Thesis (Ph.D.)--University of Alabama at Birmingham, 2008. / Title from first page of PDF file (viewed on June 8, 2009). Includes bibliographical references.

Prolactin (PRL) and its receptor (PRLr) have been implicated in the development and progression of human breast cancer. PRL activates its receptor and induces activation of proximal Janus kinase 2 (Jak2) for signal transduction. Here, we sought to determine the role of PRLr-associated peptidyl-prolyl isomerase, cyclophilin A (CypA), in modulating structure/function relationships of the PRLr. It was demonstrated that CypA mediated PRL-induced conformational change of the CFP- and -YFP tagged forms of the PRLr cytoplasmic-tail, whereas CypA inhibition by NIM811 (N-methyl-4-isoleucine cyclosporin) or knockdown blocked the conformational change of the PRLr assessed by Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) signal or efficiency. To further investigate the consequences of CypA inhibition or knockdown on the PRLr/Jak2 complex mediated signaling/functions, analyses of phospho-tyrosine residues that are believed to be important for interactions/signaling were investigated. It was found that NIM811 inhibition or CypA shRNA knockdown significantly reduced prolactin-stimulated phosphorylation of PRLr/Jak2 intermediates and their association with the PRLr in breast cancer cells. A microarray analysis revealed that NIM811 inhibited approximately 66% of the top 50 PRL-induced genes. NIM811 inhibited breast cancer cell proliferation, survival, migration and anchorage-independent growth. Subsequent NIM811 treatment of a triple negative breast cancer xenograft inhibited primary tumor growth, outgrowth of macro-metastasis and induced central tumor necrosis. Furthermore, loss of CypA in the MMTV-PyMT mouse model demonstrated inhibition of tumorigenesis with significant reduction in lung and lymph node metastasis. Overall, CypA modulates PRL-induced conformational change of the C-terminus of the PRLr through its isomerase activity, altering PRLr/Jak2 complex signaling/functions in breast/mammary tumorigenesis and metastasis.

Orientador: Carlos Amilcar Parada / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T09:59:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_AndreSchwambach_D.pdf: 871138 bytes, checksum: fc1ecaa5a27015a5ae9ed72d9687b540 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A hiperalgesia inflamatória resulta da sensibilização de nociceptores aferentes periféricos induzida por mediadores inflamatórios. A prostaglandina E2 (PGE2) é uma das principais moléculas sinalizadoras envolvidas na hiperalgesia, sendo capaz de agir diretamente em nociceptores, induzindo mudanças nas propriedades de transdução sensorial destas células. A Janus Quinase 2 (JAK2) é uma molécula sinalizadora intracelular geralmente associada ao mecanismo de ação de citocinas, sendo que sua atividade pode ser induzida em nociceptores após uma inflamação periférica. Entretanto, não existem evidencias do envolvimento direto da JAK2 na sensibilização de nociceptores mediada pela PGE2. Assim o objetivo deste trabalho foi de explorar o possível papel da JAK2 na sensibilização mediada pela PGE2. Em neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) em cultura foi observado que a PGE2 altera o influxo de cálcio induzido pela capsaicina, e a pré-incubação das células com o inibidor seletivo da JAK2, AG490, foi capaz de bloquear este efeito. Adicionalmente, a administração intratecal de AG490 em ratos reduziu a hiperalgesia induzida pela administração subcutânea e local de PGE2 ou carragenina. A administração intratecal de AG490 também bloqueou a ativação da PKCepsilon induzida no DRG L5 ispsilateral após inflamação na pata. Em conclusão o presente trabalho demonstra que a JAK2 expressa no DRG pode possuir um papel na sensibilização de nociceptores induzida por um evento inflamatório periférico. Desta forma a inibição da JAK2 pode ser um novo alvo farmacológico para o controle da hiperalgesia inflamatória / Abstract: Inflammatory hyperalgesia results from the sensitization of peripheral afferent nociceptors by inflammatory mediators. Prostaglandin E2 (PGE2) is one of the major signaling molecules involved in hyperalgesia, being able to act directly on nociceptors, inducing sensitization. The Janus Kinase 2 (JAK2) is an intracellular signaling molecule generally associated with cytokines signaling pathway, and its activity can be increased in nociceptors after peripheral inflammation. However, there are no evidences about the role JAK2 directly plays in PGE2-induced sensitization of nociceptors. Therefore, the aim of the present study was to explore a possible role for JAK2 in PGE2 mediated sensitization. The data of this study showed in cultured dorsal root ganglion (DRG) neurons, that the administration of PGE2 alters capsaicin-induced calcium transients, and the pre-incubation of the cells with the JAK2 selective inhibitor AG490 blocks this effect. In addition, the intrathecal administration of AG490 in rats reduces the hyperalgesia induced by local administration of PGE2 or carrageenan in the hindpaw. AG490 intrathecal administration also blocks PKCepsilon activation in the ipsilateral L5 DRG induced by inflammation of peripheral tissue. In conclusion, the present study indicates that the JAK2 expressed in the DRG may have a role in the sensitization of nociceptors by a peripheral inflammatory event. Moreover, the inhibition of JAK2 may be a possible novel pharmacological target for the control of the inflammatory hyperalgesia / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) Filadelfia negativo como a policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) são desordens clonais da célula tronco hematopoiética caracterizadas pela produção excessiva de células mielóides diferenciadas. Este fenômeno ocorre devido à uma mutação somática (JAK2V617F) que ativa a via JAK-STAT de transdução de forma constitutiva. Esta mutação é mais frequente na PV, ocorrendo em 95% dos casos, e em 50% dos casos de TE e MFP. Outro defeito genético que ocorre é a mutação no receptor de trombopoetina, MPL. As mutações em MPL podem ser germinativas ou somáticas e menos de 10% dos pacientes com TE e MFP apresentam essa alteração genética. Entretanto, grande parte dos pacientes com TE e MFP que não apresentam mutação em JAK2V617F ou MPL podem apresentar mutações somáticas no gene CALR. Em adição às mutações somáticas que causam mieloproliferação, outras alterações genéticas em genes que funcionam como reguladores epigenéticos são encontrados nas NMPs nos genes TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1. Objetivo: Estabelecer um perfil genético em pacientes com NMP através da avaliação de mutações nos genes JAK2, CALR, MPL, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1 assim como estabelecer uma correlação laboratorial destas na PV, TE e MFP. Casuística e Métodos: Foram utilizadas amostras de sangue periférico de 104 pacientes que foram enviadas para o Laboratório de Biologia Tumoral do Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para avaliação diagnóstica. Quinze dos 104 pacientes são de pacientes com PV (14,4%), 20/104 (19,2%) com MFP, 20/104 (19,2%) com TE e 49/104 (47,1%) com outras doenças hemtológicas. Foi feita a avaliação da prevalência de mutações somáticas, seja por sequenciamento ou análise de fragmentos, nos genes JAK2 (exon 12 e Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 e ASXL1. PCR-RFLP foi realizada para identificação de mutações em JAK2V617F. Resultados: A mutação JAK2V617F foi observada em 30 (28,8%) pacientes (12 PV, 11 TE e 7 MFP), a mutação JAK2 exon 12 foi observada em apenas um (0,96%) paciente com PV, mutação JAK2Y931C em 4 (3,8%) pacientes (1 PV, 2 TE e 1 MFP) e 8 (7,7%) pacientes apresentaram mutações em CALR (3 TE e 5 MFP). Mutações nos genes epigenéticos como IDH1 foram observadas em 9 (8,7%) pacientes (2 TE, 2 MFP, 1 SMD, e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em IDH2 estão presentes em 5 (4,8%) pacientes (2 TE, 1 SMD/leucemia e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em ASXL1 foram identificadas em 13 (12,5%) pacientes (1 PV, 3 TE, 2 MFP, 3 SMD/leucemias e 4 com suspeita de NMP) e finalmente, mutações em TET2 foram encontradas em 33 (31,7%) pacientes (3 PV, 5 TE, 4 MFP, 8 SMD/leucemias e 13 pacientes com suspeita de NMP). Além disso, no caso da PV, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores aumentados de plaquetas (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem a mutação (mediana de 2,06 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,031). Pacientes do mesmo grupo que apresentam mutações em TET2 apresentam, opostamente aos com mutações em JAK2V617F, menores valores de plaquetas (mediana de 1,75 x105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem mutações no gene TET2 (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,048). No caso da MFP, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores maiores de leucócitos (mediana de 1,09 x104/mm3 leucócitos) do que os pacientes que não apresentam a mutação (mediana de 6,99 x103/mm3 leucócitos) com diferença estatística (p=0,046), já os pacientes que apresentam mutações no gene ASXL1 apresentam valores menores de hemácias (mediana de 2,43 x106/mm3 hemácias) em relação aos pacientes que não apresentam mutação (mediana de 3,71 x106/mm3 hemácias) com diferença estatística (p=0,042). Conclusão: O trabalho permitiu fornecer um perfil genético dos pacientes com NMP estudados. Além disso, é possível observar que algumas mutações epigenéticas podem influenciar em diferenças clínicas / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) Philadelphia (Ph) chromosome negative, such as polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) are clonal disorders of hematopoietic stem cell characterized by increased proliferation of differentiated myeloid cells. This phenomenon occurs due somatic mutation (JAK2V617F) that constitutively stimulates the JAK-STAT signaling pathway. This mutation is more frequent in PV, around 95%, and between 50% in ET and PMF. Other genetic aberration can be observed in the thrombopoietin (TPO) receptor MPL. Mutations in MPL can be in the germline line or somatic and less than 10% of patients with TE or PMF would harbor this genetic alteration. Otherwise, patients with TE or PMF without JAK2V617F or MPL mutation could present somatic mutations in calreticulin (CALR). In addition to somatic mutations that cause myeloproliferation, other genetic alterations that function as epigenetic regulators were identified in genes as TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1 in MPN. Objective: Establish genetic profile in patients with diagnosis of PV, ET, and PMF through genetic alterations in the following genes: JAK2, MPL, CALR, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1, and correlate those alterations with demographic characteristic of the study population. Casuistic and Methods: Peripheral blood samples from 104 patients referred to the Tumor Biology Laboratory of the Department of Hematology of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo for diagnostic investigation were analyzed. Fifteen out 104 samples were from PV patients (14.4%), 20/104 (19.2%) in PMF, 20/104 (19.2%) in ET and 49/104 (47.1%) with other hematologic diseases. Identification of somatic mutations was made, either by direct sequencing or fragment analysis in JAK2 (exon 12 and Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 and ASXL1. PCR-RFLP was performed to identify JAK2V617F mutation. Results: JAK2V617F mutation was observed in 30 (28.8%) patients (12 PV, 11 ET and 7 PMF), JAK2 exon 12 in only one (0.96%) patient with PV, JAK2Y931C in 4 (3.8%) patients (1 PV, 2 ET and 1 PMF), and 8 patients (7.7%) presented CALR mutation (3 ET and 5 PMF). Mutations in the epigenetic genes as IDH1 were observed in 9 (8.7%) patients (2 ET, 2 PMF, 1 MDS and 4 patients with suspected MPN), IDH2 mutations were present in 5 (4.8%) patients (2 ET, 1 MDS/leukemia, and 4 patients with suspected MPN), ASLX1 mutations were identified in 13 (12.5%) patients (1 PV, 3 ET, 2 PMF, 3 MDS/leukemia and 4 with suspected MPN) and finally, TET2 mutations were present in 33 (31.7%) patients (3 PV, 5 ET, 4 PMF, 8 MDS/leukemia, and 13 with suspected MPN). In addition, patients with PV who harbor JAK2V617F have increased platelet counts (median 5.41 x 105/mm3 platelets) compared to those without the mutation (median 2.06 x 105/mm3 platelets, p=0.031). Patients in the same group with TET2 mutation, as opposed to those with JAK2V617F, presented low platelets counts (median of 1.75 x 105/mm3 platelets) compared to those without TET2 mutation (median 5.41 x 105/mm3 platelets, p=0.048). Presence of JAK2V617F in patients diagnosed with PMF have a greater number of leukocytes (median 1.09 x104/mm3 leukocytes) when compared to patients without the mutation (median 6.99 x 103/mm3 leukocytes, p=0.046). Patients with PMF who presented mutations in ASXL1 gene have a lower number of red blood cells (median of 2.43 x 106/mm3) compared to patients without mutations in the same gene (median 3.71 x 106/mm3, p=0.042). Conclusion: The present study allows us to provide a genetic profile of patients with MPN. Furthermore, it is possible to observe that some epigenetic mutations could influence in some clinical differences

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) Filadelfia negativo como a policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) são desordens clonais da célula tronco hematopoiética caracterizadas pela produção excessiva de células mielóides diferenciadas. Este fenômeno ocorre devido à uma mutação somática (JAK2V617F) que ativa a via JAK-STAT de transdução de forma constitutiva. Esta mutação é mais frequente na PV, ocorrendo em 95% dos casos, e em 50% dos casos de TE e MFP. Outro defeito genético que ocorre é a mutação no receptor de trombopoetina, MPL. As mutações em MPL podem ser germinativas ou somáticas e menos de 10% dos pacientes com TE e MFP apresentam essa alteração genética. Entretanto, grande parte dos pacientes com TE e MFP que não apresentam mutação em JAK2V617F ou MPL podem apresentar mutações somáticas no gene CALR. Em adição às mutações somáticas que causam mieloproliferação, outras alterações genéticas em genes que funcionam como reguladores epigenéticos são encontrados nas NMPs nos genes TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1. Objetivo: Estabelecer um perfil genético em pacientes com NMP através da avaliação de mutações nos genes JAK2, CALR, MPL, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1 assim como estabelecer uma correlação laboratorial destas na PV, TE e MFP. Casuística e Métodos: Foram utilizadas amostras de sangue periférico de 104 pacientes que foram enviadas para o Laboratório de Biologia Tumoral do Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para avaliação diagnóstica. Quinze dos 104 pacientes são de pacientes com PV (14,4%), 20/104 (19,2%) com MFP, 20/104 (19,2%) com TE e 49/104 (47,1%) com outras doenças hemtológicas. Foi feita a avaliação da prevalência de mutações somáticas, seja por sequenciamento ou análise de fragmentos, nos genes JAK2 (exon 12 e Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 e ASXL1. PCR-RFLP foi realizada para identificação de mutações em JAK2V617F. Resultados: A mutação JAK2V617F foi observada em 30 (28,8%) pacientes (12 PV, 11 TE e 7 MFP), a mutação JAK2 exon 12 foi observada em apenas um (0,96%) paciente com PV, mutação JAK2Y931C em 4 (3,8%) pacientes (1 PV, 2 TE e 1 MFP) e 8 (7,7%) pacientes apresentaram mutações em CALR (3 TE e 5 MFP). Mutações nos genes epigenéticos como IDH1 foram observadas em 9 (8,7%) pacientes (2 TE, 2 MFP, 1 SMD, e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em IDH2 estão presentes em 5 (4,8%) pacientes (2 TE, 1 SMD/leucemia e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em ASXL1 foram identificadas em 13 (12,5%) pacientes (1 PV, 3 TE, 2 MFP, 3 SMD/leucemias e 4 com suspeita de NMP) e finalmente, mutações em TET2 foram encontradas em 33 (31,7%) pacientes (3 PV, 5 TE, 4 MFP, 8 SMD/leucemias e 13 pacientes com suspeita de NMP). Além disso, no caso da PV, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores aumentados de plaquetas (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem a mutação (mediana de 2,06 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,031). Pacientes do mesmo grupo que apresentam mutações em TET2 apresentam, opostamente aos com mutações em JAK2V617F, menores valores de plaquetas (mediana de 1,75 x105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem mutações no gene TET2 (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,048). No caso da MFP, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores maiores de leucócitos (mediana de 1,09 x104/mm3 leucócitos) do que os pacientes que não apresentam a mutação (mediana de 6,99 x103/mm3 leucócitos) com diferença estatística (p=0,046), já os pacientes que apresentam mutações no gene ASXL1 apresentam valores menores de hemácias (mediana de 2,43 x106/mm3 hemácias) em relação aos pacientes que não apresentam mutação (mediana de 3,71 x106/mm3 hemácias) com diferença estatística (p=0,042). Conclusão: O trabalho permitiu fornecer um perfil genético dos pacientes com NMP estudados. Além disso, é possível observar que algumas mutações epigenéticas podem influenciar em diferenças clínicas / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) Philadelphia (Ph) chromosome negative, such as polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) are clonal disorders of hematopoietic stem cell characterized by increased proliferation of differentiated myeloid cells. This phenomenon occurs due somatic mutation (JAK2V617F) that constitutively stimulates the JAK-STAT signaling pathway. This mutation is more frequent in PV, around 95%, and between 50% in ET and PMF. Other genetic aberration can be observed in the thrombopoietin (TPO) receptor MPL. Mutations in MPL can be in the germline line or somatic and less than 10% of patients with TE or PMF would harbor this genetic alteration. Otherwise, patients with TE or PMF without JAK2V617F or MPL mutation could present somatic mutations in calreticulin (CALR). In addition to somatic mutations that cause myeloproliferation, other genetic alterations that function as epigenetic regulators were identified in genes as TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1 in MPN. Objective: Establish genetic profile in patients with diagnosis of PV, ET, and PMF through genetic alterations in the following genes: JAK2, MPL, CALR, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1, and correlate those alterations with demographic characteristic of the study population. Casuistic and Methods: Peripheral blood samples from 104 patients referred to the Tumor Biology Laboratory of the Department of Hematology of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo for diagnostic investigation were analyzed. Fifteen out 104 samples were from PV patients (14.4%), 20/104 (19.2%) in PMF, 20/104 (19.2%) in ET and 49/104 (47.1%) with other hematologic diseases. Identification of somatic mutations was made, either by direct sequencing or fragment analysis in JAK2 (exon 12 and Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 and ASXL1. PCR-RFLP was performed to identify JAK2V617F mutation. Results: JAK2V617F mutation was observed in 30 (28.8%) patients (12 PV, 11 ET and 7 PMF), JAK2 exon 12 in only one (0.96%) patient with PV, JAK2Y931C in 4 (3.8%) patients (1 PV, 2 ET and 1 PMF), and 8 patients (7.7%) presented CALR mutation (3 ET and 5 PMF). Mutations in the epigenetic genes as IDH1 were observed in 9 (8.7%) patients (2 ET, 2 PMF, 1 MDS and 4 patients with suspected MPN), IDH2 mutations were present in 5 (4.8%) patients (2 ET, 1 MDS/leukemia, and 4 patients with suspected MPN), ASLX1 mutations were identified in 13 (12.5%) patients (1 PV, 3 ET, 2 PMF, 3 MDS/leukemia and 4 with suspected MPN) and finally, TET2 mutations were present in 33 (31.7%) patients (3 PV, 5 ET, 4 PMF, 8 MDS/leukemia, and 13 with suspected MPN). In addition, patients with PV who harbor JAK2V617F have increased platelet counts (median 5.41 x 105/mm3 platelets) compared to those without the mutation (median 2.06 x 105/mm3 platelets, p=0.031). Patients in the same group with TET2 mutation, as opposed to those with JAK2V617F, presented low platelets counts (median of 1.75 x 105/mm3 platelets) compared to those without TET2 mutation (median 5.41 x 105/mm3 platelets, p=0.048). Presence of JAK2V617F in patients diagnosed with PMF have a greater number of leukocytes (median 1.09 x104/mm3 leukocytes) when compared to patients without the mutation (median 6.99 x 103/mm3 leukocytes, p=0.046). Patients with PMF who presented mutations in ASXL1 gene have a lower number of red blood cells (median of 2.43 x 106/mm3) compared to patients without mutations in the same gene (median 3.71 x 106/mm3, p=0.042). Conclusion: The present study allows us to provide a genetic profile of patients with MPN. Furthermore, it is possible to observe that some epigenetic mutations could influence in some clinical differences