.001) and by the increased number of TUNEL-positive nuclei (11.7±4.5 vs. 1.3±0.7% in normoxic control). The addition of OT (10-7 to 10-9 M) at the onset of reperfusion reversed the effects of IR to the control levels (p < 0.001). The protective effect of OT was abrogated by: i) an OT antagonist, OTA and siRNA-mediated OT receptor knockout; ii) the phosphatidylinositol 3-kinases inhibitor wortmannin; iii) the cGMP-dependent protein kinase (PKG) inhibitor, KT5823. Soluble guanylate cyclase (GC) inhibitor ODQ and particulate GC antagonist A71915 only partially blocked the protective effects of OT. Confocal analysis of OT-treated cells revealed translocation of OT receptor and the phosphorylated form of Akt (Thr 308, p-Akt) into the nucleus and mitochondria. Conclusions: OT directly protects cardiomyocyte viability if administered at the onset of reperfusion by triggering signaling of Pi3K, Akt phosphorylation and its cellular trafficking. OT-mediated cytoprotection involves cGMP production by both forms of GC.

Insulin resistance and chronic hyperglycemia promote vascular damage, increase circulating levels of inflammatory cytokines and lead to increased morbidity and mortality. MicroRNAs (miRs) -103/107 have been shown to negatively regulate insulin sensitivity and glucose homeostasis. Based on complimentary binding profiles, the downstream target gene of miR-103/107 is caveolin-1 (Cav-1). We hypothesized that daily administration of the phosphodiesterase-5 inhibitor tadalafil (TAD) ± the curcumin analogue (HO-3867) will attenuate inflammation, improve metabolic parameters and reduce infarct size after ischemia/reperfusion injury (IRI). Furthermore, we propose that TAD therapy will reduce myocardial expression of miR-103/107 and increase mRNA and protein levels of its target gene, Cav-1. Leptin receptor null mice were randomized to receive daily injections of TAD (1mg/kg), HO-3867 (25mg/Kg), combination therapy, or control for 12weeks with weight and fasting glucose monitored weekly. Upon completion, cardiomyocytes were isolated from each group and were subjected to simulated ischemia and reoxygenation (SI/RO) for cell viability and reactive oxygen species (ROS) measurement. Another set were subjected to IRI in a Langendorff model. Plasma samples were taken to measure plasma concentrations of cytokines. For miR expression, total RNA was isolated from TAD and DMSO treated mice and was subjected to reverse transcription and real time PCR using miR assay probes to determine expression. TAD, HO-3867 and the combination of both attenuated fasting glucose levels, reduced myocardial infarct size after IRI and inflammatory cytokines when compared to control (p<0.05 for each vs. control). Cardiomyocytes isolated from each treatment groups and subjected to SI/RO demonstrated reduced necrosis as shown by trypan blue exclusion assay, ROS generation, and improved mitochondrial membrane potential as compared to DMSO (control). Likewise, both mRNA and protein expression of Cav-1 were reduced in diabetic hearts but were significantly increased in TAD treated diabetic mice, which may be a mechanism to improve insulin signaling through downregulation of miR-103/107 and upregulation of Cav-1. These studies suggest that TAD alone or in combination may be a unique strategy to improve metabolic parameters and precondition diabetic hearts against IRI.

Le récepteur éboueur CD36 facilite l’internalisation des acides gras libres non estérifiés (AGNE) au niveau des tissus cardiaque et périphériques. Lors d’une ischémie-reperfusion du myocarde (MI/R), les dommages produits sont en partie liés à l’internalisation des AGNE et à la production d’espèces réactives de l’oxygène, contrairement à ce qui est observé chez des souris déficientes en CD36 (CD36-/-). Nous avons émis l’hypothèse selon laquelle le CP-3(iv), un ligand synthétique du récepteur CD36, exercerait un effet cardioprotecteur en réduisant la taille de la zone myocardique infarcie lors d’une ischémie transitoire du myocarde. Nos objectifs étaient 1) de déterminer l’effet cardioprotecteur du CP-3(iv) et 2) de définir son mécanisme. Pour cela, des études in vivo et ex vivo ont été faites. Des souris de type sauvage ont été traitées avec le CP-3(iv) (289 nmol/kg) par voie sous-cutanée pendant 14 jours avant d’être soumises à 30 minutes d’ischémie suivant la ligature de l’artère coronaire gauche descendante et de sa reperfusion pendant une période de 6 ou 48 heures. De plus, des coeurs isolés de souris ont été perfusés 30 minutes, suivi de 40 minutes à faible débit (10%) et de 30 minutes de reperfusion pendant laquelle le coeur est perfusé avec le CP-3(iv) à une concentration de 10-6 M. Nos travaux ont montré que l’effet cardioprotecteur d’un traitement préventif par le CP-3(iv) permet de diminuer la taille de l’infarctus et préserve l’hémodynamie cardiaque de façon dépendante du CD36 puisque cet effet est non visible chez les souris CD36-/-. De plus, le CP-3(iv) exerce non seulement un effet systémique, mais aussi un effet cardioprotecteur direct sur le coeur isolé. / The scavenger receptor CD36 facilitates the internalization of non-esterified fatty acids (NEFA) on cardiac and peripheral tissues. During myocardial ischemia and reperfusion (MI/R), the damage induced is in part related to the internalization of NEFA and the production of reactive oxygen species, in opposition to what is observed in CD36-deficient mice (CD36-/-). We hypothesized that CP-3(iv), a synthetic ligand of the CD36 receptor, provides a cardioprotective effect by reducing the infarct area during a transient myocardial ischemia. Our objectives were 1) to determine the cardioprotective effect of CP-3(iv) and 2) to define its mechanism. For this, in vivo and ex vivo studies have been done. Wild-type mice were treated with CP-3(iv) (289 nmol/kg) subcutaneously during 14 days before being submitted to 30 minutes of ischemia following left anterior descending coronary artery ligature and reperfusion for a period of 6 to 48 hours. In addition, isolated mouse hearts were perfused 30 minutes, followed by 40 minutes with low flow (10%) and 30 minutes of reperfusion during which the heart is perfused with CP-3(iv) at a concentration of 10-6 M. Our work has shown that the cardioprotective effect of preventive treatment with CP-3(iv) reduces the infarct size and preserves cardiac hemodynamics in a CD36-dependent manner because this effect is not visible in CD36-/- mice. In addition, CP-3(iv) not only exerts a systemic effect, but also a direct cardioprotective effect on the isolated heart.

Title of work: Model of cerebral focal cortical ischemia and its parametrization Work objectives: The aim of this diploma thesis was to apply modified model of focal cortical brain ischemia induced by phototrombosis and subsequently determinate its parameters. Methods: Intravenous application of photosensitive Rose Bengal dye was followed by continual illumination of green laser beam over the left sensorimotocortex for 10 minutes. Following illumination, the dye is activated and produces singlet oxygen that damages components of endothelial cell membranes, with subsequent platelet aggregation and thrombin formation, which eventually determines the interruption of local blood flow. This approach, initially proposed by Rosenblum and El-Sabban in 1977, was later improved by Watson in 1985 in rat brain. For histological evaluation of ischemic brain damage, animals were overdosed with urethane and transcardially perfused. Results: Histological examination of brains showed significant ischemic damage in all experimental animals. Lesion was located in left hemisphere and penetrated thought the grey matter in various extents. Size of lesion, its localization and depth has shown only a small variability in the individual groups. Noticeable differences were found right after comparing experimental groups....

L'ischémie se caractérise par l'obstruction d'une artère coronaire qui prive le tissu d'un apport en oxygène et nutriments. Bien que nécessaire, la reperfusion, c'est-à-dire la réouverture de l'artère, s'accompagne de lésions tissulaires, appelées lésions de reperfusion. Au cours de l'I/R, le TNF-α, cytokine pro-inflammatoire, augmente. Sa liaison sur son récepteur TNFR1 induit le recrutement des protéines FADD et procaspase-8 formant le complexe DISC qui permet l'activation de la caspase-8. La caspase-8 clive une protéine pro-apoptotique, Bid, qui induit une perméabilisation de la membrane mitochondriale entrainant une production excessive de radicaux libres et une libération de cytochrome c. Cette dernière associée à Apaf-1 et procaspase-9 sert de plateforme d'activation à la caspase-9, qui, une fois activée, clive et active la caspase-3. La caspase-2 est une caspase initiatrice, tout comme la caspase-8. Pourtant, son rôle dans l'I/R cardiaque est peu connu. La production de ROS via la voie TNF-α/caspase-8 provoque des dommages à l'ADN. Ceci entraine l'activation de PARP-1, une enzyme impliquée dans la réparation de l'ADN. En fonctionnant, PARP-1 produit de l'ADP-ribose qui peut se fixer sur le canal TRPM2 et ainsi l'activer. L'ouverture de ce canal cationique provoque une entrée de Ca2+ qui contribue à la mort cellulaire et aux lésions de reperfusion. L'objectif de ce travail est de déterminer les mécanismes de mort cellulaire faisant intervenir la caspase-8, la caspase-2 et TRPM2 et d'évaluer les effets d'une inhibition de ces protéines sur les lésions de reperfusion. Un modèle de rat I/R met en évidence une augmentation de TNF-α après seulement 1h de reperfusion suivie d'une activation de la caspase-8. Cette activation entraine une production de ROS qui altère la structure et la fonction du canal RyR2, favorisant la fuite de Ca2+ du reticulum sarcoplasmique vers le cytosol. La caspase-2, exprimée dans le ventricule gauche, est activée avant la caspase-8 et induit une voie apoptotique de type intrinsèque. L'inhibition de la caspase-8 ou de la caspase-2 diminue les lésions de reperfusion. Parallèlement, le TNF-α induit un courant de type TRPM2 via l'activation de la caspase-8 et la production de ROS. In vivo, l'inhibition de TRPM2 par le clotrimazole diminue les lésions de reperfusion chez un modèle de souris I/R. La caspase-8, la caspase-2 et TRPM2 contribuent aux lésions de reperfusion et apparaissent comme de bonnes cibles dans la cardioprotection. / Myocardial ischemia and reperfusion (I/R) lead to repefusion injury. TNF-α, a pro-inflammatory cytokine, increases during reperfusion and contributes to this injury. The binding TNF/TNFR1 leads to the recruitment of FADD, TRADD and procaspase-8 and form a complexe named DISC. This complexe activates caspase-8, which cleaves Bid, a pro-apoptotic member of Bcl-2 family. tBid disrupts the mitochondrial membrane and induces a ROS production and a release of cytochome c, localized in intermembrane space. In cytosol, a complexe named apoptosome is formed with cytochrome c, Apaf-1 and procaspase-9 to activate caspase-9, which cleaves and activates caspase-3. Like caspase-8, caspase-2 is an initiator caspase. But little data exists on the role of this caspase in myocardial I/R.The disruption of mitochondria induces a ROS production which causes DNA damage. The enzyme PARP-1, involved in DNA repair, is then activated. By operating, PARP-1 produces ADP-ribose which can bind on TRPM2, a non selective cationic channel of TRP family. The opening of TRPM2 causes an increase of cytosolic calcium promoting cell death and reperfusion injury. The goal of this study was to determine the mechanisms of cell death after I/R involving caspase-8, caspase-2 and TRPM2 and to test an inhibitor of each protein on reperfusion injury. With a model of rat I/R, we demonstrated that TNF-α increases after only 1h of reperfusion following by a caspase-8 activation and a ROS production. Oxidative stress causes a modification of RyR2 with a leak of calcium in cytosol. Caspase-2, also expressed in ventricles, is activated before caspase-8 and induces an intrinsic apoptotic pathway until caspase-3 activation. An inhibition of caspase-8 or caspase-2 decreases the reperfusion injury.In mouse cardiomyocytes, TNF-α induces a TRPM2-like current through caspase-8 activation and ROS production. TRPM2 inhibition by clotrimazole decreases cell death and reperfusion injury in vivo.In conclusion, caspase-2, caspase-8 and TRPM2 play an important role in cell death pathway ans should be good therapeutical tools.