O estudo do processo de tradução no metabolismo celular atrai o interesse de vários grupos, em particular, o estudo do 21o aminoácido, a selenocisteína. A incorporação da selecisteína foi descrita em Escherichia coli e recentemente em eucariotos. O primeiro passo desta via é iniciado pela Seril-tRNA Sintetase que aminoacila o Ser-tRNASec (SelC) com uma serina. Em E. coli, o segundo passo é realizado pela Sec-sintetase (SelA) que remove o grupo hidroxil da cadeia lateral da serina, formando um intermediário aminoacrilil. Este serve como aceptor de seleno-fosfato gerando a selenocisteína. Em eucariotos, o processo análogo é realizado pela PSTK e pela SepSecS, que fosforila e seleniza a serina respectivamente. Interessados nesta parte da via, iniciamos estudos moleculares das enzimas Fosfoseril-tRNA Kinase de Trypanosoma brucei e Leishmania major e Seril-tRNA Sintetase de Trypanosoma brucei. Para o gene da enzima Fosfoseril-tRNA Kinase de T. brucei não foi possível obter um clone sem mutação. Já o gene da enzima Fosfoseril-tRNA Kinase de L. major foi clonado em vetor pET28 e a enzima foi expressa em células de E. coli porém com baixo rendimento impedindo a continuidade dos experimentos planejados. Portanto passou-se a investigar a enzima envolvida no primeiro passo da via, no caso, a Seril-tRNA Sintetase de T. brucei. Esta já se encontrava clonada e expressando em E. coli na fração solúvel. A proteína recombinante foi purificada com precipitação com 60% de sulfato de amônio e resinas de hidrofobicidade e de afinidade por níquel. Experimentos de gel nativo, DLS e fluorescência de anisotropia revelaram que, após a purificação, a enzima permanece estável e livre de agregações, possuindo um raio hidrodinâmico de 4,32nm e massa molecular de 110kDa. Acima de 150nM de proteína, ela encontra-se inteiramente na forma dimérica. Estabelecidos estes parâmetros, informações sobre a ligação com o Ser-tRNASec poderão ser obtidos a partir da técnica de anisotropia de fluorescência visto que experimentos iniciais realizados com a SerRS adicionando-se o Ser-tRNASec mostraram-se promissores. / The translation process study is central role in the cellular metabolism and attracts the interest of several groups, in particular, the study of the 21º amino acid, the selenocystein. The selenocystein incorporation pathway was described in Escherichia coli and recently in eukaryotes. The first step of this pathway is initiated by Seryl-tRNA Synthetase that aminoacilates the Ser-tRNASec (SELC) with serine. In E. coli, the second step is performed by the Sec-synthase (SELA) that removes hydroxyl group of the serine side chain, forming an aminoacrylil intermediary. This serves as an acceptor of seleno phosphate generating the selenocystein. In eukaryotes, the similar process is performed by PSTK and SepSecS, which phosphorylate serine and adds the selenium, respectively. Interested in this pathway, we performed initial molecular studies of the Phosphoseryl-tRNA synthetase of Trypanosoma brucei and Leishmania major and Seryl-tRNA synthetase of Trypanosoma brucei. The gene that encodes T. brucei Phosphoseryl-tRNA synthetase was obtained with several mutations. However, the gene encoding the T. brucei Phosphoseryl-tRNA synthetase was cloned into pET28 vector and the enzyme was expressed in E. coli cells, however at low amounts hampering the intended experiments. Therefore we initiated the investigation of the enzyme involved in the first step of this pathway, the Seryl-tRNA Synthetase from T. brucei. The enzyme was already cloned and expressing in the soluble fraction of E. coli. The recombinant protein was purified using 60% ammonium sulfate precipitation, hydrophobic and nickel affinity chromatography. Native gel experiments, DLS and anisotropy fluorescence was performed and allowed to conclude that, after purification, the enzyme remains stable and free of aggregation, with a hydrodynamic radius of 4.32 nm, molecular weight of 110kDa. Above 150nM protein its entirely in the dimeric form. Information about Ser-tRNASec binding can now be obtained from the technique of anisotropy seen that initial experiments with SerRS add Ser-tRNASec be shown to be promising.

Umas das principais formas biológicas de incorporação do selênio é na forma de um aminoácido denominado selenocisteína (Sec, U), que é incorporado co-traducionalmente ao polipeptídio nascente em posições específicas do códon UGA, que normalmente é reconhecido como códon de parada. A incorporação de selenocisteína em E. coli já está completamente esclarecida, com a participação dos genes que codifica para selenocisteína sintase (SELA), seril-tRNA sintetase (SerRS), um tRNASec específico (SELC), selenofosfato sintetase (SELD) e um fator de elongação próprio (SELB). Entretanto em eucariotos não há homólogos para SELA e existem evidências de haver a necessidade de dois passos enzimáticos que substituem a atividade desempenhada por SELA, com uma fosforilação da serina seguida de uma selenilação através das enzimas Fosfo-Seril-tRNASec Kinase (PSTK) e Sep-tRNA:Sec-tRNA sintase (SepSecS), respectivamente. A via de biossíntese e incorporação de selenocisteína é muito estudada em alguns organismos, mas ainda pouco explorada em Kinetoplastida. Nesse sentido, realizaram-se estudos moleculares das enzimas envolvidas nessa via, mais especificamente em Trypanosoma brucei e Leishmania major. Foram identificados o elemento SECIS na região 3´ do mRNA que atua no reconhecimento do códon UGA interno e, em fase de leitura na inserção de selenocisteína em Leishmania major e Leishmania infantum; a incorporação de Se75 em proteínas de Leishmania; a ocorrência do tRNASec em Trypanosoma e Leishmania e, adicionalmente todos os genes necessários para a síntese de selenocisteína: SELB, SELD, PSTK e SECp43. Foram obtidos clones dos genes selB e selD em vetor de expressão pET28a(+) e as proteínas foram expressas em bactérias Escherichia coli cepa BL21 (DE3). A proteína recombinante SELD foi purificada em cromatografia de afinidade e seu pI e massa molecular foram determinados usando as técnicas de sistema Phast de eletroforese e gel nativo. As proteínas SELB, SELD, SECp43 e Seril tRNA sintetase foram imunolocalizadas no citoplasma de células nativas de T. brucei. Uma nova metodologia \"PTP tagging\" foi utilizada para estudos de interação protéica com uso de proteínas alvos SECp43, SELB e PSTK na busca de novas proteínas ligantes na via de selenocisteínas em T. brucei. Futuras investigações moleculares e estruturais das enzimas envolvidas na via de selenocisteína em Kinetoplastida poderão trazer informações relevantes no entendimento da biossíntese desse aminoácido, assim como possibilitar o desenvolvimento de inibidores específicos visando o tratamento de doenças causadas pelos parasitas Trypanosoma brucei e Leishmania major. / One of the main biological forms of the selenium incorporation is the amino acid form named selenocysteine (Sec, U), which is incorporated co-translationally at the emerging new polypeptide in the specific positions at the UGA codon, that is usually recognized as stop codon. The incorporation of the selenocysteine in E.coli is already solved with the involvement of the genes that codify to selenocysteine synthase (SELA), seryl tRNA synthetase (SerRS), a specific tRNASec (SELC), selenophosphate synthetase (SELD) and a selenocysteine-specific translation elongation factor (SELB). However, in eukarya there is no SELA homologue, but there are evidences about the requirement of the two enzymatic steps that replace the activity performed by SELA, the fosforilation of the serine followed by selenocysteylation through the phosphoseryl-tRNASec kinase (PSTK) and Sep-tRNA:Sec-tRNA synthase (SepSecS) enzymes, respectively. Currently, the selenocysteine synthesis and its incorporation is more studied in many organisms, but less explored in Kinetoplastid. Subsequently, the molecular studies were done with the enzymes involved in this pathway, especially in Trypanosoma brucei and Leishmania major. The SECIS element was identified in the region 3´ of the mRNA, that acts in the recognition of the UGA codon positioned within a gene\'s open reading frame on the insertion of the selenocysteine in Leishmania major and Leishmania infantum; the incorporation of 75Se into Leishmania proteins, the occurrence of selenocysteine-tRNASec in both Leishmania and Trypanosoma; in addition, the finding of all genes necessary for selenocysteine synthesis, such as: SELB, SELD, PSTK, and SECp43. Clones were obtained from the selB and selD genes in the pET28a(+) expression vector and the enzymes were expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant SELD protein was purified by affinity chromatography and its pI and molecular mass were determined using: isoeletrophocusing electrophoresis and native gel. The proteins SELB, SELD, SECp43, and sery-tRNA synhetase were immune located in the cytoplasm in T. brucei native cells. A new methodology \"PTP tagging\" was utilized for protein interaction studies by using target proteins SECp43, SELB and PSTK to search new tagged proteins in selenocysteine T. brucei synthesis. Future molecular and structural investigation of the enzymes involved in Kinetoplastida selenocysteine biosynthesis will provide relevant information for understanding of the synthesis of this amino acid as well as the development of the specific inhibitors, focusing the treatment of the disease caused by Trypanosoma brucei e Leishmania major parasites.

Made available in DSpace on 2016-03-15T14:20:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 valdirene_lima_ioc_dout_2014.pdf: 15571540 bytes, checksum: e4633794a1c6f64eec517dd443edba9d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Tripanossomíase por Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) é uma antiga zoonose amplamente distribuída do Sul dos Estados Unidos ao Sul da Argentina. O Brasil dispõe de seis biomas ecologicamente distintos: Amazônia, Cerrado, Caatinga, Pantanal, Mata Atlântica e Pampa. A transmissão silvestre do T. cruzi ocorre ao longo desses biomas, envolvendo uma ampla variabilidade de hospedeiros e vetores. T. cruzi é subdividido em sete unidades discretas de tipagem (Discrete Typing Unit - DTU), TcI a TcVI e uma recentemente reconhecida, TcBat. O conhecimento sobre o padrão de distribuição geográfica dessas DTUs ainda é incompleto. TcI é o mais disperso ao longo de toda área de distribuição do parasita inclusive os biomas brasileiros. Analisamos a diversidade de TcI, originado de cinco biomas, exceto do Pampa, com a abordagem MLMT (Multilocus Microsatellite Typing). Foram caracterizados 107 isolados de TcI originados de 29 espécies de mamíferos silvestres e vetores usando vinte e sete loci nucleares de microssatélites e dez loci mitocondriais. Nós comparamos esses dados com isolados TcI de toda a América. A diversidade genética foi alta entre os isolados desse estudo além de se evidenciar um novo clado que se destacou de toda diversidade genética conhecida de TcI nas Américas Detectamos introgressão mitocondrial ocorrendo através do intercâmbio genético entre a Amazônia e a Caatinga. Observamos similaridades genéticas entre isolados da Mata Atlântica com isolados de todos os outros biomas analisados. A fragmentação da diversidade genética das populações TcI da Mata Atlântica pode estar refletindo o padrão de fragmentação desse bioma. Sugerimos que a diversidade do T. cruzi I possa servir como uma sentinela da conservação de ecossistemas. A segunda DTU mais isolada no meio silvestre no Brasil é TcII. O padrão de distribuição de TcII e DTUs híbridas TcV e TcVI na natureza e sua diversidade genética são umas das numerosas lacunas no conhecimento do T. cruzi, incluindo a suposta ausência dessas DTUs na Amazônia. Neste estudo analisamos a diversidade genética de 60 isolados TcII pela análise de 19 loci microssatélites nucleares. Alto grau de diversidade foi verificado nesse painel de isolados TcII em pequenas áreas da Mata atlântica e Caatinga e entre hospedeiros geneticamente homogêneos como os Leontopithecus spp. Diferentes graus de estruturação populacional foram observados nestes locais. A complexidade de estruturação e diversidade sugere que esse genótipo é mais disperso do que indica sua prevalência nos isolamentos em meio de cultura em uma variedade maior de hospedeiros A pesquisa da enzootia por T. cruzi no estado do Pará levou ao encontro dos genótipos TcII e híbrido (V ou VI) circulando entre triatomíneos e cães, respectivamente. Este achado mostrou que o TcII é presente na Amazônia e portanto nos cinco principais biomas brasileiros ao contrário da clássica distribuição dessa DTU descrita na litertura. A presença de Tc híbrido na Amazônia, é mais intrigante devido a enorme extensão geográfica em que essas DTUs não são descritas no Brasil, e pode sugerir a existência de diferentes estratégias de infecção que estejam prevenindo seu isolamento e subestimando sua real prevalência na natureza / The Trypanosomiasis by Trypanosoma cruzi ( Kinetoplastida , Trypanosomatidae ) is an ancient zoonosis widely distributed in the southern United States to southern Argentina. Brazil has six ecologically distinct biomes: Amazon, Cerrado, Caatinga, Pantanal, Atlantic Forest and Pampa. The sylvatic transmission of T. cruzi occurs along these biomes, involving a wide variability of hosts and vectors. T. cruzi is divided into seven discrete typing units (DTU), TcI the TcVI and a recently recognized, TcBat. The knowledge about the geographic distribution pattern of these DTUs is still not complete. TcI is more dispersed throughout the distribution area of parasite including Brazilian biomes. We analyze the diversity of TcI, originated five biomes except the Pampa, with MLMT approach (Multilocus Microsatellite Typing ). 107 isolates were characterized TcI originated from 29 species of wild mammals and vectors using twenty-seven nuclear microsatellite loci and ten mitochondrial loci. We compare these data with TcI isolates across Americas. Genetic diversity was high among the isolates in this study in addition to evidence of a new clade that stood out from all known TcI genetic diversity in the Americas. We detected mitochondrial introgression occurring through genetic exchange between the Amazon and the Caatinga. Observed genetic similarities among isolates of the Atlantic Forest with isolates of all other biomes analyzed. The fragmentation of genetic diversity of TcI the Atlantic populations may reflect the fragmentation pattern of this biome. We suggest that the diversity of T. cruzi I can serve as a sentinel ecosystem conservation. The second most isolated DTU in the wild environment in Brazil is TCII. The distribution pattern of TCII and hybrid DTUs TCV and TcVI in nature and their genetic diversity are some of the many gaps in the knowledge of T. cruzi, including the supposed absence of these DTUs on Amazon. This study analyzed the genetic diversity of 60 isolates TCII by analysis of 19 nuclear microsatellite loci. High degree of diversity was found in this panel TCII isolates in small areas of the Atlantic Forest and Caatinga and among genetically homogeneous hosts as Leontopithecus spp. Different degrees of population structure were observed at these sites. The complexity and diversity of structure suggests that this genotype is more dispersed than indicating its prevalence in isolates in culture medium in a greater variety of research hospedeiros.A enzootic T. cruzi in the state of Pará led to the meeting of TCII genotypes and hybrid (V or VI ) circulating among triatomine bugs and dogs , respectively. This finding showed that TCII is present in the Amazon and therefore the five major Brazilian unlike the classical distribution described in this DTU litertura biome. The presence of Tc hybrid in the Amazon , is more intriguing because of the enormous geographic extent to which these DTUs are not described in Brazil , and may suggest the existence of different infection strategies that are preventing their isolation and underestimating their actual prevalence in nature. Alternative ways to investigate genotypes in biological samples can clear up on its distribution.

Umas das principais formas biológicas de incorporação do selênio é na forma de um aminoácido denominado selenocisteína (Sec, U), que é incorporado co-traducionalmente ao polipeptídio nascente em posições específicas do códon UGA, que normalmente é reconhecido como códon de parada. A incorporação de selenocisteína em E. coli já está completamente esclarecida, com a participação dos genes que codifica para selenocisteína sintase (SELA), seril-tRNA sintetase (SerRS), um tRNASec específico (SELC), selenofosfato sintetase (SELD) e um fator de elongação próprio (SELB). Entretanto em eucariotos não há homólogos para SELA e existem evidências de haver a necessidade de dois passos enzimáticos que substituem a atividade desempenhada por SELA, com uma fosforilação da serina seguida de uma selenilação através das enzimas Fosfo-Seril-tRNASec Kinase (PSTK) e Sep-tRNA:Sec-tRNA sintase (SepSecS), respectivamente. A via de biossíntese e incorporação de selenocisteína é muito estudada em alguns organismos, mas ainda pouco explorada em Kinetoplastida. Nesse sentido, realizaram-se estudos moleculares das enzimas envolvidas nessa via, mais especificamente em Trypanosoma brucei e Leishmania major. Foram identificados o elemento SECIS na região 3´ do mRNA que atua no reconhecimento do códon UGA interno e, em fase de leitura na inserção de selenocisteína em Leishmania major e Leishmania infantum; a incorporação de Se75 em proteínas de Leishmania; a ocorrência do tRNASec em Trypanosoma e Leishmania e, adicionalmente todos os genes necessários para a síntese de selenocisteína: SELB, SELD, PSTK e SECp43. Foram obtidos clones dos genes selB e selD em vetor de expressão pET28a(+) e as proteínas foram expressas em bactérias Escherichia coli cepa BL21 (DE3). A proteína recombinante SELD foi purificada em cromatografia de afinidade e seu pI e massa molecular foram determinados usando as técnicas de sistema Phast de eletroforese e gel nativo. As proteínas SELB, SELD, SECp43 e Seril tRNA sintetase foram imunolocalizadas no citoplasma de células nativas de T. brucei. Uma nova metodologia \"PTP tagging\" foi utilizada para estudos de interação protéica com uso de proteínas alvos SECp43, SELB e PSTK na busca de novas proteínas ligantes na via de selenocisteínas em T. brucei. Futuras investigações moleculares e estruturais das enzimas envolvidas na via de selenocisteína em Kinetoplastida poderão trazer informações relevantes no entendimento da biossíntese desse aminoácido, assim como possibilitar o desenvolvimento de inibidores específicos visando o tratamento de doenças causadas pelos parasitas Trypanosoma brucei e Leishmania major. / One of the main biological forms of the selenium incorporation is the amino acid form named selenocysteine (Sec, U), which is incorporated co-translationally at the emerging new polypeptide in the specific positions at the UGA codon, that is usually recognized as stop codon. The incorporation of the selenocysteine in E.coli is already solved with the involvement of the genes that codify to selenocysteine synthase (SELA), seryl tRNA synthetase (SerRS), a specific tRNASec (SELC), selenophosphate synthetase (SELD) and a selenocysteine-specific translation elongation factor (SELB). However, in eukarya there is no SELA homologue, but there are evidences about the requirement of the two enzymatic steps that replace the activity performed by SELA, the fosforilation of the serine followed by selenocysteylation through the phosphoseryl-tRNASec kinase (PSTK) and Sep-tRNA:Sec-tRNA synthase (SepSecS) enzymes, respectively. Currently, the selenocysteine synthesis and its incorporation is more studied in many organisms, but less explored in Kinetoplastid. Subsequently, the molecular studies were done with the enzymes involved in this pathway, especially in Trypanosoma brucei and Leishmania major. The SECIS element was identified in the region 3´ of the mRNA, that acts in the recognition of the UGA codon positioned within a gene\'s open reading frame on the insertion of the selenocysteine in Leishmania major and Leishmania infantum; the incorporation of 75Se into Leishmania proteins, the occurrence of selenocysteine-tRNASec in both Leishmania and Trypanosoma; in addition, the finding of all genes necessary for selenocysteine synthesis, such as: SELB, SELD, PSTK, and SECp43. Clones were obtained from the selB and selD genes in the pET28a(+) expression vector and the enzymes were expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant SELD protein was purified by affinity chromatography and its pI and molecular mass were determined using: isoeletrophocusing electrophoresis and native gel. The proteins SELB, SELD, SECp43, and sery-tRNA synhetase were immune located in the cytoplasm in T. brucei native cells. A new methodology \"PTP tagging\" was utilized for protein interaction studies by using target proteins SECp43, SELB and PSTK to search new tagged proteins in selenocysteine T. brucei synthesis. Future molecular and structural investigation of the enzymes involved in Kinetoplastida selenocysteine biosynthesis will provide relevant information for understanding of the synthesis of this amino acid as well as the development of the specific inhibitors, focusing the treatment of the disease caused by Trypanosoma brucei e Leishmania major parasites.

O estudo do processo de tradução no metabolismo celular atrai o interesse de vários grupos, em particular, o estudo do 21o aminoácido, a selenocisteína. A incorporação da selecisteína foi descrita em Escherichia coli e recentemente em eucariotos. O primeiro passo desta via é iniciado pela Seril-tRNA Sintetase que aminoacila o Ser-tRNASec (SelC) com uma serina. Em E. coli, o segundo passo é realizado pela Sec-sintetase (SelA) que remove o grupo hidroxil da cadeia lateral da serina, formando um intermediário aminoacrilil. Este serve como aceptor de seleno-fosfato gerando a selenocisteína. Em eucariotos, o processo análogo é realizado pela PSTK e pela SepSecS, que fosforila e seleniza a serina respectivamente. Interessados nesta parte da via, iniciamos estudos moleculares das enzimas Fosfoseril-tRNA Kinase de Trypanosoma brucei e Leishmania major e Seril-tRNA Sintetase de Trypanosoma brucei. Para o gene da enzima Fosfoseril-tRNA Kinase de T. brucei não foi possível obter um clone sem mutação. Já o gene da enzima Fosfoseril-tRNA Kinase de L. major foi clonado em vetor pET28 e a enzima foi expressa em células de E. coli porém com baixo rendimento impedindo a continuidade dos experimentos planejados. Portanto passou-se a investigar a enzima envolvida no primeiro passo da via, no caso, a Seril-tRNA Sintetase de T. brucei. Esta já se encontrava clonada e expressando em E. coli na fração solúvel. A proteína recombinante foi purificada com precipitação com 60% de sulfato de amônio e resinas de hidrofobicidade e de afinidade por níquel. Experimentos de gel nativo, DLS e fluorescência de anisotropia revelaram que, após a purificação, a enzima permanece estável e livre de agregações, possuindo um raio hidrodinâmico de 4,32nm e massa molecular de 110kDa. Acima de 150nM de proteína, ela encontra-se inteiramente na forma dimérica. Estabelecidos estes parâmetros, informações sobre a ligação com o Ser-tRNASec poderão ser obtidos a partir da técnica de anisotropia de fluorescência visto que experimentos iniciais realizados com a SerRS adicionando-se o Ser-tRNASec mostraram-se promissores. / The translation process study is central role in the cellular metabolism and attracts the interest of several groups, in particular, the study of the 21º amino acid, the selenocystein. The selenocystein incorporation pathway was described in Escherichia coli and recently in eukaryotes. The first step of this pathway is initiated by Seryl-tRNA Synthetase that aminoacilates the Ser-tRNASec (SELC) with serine. In E. coli, the second step is performed by the Sec-synthase (SELA) that removes hydroxyl group of the serine side chain, forming an aminoacrylil intermediary. This serves as an acceptor of seleno phosphate generating the selenocystein. In eukaryotes, the similar process is performed by PSTK and SepSecS, which phosphorylate serine and adds the selenium, respectively. Interested in this pathway, we performed initial molecular studies of the Phosphoseryl-tRNA synthetase of Trypanosoma brucei and Leishmania major and Seryl-tRNA synthetase of Trypanosoma brucei. The gene that encodes T. brucei Phosphoseryl-tRNA synthetase was obtained with several mutations. However, the gene encoding the T. brucei Phosphoseryl-tRNA synthetase was cloned into pET28 vector and the enzyme was expressed in E. coli cells, however at low amounts hampering the intended experiments. Therefore we initiated the investigation of the enzyme involved in the first step of this pathway, the Seryl-tRNA Synthetase from T. brucei. The enzyme was already cloned and expressing in the soluble fraction of E. coli. The recombinant protein was purified using 60% ammonium sulfate precipitation, hydrophobic and nickel affinity chromatography. Native gel experiments, DLS and anisotropy fluorescence was performed and allowed to conclude that, after purification, the enzyme remains stable and free of aggregation, with a hydrodynamic radius of 4.32 nm, molecular weight of 110kDa. Above 150nM protein its entirely in the dimeric form. Information about Ser-tRNASec binding can now be obtained from the technique of anisotropy seen that initial experiments with SerRS add Ser-tRNASec be shown to be promising.

The nuclear envelope serves as important mRNA surveillance system. In yeast and humans, several control mechanisms act in parallel to prevent nuclear export of unprocessed mRNAs. However, trypanosomes lack homologues to most of the proteins involved. In addition, gene expression in trypanosomes relies almost completely on post-transcriptional regulation as they transcribe mRNAs as long polycistrons, which are subsequently processed into individual mRNA molecules by trans-splicing. As trans-splicing is not error-free, unspliced mRNAs may be recognized and prevented from reaching the cytoplasm by a yet unknown mechanism. When trans-splicing is inhibited in trypanosomes, the formation of a novel RNA granule type at the cytoplasmic periphery of the nucleus, so called nuclear periphery granules (NPGs) was previously observed. To identify potential regulators of nuclear export control, changes in protein localization which occur when trans-splicing is inhibited, were globally analyzed during this work. For this, trypanosome nuclei were purified under conditions maintaining NPG attachment to the nucleus, in the absence and presence of trans-splicing. Mass spectrometry analyses identified 128 proteins which are specifically enriched in nuclear preparations of cells inhibited for trans-splicing. Amongst them are proteins, which change their localization to the nucleus or to the nuclear pores as well as many proteins that move into NPGs. Some of these proteins are promising candidates for nuclear export control proteins, as the changes in localization (to the nucleus or nuclear pores) were specific to the accumulation of unspliced mRNAs. The NPG proteome almost exclusively contains proteins involved in mRNA metabolism, mostly unique to trypanosomes, notably major translation initiation factors were absent. These data indicate that NPGs are RNP complexes which have started or completed nuclear export, but not yet entered translation. As a byproduct of these proteomic studies, a high-quality dataset of the yet unknown T. brucei nuclear proteome is provided, closing an important gap in knowledge to study trypanosome biology, in particular nuclear related processes. NPGs were characterized in more detail by microscopy. The granules are cytoplasmic and present in at least two different trypanosome life cycle stages. There are at least two distinct granule subsets, with differences in protein composition. A closer analysis of NPGs by electron microscopy revealed that the granules are electron dense structures, which are connected to nuclear pores by string-like structures. In order to approach the function of NPGs, on the one hand, the hypothesis that NPGs might be related to perinuclear germ granules of adult gonads of C. elegans was tested: we found no relation between the two granule types. On the other hand, initial single molecule mRNA FISH experiments performed in trypanosomes showed no accumulation of unspliced transcripts in NPGs, arguing against an involvement of the granules in mRNA quality control. / Die Kernhülle um den Zellkern dient als wichtiges mRNA-Überwachungssystem in Eukaryoten. Bei Hefen und Menschen wirken dabei beispielsweise mehrere Kontrollmechanismen parallel, um den Export von unverarbeiteten mRNAs aus dem Kern heraus zu verhindern. Trypanosomen fehlen jedoch Homologe zu den Meisten hierbei beteiligten Proteinen. Außerdem basiert Genexpression in Trypanosomen fast ausschließlich auf posttranskriptioneller Kontrolle, da die Parasiten mRNAs als lange Polycistrons transkribieren, die anschließend durch Transspleißen zu einzelnen mRNA-Molekülen verarbeitet werden. Da der Prozess des Transspleißen nicht fehlerfrei zu sein scheint, gibt es möglicherweise einen noch unbekannten Mechanismus, der nicht gespleißte mRNAs erkennt und diese daran hindert, das Zytoplasma zu erreichen. Unter Bedingungen, in denen Transspleißen in Trypanosomen blockiert ist, konnte eine neue Art von RNA-Granula an der zytoplasmatischen Peripherie des Zellkerns beobachtet werden, sogenannte Nuclear Periphery Granules (NPGs). Um potentielle Regulatoren einer Kontrolle des mRNA-Exports zu identifizieren, wurde während dieser Arbeit umfassend analysiert, inwieweit sich die Lokalisation von Proteinen ändert, wenn Transspleißen gehemmt wird. Zu diesem Zweck wurden Zellkerne von Trypanosomen unter Bedingungen aufgereinigt, bei denen die Bindung der NPGs an den Zellkern in Abwesenheit und Gegenwart von Transspleißen erhalten blieb. Mit Hilfe von massen-spektrometrischen Analysen konnten 128 Proteine identifiziert werden, die spezifisch in den Kernpräparaten von Zellen angereichert sind, in denen Transspleißen blockiert ist. Darunter befinden sich Proteine, die ihre Lokalisation in den Kern hinein oder zu den Kernporen hin verändern, sowie viele Proteine, die sich in NPGs bewegen. Einige dieser Proteine stellen vielversprechende Kandidaten für eine potenzielle Rolle in der Kernexportkontrolle dar, da die Veränderungen in der Lokalisation (zum Kern oder zu den Kernporen) spezifisch für die Akkumulation von nicht gespleißten mRNAs waren. Das hier erarbeitete NPG-Proteom enthält fast ausschließlich Proteine, die am mRNA-Metabolismus beteiligt sind und nur in Trypanosomen vorkommen. Insbesondere fehlen im NPG-Proteom wichtige Translationsinitiationsfaktoren. Die Daten zeigen, dass NPGs RNP-Komplexe sind, die den Export aus dem Zellkern bereits begonnen oder abgeschlossen haben, aber noch nicht mit dem Translationsprozess begonnen haben. Als Nebenprodukt dieser proteomischen Analyse, kann ein qualitativ hochwertiger Datensatz des noch unbekannten Kernproteoms von T. brucei bereitgestellt werden. Damit wird eine wichtige Wissenslücke bei der Forschung zur Trypanosomenbiologie, insbesondere zu nuklearen Prozessen geschlossen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden außerdem NPGs anhand mikroskopischer Untersuchungen detaillierter charakterisiert. Die Granula sind zytoplasmatisch und liegen in mindestens zwei verschiedenen Lebenszyklusstadien von Trypanosomen vor. Es gibt mindestens zwei Untergruppen der Granula mit Unterschieden in der Proteinzusammensetzung. Eine genauere elektronenmikroskopische Analyse ergab, dass es sich bei NPGs um elektronendichte Strukturen handelt, die durch fadenartige Strukturen mit den Kernporen verbunden sind. Um mehr über die potenzielle Funktion von NPGs herauszufinden, wurde zum einen die Hypothese untersucht, dass NPGs mit perinuklearen Keimgranula adulter Gonaden in C. elegans verwandt sind: Es konnte keine Beziehung zwischen den beiden Granulatypen gefunden werden. Zum anderen zeigten erste Experimente mittels Einzelmolekül-mRNA-FISH in Trypanosomen keine Akkumulation von ungespleißten Transkripten in NPGs, was gegen eine Beteiligung an mRNA-Qualitätskontrollmechanismen spricht.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2003. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 164-175).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2003. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 117-127).

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2007. / Title from first page of PDF file. Includes bibliographical references (p. 154-175).

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:06:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Erica Melonio.pdf: 1197526 bytes, checksum: 0b83e53619c884611a16cfed117d696f (MD5) Previous issue date: 2011-02-24 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The leishmaniasis are zoonotic disease that present two forms of involvement: the cutaneous and visceral forms. Both transmitted by the bite of sandfly (Diptera; Psychodidae). The disease is caused by infection with Leishmania (Kinetoplastid; Trypanossomatidae), a protozoan that has particular characteristics as single flagellum, sub cytoskeleton of microtubules and a relatively small kinetoplast DNA condensed be able to infect vertebrates and invertebrates. This study aimed to identify by PCR protozoa of the genus Leishmania present in samples of intestinal contents of sandflies captured in Santarém and Serra dos Carajás, Pará State. The sandflies captures with CDC light traps and Shannon were made by IEC in four areas of the Serra dos Carajás and one in Santarém, total of ten samples for PCR analysis, five samples from Santarém and five samples from Serra dos Carajás. After DNA extraction and PCR technique, the PCR product was loaded in 1,5% agarose gel in TBE buffer and bands were observed in UV transluminator. Four samples isolated from sandflies captured from Santarém, Psychodopygus hirsutus hirsutus, Psychodopygus welcomei/complexus, Psychodopygus davisi and Psychodopygus whitmani were characterized as Leishmania subgenus Viannia. One sample of Santarém isolated from sandfly Psychodopygus gomezi and five samples of Serra dos Carajás isolated from sandflies Psychodopygus hirsutus hirsutus, Lutzomyia brachypyga, Lutzomyia richardwardi, Lutzomyia umbratilis have not been characterized. The results of the Santarém region showed that sandflies which were infected by protozoa Leishmania subgenus Viannia had already been recorded in infection by this flagellate in previous studies. The Serra dos Carajás results evidenced that it was not possible to identify the parasites contained in the intestinal tube of the phlebotomine it was only possible to affirm that they are not parasites of the genus Leishmania. These data reinforce the importance of maintaining a program of entomological surveillance in sandflies in Santarém and Serra dos Carajás. Further studies will be needed for greater knowledge of the unidentified samples. / As leishmanioses são doenças zoonóticas que apresentam duas formas de acometimento: a tegumentar e a visceral. São transmitidas pela picada de flebotomíneo (Diptera; Psychodidae). O parasita causador da doença é a Leishmania (Kinetoplastida; Trypanossomatidae), um protozoário que apresenta características peculiares como único flagelo, um subcitoesqueleto de microtúbulos e um cinetoplasto relativamente pequeno com DNA condensado, capaz de infectar animais vertebrados e invertebrados. Esse estudo teve como objetivo a identificação por PCR dos protozoários do gênero Leishmania presentes em amostras de conteúdo intestinal de flebotomíneos capturados em Serra dos Carajás e Santarém, Pará. As capturas de flebotomíneos com armadilhas tipo CDC luminosas e Shannon foram feitas pelo IEC em quatro áreas de Serra dos Carajás e uma em Santarém totalizando dez amostras para análise por PCR, cinco amostras de Santarém e cinco amostras de Serra dos Carajás. Após extração do DNA e realização da técnica da PCR, o produto da PCR foi aplicado em gel de agarose a 1,5 % em tampão TBE e as bandas foram visualizadas em transluminador UV. Quatro amostras isoladas de flebotomíneos de Santarém, Psychodopygus hirsutus hirsutus, Psychodopygus welcomei/ complexus, Psychodopygus davisi e Psychodopygus whitmani foram caracterizados como Leishmania do subgênero Viannia.Uma amostra de Santarém isolada do flebotomíneo Psychodopygus gomezi e cinco amostras de Serra dos Carajás isoladas dos flebotomíneos Psychodopygus hirsutus hirsutus, Lutzomyia brachypyga, Lutzomyia richardwardi, Lutzomyia umbratilis não foram caracterizadas. Os resultados da região de Santarém demonstraram que os flebotomíneos que se encontravam infectados por protozoários do gênero Leishmania do subgênero Viannia já apresentavam registros de infecção por este flagelado em estudos anteriores. Já em Serra dos Carajás os resultados evidenciaram que não foi possível identificar os parasitos contidos no tubo intestinal do flebotomíneo, somente foi possível afirmar que não são parasitos do gênero Leishmania. Esses dados reforçam a relevância de se manter um programa de vigilância entomológica nos flebotomíneos em Santarém e Serra de Carajás. Serão necessários novos estudos complementares para maior conhecimento das amostras não identificadas.