Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-09-05T14:10:40Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 714830 bytes, checksum: cbf237096693f1256fdb439f0242464c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T14:10:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 714830 bytes, checksum: cbf237096693f1256fdb439f0242464c (MD5) Previous issue date: 2015-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O capim-elefante é uma gramínea de elevada produtividade, que apresenta grande potencial para ser utilizado como biomassa lignocelulósica para a produção de etanol de segunda geração. A levedura Kluyveromyces marxianus vem se destacando na produção de etanol celulósico em processos de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) por ser termotolerante, além de produzir outros metabólitos de interesse industrial. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estabelecer as condições ótimas de produção de etanol por Kluyveromyces marxianus CCT 7735 por meio do processo SSF. O capim- elefante foi pré-tratado com ácido diluído e com solução alcalina e, em seguida, o resíduo celulósico obtido foi submetido a uma pré-sacarificação durante 72 horas, seguido por 120 horas de SSF. Foram avaliados o efeito de cinco variáveis: temperatura, pH, agitação, concentrações de enzimas e de resíduo celulósico de capim-elefante (biomassa) durante 120 horas de SSF. Os resultados mostraram que a levedura termotolerante K. marxianus CCT 7735 produziu etanol nos tratamentos realizados a 45 °C, temperatura próxima à ótima para a atividade das enzimas celulolíticas. A concentração de biomassa, temperatura e concentração do complexo enzimático tiveram efeito significativo (p valor < 0,05) no processo. A maior concentração de etanol, 45,3 g/L foi obtida com base nas condições sugeridas pelo modelo estatístico proposto. Essas condições foram temperatura de 38 °C, 16% (p/v) de resíduo celulósico de capim- elefante, 22,5 FPU do complexo enzimático Celluclast ® 1.5L/g de resíduo celulósico, agitação de 50 rpm e valor de pH de 4,8. / The elephant grass is a grass high productivity that has great potential to be used as lignocellulosic biomass for second generation ethanol. The yeast Kluyveromyces marxianus has been outstanding in the production of cellulosic ethanol in simultaneous saccharification and fermentation process (SSF) to be thermotolerant, as well as producing other metabolites of industrial interest. In this context, the aim of this study was to establish the optimal conditions of ethanol production by Kluyveromyces marxianus CCT 7735 through the SSF process. The elephant grass was pretreated with dilute acid and alkaline solution, then, the obtained cellulosic residue was subjected to a pre-saccharification for 72 hours, followed by 120 hours of SSF. We evaluated the effect of five variables: temperature, pH, agitation, concentrations of enzymes and cellulosic residue of elephant grass (biomass) for 120 hours of SSF. The results showed that the thermotolerant yeast K. marxianus CCT 7735 produced ethanol in the treatments performed at 45 °C, the optimum temperature for the activity of cellulolytic enzymes. The biomass concentration, temperature and concentration of enzyme complex had a significant effect (p-value < 0.05) in the process. The highest concentration of ethanol, 45.3 g/L was obtained based on the conditions suggested by the statistical model proposed. These conditions were temperature 38 °C, 16% (w/v) cellulose residue elephant grass, 22.5 FPU enzyme complex Celluclast ® 1.5L/g cellulose residue, agitation of 50 rpm, and pH of 4.8.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-09-05T16:40:12Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5411841 bytes, checksum: 2b648d950b659d781e03951504351692 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T16:40:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5411841 bytes, checksum: 2b648d950b659d781e03951504351692 (MD5) Previous issue date: 2015-07-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O advento das tecnologias de sequenciamento de nova geração possibilitou avanços significativos no campo do conhecimento dos genomas dos organismos. Com a redução dos custos de sequenciamento e aumento na rapidez do processamento das amostras, o número de genomas sequenciados e disponíveis em bancos de dados cresceu exponencialmente. Paralelamente, ocorreu um aumento na propagação de erros associados à anotação das sequências, que gera um impacto negativo em pesquisas posteriores baseadas nestes dados. A revisão da anotação e a comparação entre as informações disponíveis em bancos de dados públicos com experimentos de validação oferece uma alternativa para a correção desses erros. Neste contexto, este trabalho realizou a re- anotação e padronização de 14 genomas de leveduras de interese biotecnológico e disponíveis em bancos de dados públicos. Para facilitar a análise, os genomas foram separados em dois grupos: o grupo 1 (11 linhagens de Saccharomyces cerevisiae) e o grupo 2 (3 espécies de Kluyveromyces). Após a re-anotação, os proteomas preditos foram submetidos ao algoritmo de agrupamento OrthoMCL, para identificação de grupos de ortólogos e parálogos. As sequências ortólogas desses organismos, juntamente com comparações por similaridade com o banco de dados NR e com o banco de domínios conservados CDD, possibilitou a criação de bancos de dados locais com uma grande riqueza de informações, como link de acesso para os resultados do BLAST . Análise dos dados dos genomas permitiu a comparação da família de proteínas álcool desidrogenase (ADH) dentro dos grupos. Na linhagem S. cerevisiae JAY 291 não foi possível identificar o gene ADH7. Adicionalmente, o grupo 2 não possui sequências similares ao ADH5. / The advent of new generation sequencing technologies has made capable substancial advances at genomes organism knowledge field. Lower sequencing costs along with faster sample processing, has grown a number of sequenced genomes and available databases exponentially. At the same time, associated annotation sequences errors became more common, causing a negative impact for upcoming researchs based on those databases. Review of annotation and comparison between available public databases with validation experiments offer an alternative solution for error repairs. In this context, this research performed a re-annotation and standarization of 14 yeast genomes of biotechnological interest and available on public database domain. In order to facilitate analysis, genomes were separated in two groups: group 1 (11 Saccharomyces cerevisiae strains) and group 2 (3 Kluyveromyces species). After their re- annotation, predicted proteomes were submitted to the clustering algorithm OrthoMCL for identification of orthologues and paralogues groups. The orthologues sequences of those organisms along with similarity comparisons with NR database and conserved domain database CDD, enabled the creation of local databases with an abundance of information, such as acess link to BLAST results. Genome data analysis made possible the comparison of alcohol dehydrogenase family (ADH) within the groups. The S. cerevisiae JAY 291 strain was not able to identify gene ADH7. Additionallly, group 2 does not have similarity sequences to ADH5.

Neste trabalho foram desenvolvidos, em escala laboratorial, processos para o aproveitamento do soro de queijo como meio de cultura para as leveduras Kluyveromyces marxianus CBS 712 e Kluyveromyces marxianus CBS 6556 , objetivando a produção de lactase. A primeira etapa dos experimentos foi realizada em incubadora rotatória para determinar-se as condições ideais de crescimento microbiano (pH, meio de cultura e temperatura). Os resultados desta etapa definem que o pH e a temperatura ideais de crescimento são 5,5 e 37oC, respectivamente. Quanto ao meio de cultura, definiu-se soro de queijo in natura (7% w/v) para a cepa CBS 6556 e soro suplementado com extrato de levedura (1% w/v) para a cepa CBS 712. A segunda etapa dos experimentos foi realizada em biorreator aerado, utilizando-se as condições de crescimento determinadas na etapa anterior, com o objetivo de determinar a melhor cepa produtora de lactase. Ambas linhagens produziram quantidades equivalentes da enzima, sendo então escolhida, para os testes posteriores de otimização do processo e caracterização enzimática parcial, a levedura Kluyveromyces marxianus CBS 6556, por utilizar um meio de cultura mais simples e barato. Testou-se, então, o crescimento em soro de queijo concentrado (21% w/v), que resultou em uma maior produtividade específica de lactase pela levedura, contudo apresentou, também, maior produção de etanol, tóxico à célula. A caracterização enzimática mostrou que a lactase produzida possui atividade enzimática máxima em torno de 37oC e que possui pouca estabilidade à temperatura ambiente (30oC) e ao armazenamento à 4oC. Durante o armazenamento nas temperaturas de -4oC e -18oC a enzima conservou sua estabilidade durante as nove semanas.

Este trabalho teve por objetivo estudar a produtividade do processo de produção de β-galactosidase de leveduras em biorreator utilizando soro de queijo como meio de cultura. Na primeira parte do estudo determinou-se a influência das velocidades de aeração e de agitação do biorreator na produção de β-galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus. As condições de agitação e aeração testadas foram: 500rpm e 3L/min (condição I); 600rpm e 6L/min (condição II) e 700rpm e 9L/min (condição III). Os resultados mostraram que esta levedura, considerada Crabtree negativa, produz etanol, cuja concentração é maior nas condições de menor aeração. A produção de β-galactosidase mostrou-se dependente das velocidades de aeração, sendo menor na condição de maior aeração, e sendo que a maior produtividade da enzima foi atingida na condição intermediária de oxigenação (condição II). Após, estudou-se diferentes estratégias de alimentação objetivando culturas de alta concentração celular de K. marxianus em cultivos batelada alimentada. Foram testados dois perfis de alimentação (linear e exponencial), três tempos de alimentação (20, 25 e 35 horas) e três diferentes concentrações do meio de alimentação (soro de queijo concentrado duas, três ou quatro vezes). Os resultados mostraram que os cultivos em regime de batelada alimentada não geraram altas concentrações de biomassa. Contudo, a inserção contínua de lactose no meio de cultura induziu uma alta atividade específica de β-galactosidase, aumentando, conseqüentemente, a atividade volumétrica e a produtividade do processo. A melhor estratégia de alimentação, linear crescente durante 25 horas com soro de queijo três vezes concentrado, resultou em uma produtividade β-galactosidase de 291U/(L.h), 50% maior que a produtividade da cultura em batelada. Paralelamente a este estudo, construiu-se uma cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae produtora de β-galactosidase. A levedura S. cerevisiae W303 foi transformada com os plasmídeos integrativos LAC4 e LAC12, que codificam β-galactosidase e lactose-permease de Kluyveromyces lactis. A cepa transformante BLR030 foi escolhida entre as outras devido ao seu crescimento e produção de β-galactosidase. Um meio de cultura composto por soro de queijo desproteinizado suplementado por extrato de levedura (1%) e peptona (3%) foi escolhido, entre os meios testados, para os experimentos em biorreator. Foram realizados cultivos em regime de batelada e batelada alimentada com alimentação linear crescente durante 25 (FB25), 35 (FB35) e 50 (FB50) horas. Os cultivos FB35 e FB50 apresentaram as maiores atividades específicas da enzima (em torno de 1.800U/g) e também a maior produtividade de β-galactosidase (180U/(L.h)).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-03-23Bitstream added on 2014-06-13T19:35:26Z : No. of bitstreams: 1 paula_fc_me_rcla.pdf: 631356 bytes, checksum: 37d2f07653025c4a4c953cfbd2fb8073 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O interesse pela inulinase iniciou-se com a descoberta de sua habilidade de hidrolisar inulina, um polimero vegetal, em fmtose praticamente pura. A frutose é considerada uma alternativa segura como adoçante em relação à sacarose, sendo largamente utilizada na indústria de alimentos. As inulinases são geralmente tennoestáveis e comercialmente viáveis para aplicações industriais. Entretanto, uma produção contínua de frutose requer a utilização de uma inulinase imobilizada. Neste trabalho, o caldo fermentado, isento de células, de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus foi imobilizado em vários suportes: carvão ativado, diatomito, casca de ovo, amberlite, sílica de porosidade controlada e gelatina. A mais alta taxa de imobilização foi obtida em gelatina (82,60%). Os métodos restantes avaliados não foram bem sucedidos, seja pela ausência de ligação protéica ou perda de atividade provocados pelo processo de imobilização. O pH ótimo da inulinase imobilizada foi o mesmo da enzima livre (3,5). As temperaturas ótimas foram 55 °C para a enzima livre e 60 °C para a inulinase imobilizada. O gráfico de Arrhenius apresentou-se linear e as energias de ativação foram 56,20 KJ/mol.°K (enzima livre) e 20,27 KJ/mol.°K (enzima imobilizada). Os parâmetros cinéticos foram calculados pelo gráfico de LineweaverBurk e os valores de Km e Vmax foram de 20,68 mg/mL e 37,73 UA/mg para a enzima livre; e 50,05 mg/mL e 31,64 UA!mg para a enzima imobilizada, respectivamente. A estabilidade operacional da inulinase imobilizada foi avaliada em reator tubular de leito fixo, durante 782 horas, apresentando 58,12% de atividade enzimática residual. Foi realizada uma cromatografia de camada delgada para uma análise qualitativa dos produtos da reação. / The interest for inulinase began when it was discovered its ability to hydrolyse inulin, a vegetal polymer, in fructose practically pure. Fructose is considered as a safe altemative sweetener to sucrose, widely used in food industries. The inulinases are usually thermostable and cornmercially available for industrial applications. However, a continuous production of fructose requires the use of an immobilized inulinase. In this work, the crude enzyme broth free celis from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus was imrnobilized on various supports: activated carbon, diatomite, hen egg shell, amberlite, porous silica and gelatin. The highest irnrnobilization yield was obtained in gelatin (82,60%). The remaining methods screened were not successful either because no protem binding occurred or irnmobilization process resulted in activity loss. The optimum pH of immobilized inulinase remained the sarne as that of free enzyme (3,5). The optimum temperatures were 55 °C for free enzyrne and 60 °C for the imrnobilized inulmase. The Arrhenius plot were linear and activation energies were 56,20 KJ/mol.°K (Free enzyme) and 20,27 KJ/rnol.°K (Immobilized enzyme). The kinetic parameters were calculated from Lineweaver-Burk plots and the values of Km and Vmax were 20,68 mg/mL and 37,73 UA/rng for free inulinase; and 50,05 rng/rnL and 31,64 UA/rng for immobilized enzyme, respectively. The operational stability of the immobilized inulinase was studied in continuous fixed bed colurnn reactor for 782 hours with 58,12% of residual activity. Thin layer chromatography was used for qualitative analysis of the reaction products.

Neste trabalho foram desenvolvidos, em escala laboratorial, processos para o aproveitamento do soro de queijo como meio de cultura para as leveduras Kluyveromyces marxianus CBS 712 e Kluyveromyces marxianus CBS 6556 , objetivando a produção de lactase. A primeira etapa dos experimentos foi realizada em incubadora rotatória para determinar-se as condições ideais de crescimento microbiano (pH, meio de cultura e temperatura). Os resultados desta etapa definem que o pH e a temperatura ideais de crescimento são 5,5 e 37oC, respectivamente. Quanto ao meio de cultura, definiu-se soro de queijo in natura (7% w/v) para a cepa CBS 6556 e soro suplementado com extrato de levedura (1% w/v) para a cepa CBS 712. A segunda etapa dos experimentos foi realizada em biorreator aerado, utilizando-se as condições de crescimento determinadas na etapa anterior, com o objetivo de determinar a melhor cepa produtora de lactase. Ambas linhagens produziram quantidades equivalentes da enzima, sendo então escolhida, para os testes posteriores de otimização do processo e caracterização enzimática parcial, a levedura Kluyveromyces marxianus CBS 6556, por utilizar um meio de cultura mais simples e barato. Testou-se, então, o crescimento em soro de queijo concentrado (21% w/v), que resultou em uma maior produtividade específica de lactase pela levedura, contudo apresentou, também, maior produção de etanol, tóxico à célula. A caracterização enzimática mostrou que a lactase produzida possui atividade enzimática máxima em torno de 37oC e que possui pouca estabilidade à temperatura ambiente (30oC) e ao armazenamento à 4oC. Durante o armazenamento nas temperaturas de -4oC e -18oC a enzima conservou sua estabilidade durante as nove semanas.

Este trabalho teve por objetivo estudar a produtividade do processo de produção de β-galactosidase de leveduras em biorreator utilizando soro de queijo como meio de cultura. Na primeira parte do estudo determinou-se a influência das velocidades de aeração e de agitação do biorreator na produção de β-galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus. As condições de agitação e aeração testadas foram: 500rpm e 3L/min (condição I); 600rpm e 6L/min (condição II) e 700rpm e 9L/min (condição III). Os resultados mostraram que esta levedura, considerada Crabtree negativa, produz etanol, cuja concentração é maior nas condições de menor aeração. A produção de β-galactosidase mostrou-se dependente das velocidades de aeração, sendo menor na condição de maior aeração, e sendo que a maior produtividade da enzima foi atingida na condição intermediária de oxigenação (condição II). Após, estudou-se diferentes estratégias de alimentação objetivando culturas de alta concentração celular de K. marxianus em cultivos batelada alimentada. Foram testados dois perfis de alimentação (linear e exponencial), três tempos de alimentação (20, 25 e 35 horas) e três diferentes concentrações do meio de alimentação (soro de queijo concentrado duas, três ou quatro vezes). Os resultados mostraram que os cultivos em regime de batelada alimentada não geraram altas concentrações de biomassa. Contudo, a inserção contínua de lactose no meio de cultura induziu uma alta atividade específica de β-galactosidase, aumentando, conseqüentemente, a atividade volumétrica e a produtividade do processo. A melhor estratégia de alimentação, linear crescente durante 25 horas com soro de queijo três vezes concentrado, resultou em uma produtividade β-galactosidase de 291U/(L.h), 50% maior que a produtividade da cultura em batelada. Paralelamente a este estudo, construiu-se uma cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae produtora de β-galactosidase. A levedura S. cerevisiae W303 foi transformada com os plasmídeos integrativos LAC4 e LAC12, que codificam β-galactosidase e lactose-permease de Kluyveromyces lactis. A cepa transformante BLR030 foi escolhida entre as outras devido ao seu crescimento e produção de β-galactosidase. Um meio de cultura composto por soro de queijo desproteinizado suplementado por extrato de levedura (1%) e peptona (3%) foi escolhido, entre os meios testados, para os experimentos em biorreator. Foram realizados cultivos em regime de batelada e batelada alimentada com alimentação linear crescente durante 25 (FB25), 35 (FB35) e 50 (FB50) horas. Os cultivos FB35 e FB50 apresentaram as maiores atividades específicas da enzima (em torno de 1.800U/g) e também a maior produtividade de β-galactosidase (180U/(L.h)).

The enzymatic hydrolysis of lactose by &#946;-galactosidase plays an important role in the processing of dairy products, such as the production of milk containing low concentrations of lactose, the prevention of crystallization in dairy products, and the use of galactosyltransferase for synthesizing galacto-oligosaccharides. In this context, this work aims to study how Kluyveromyces strains can be used to produce &#946;-galactosidase from an agro-industrial by-product such as whey. The species studied were K. marxianus (LAMI CE 025, CCA 510, ATCC 36907) and K. lactis(NRRL Y-1564 and Y-4087). This work also aims to investigate the immobilization of the enzyme onto chitosan and determine its properties such as the optimal operating pH and temperature, the thermal stability of the enzyme, the thermal desnaturation constant, the half-life and the kinetic parameters Km and Vmax using ONPG as substrate of the enzyme &#946;-galactosidase from Kluyveromyces lactis strain NRRL Y1564. K. marxianus LAMI CE 025 and CCA 510 did not consume lactose of the complex medium. The other strains were studied for &#946;-galactosidase production in whey. The maximum enzymatic activity of 3.7 U/mL was achieved by K. lactis NRRL Y-1564 after 12h of fermentation at 180 rpm and 30ÂC, being selected as a microorganism for &#946;-galactosidase production. The optimal pH for soluble &#946;-gal activity was found to be 6.5 while the optimal pH for immobilized &#946;-gal activity was found to be 7.0, while the optimal operating temperatures were 50ÂC and 37ÂC, respectively. The soluble and immobilized enzyme showed similar deactivation profiles at 40ÂC. For more than 200 min, both biocatalysts showed the same stability, retaining approximately 50 % of their initial activities. However, However, the immobilized enzyme showed an increased stability (8 times) at 50ÂC. In the lactose hydrolysis at 37ÂC and pH 7.0 by soluble enzyme was observed a conversion of 58.68% using a enzymatic charge of 2.0 U and 17.57% to 0.5 U. The immobilized enzyme was reused for 10 cycles, showing a good operational stability by retaining more than 74% of its initial activity. The immobilized enzyme retained 100% of its initial activity when it was stored at 4ÂC and pH 7.0 for a period of 93 days. The soluble &#946;-galactosidase lost 9.4% of its initial activity when it was stored at the same conditions. According to these results, an alternative culture medium prepared by using deproteinized whey supplemented with yeast extract was efficiently used for the production of &#946;-galactosidase through the cultivation of Kluyveromyces strains. Chitosan activated with glutaraldehyde is a suitable alternative low cost support for &#946;-galactosidase immobilization, providing the immobilized enzyme with higher thermal, operational and storage stabilities in comparison with the soluble enzyme. / A hidrÃlise enzimÃtica da lactose por &#946;-galactosidase desempenha importante papel no processamento de produtos lÃcteos, sendo uma das aplicaÃÃes à obtenÃÃo de leite com lactose reduzida para o consumo por indivÃduos com intolerÃncia à lactose, produÃÃo de cÃpsulas de enzimas para tratamento e a prevenÃÃo da cristalizaÃÃo em produtos lÃcteos. Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido visando a seleÃÃo de cepas de Kluyveromyces produtoras da enzima &#946;-galactosidase usando um resÃduo agroindustrial, o soro de leite como meio de cultivo. Inicialmente, realizou-se a seleÃÃo de espÃcies de Kluyveromyces capazes de produzir &#946;- galactosidase utilizando lactose como fonte de carbono, em meio complexo e posteriormente em soro de leite (50 g/L de lactose) desproteinado e suplementado com extrato de levedura (1 g/L). ApÃs definir a levedura que apresentava maior produÃÃo da enzima de interesse, estudou-se a produÃÃo e a viabilidade de imobilizÃ-la em quitosana. ApÃs, caracterizou-se a enzima solÃvel e imobilizada, consistindo na determinaÃÃo do pH e temperatura Ãtimos, estabilidade tÃrmica, estimativa dos parÃmetros termodinÃmicos e determinaÃÃo dos parÃmetros cinÃticos Km e VmÃx usando como substrato ONPG. As cepas de K. marxianus LAMI CE025 e CCA 510 nÃo consumiram lactose em meio complexo. As demais cepas foram avaliadas quanto à produÃÃo de &#946;-galactosidase em soro de leite. A atividade mÃxima de 3,7 U/mL foi obtida por K. lactis NRRL Y-1564 apÃs 12 h de cultivo a 180 rpm e 30ÂC, sendo selecionada como micro-organismo para a produÃÃo da &#946;-galactosidase. O pH Ãtimo para a enzima solÃvel e imobilizada foram 6,5 e 7,0, respectivamente, e temperatura Ãtima de 50 e 37ÂC para a &#946;-galactosidase solÃvel e imobilizada, respectivamente. A enzima solÃvel e imobilizada mostrou perfis semelhantes de desactivaÃÃo a 40  C. Durante mais de 200 min, ambos os biocatalisadores mostrou a mesma estabilidade, retendo cerca de 50% da sua actividade inicial. Entretanto, a 50ÂC, a enzima imobilizada mostrou uma maior estabilidade tÃrmica, sendo 8 vezes mais estÃvel. Os parÃmetros cinÃticos Km e VmÃx foram 3,34 mM e 1,78 mM/min para a &#946;-galactosidase solÃvel comparado com 3,68 mM e 3,38 mM.min para a enzima imobilizada. Na hidrÃlise de lactose utilizando a enzima solÃvel a 37ÂC e pH 7,0 foi verificada uma conversÃo de 30,77% da lactose para a carga de 2,0 U e 9,8% usando 0,5 U. ApÃs o 10 reciclo de uso, a enzima imobilizada reteve 74% da atividade inicial. A &#946;-galactosidase imobilizada, estocada em tampÃo fosfato de potÃssio pH 7,0 a 4ÂC manteve 100% de sua atividade enzimÃtica inicial no perÃodo de 93 dias. A &#946;-galactosidase solÃvel perdeu 9,4% de sua atividade inicial quando foi estocada nas mesmas condiÃÃes. De acordo com os resultados obtidos, o soro de leite mostrou-se uma fonte de carbono alternativa para produÃÃo de &#946;-galactosidase de K. lactis NRRL Y1564 e a quitosana ativada com glutaraldeÃdo à um suporte alternativo adequado de baixo custo para imobilizaÃÃo da &#946;-galactosidase, proporcionando a enzima imobilizada estabilidades tÃrmicas, operacional e de armazenamento comparado com a enzima solÃvel.

Neste trabalho foram desenvolvidos, em escala laboratorial, processos para o aproveitamento do soro de queijo como meio de cultura para as leveduras Kluyveromyces marxianus CBS 712 e Kluyveromyces marxianus CBS 6556 , objetivando a produção de lactase. A primeira etapa dos experimentos foi realizada em incubadora rotatória para determinar-se as condições ideais de crescimento microbiano (pH, meio de cultura e temperatura). Os resultados desta etapa definem que o pH e a temperatura ideais de crescimento são 5,5 e 37oC, respectivamente. Quanto ao meio de cultura, definiu-se soro de queijo in natura (7% w/v) para a cepa CBS 6556 e soro suplementado com extrato de levedura (1% w/v) para a cepa CBS 712. A segunda etapa dos experimentos foi realizada em biorreator aerado, utilizando-se as condições de crescimento determinadas na etapa anterior, com o objetivo de determinar a melhor cepa produtora de lactase. Ambas linhagens produziram quantidades equivalentes da enzima, sendo então escolhida, para os testes posteriores de otimização do processo e caracterização enzimática parcial, a levedura Kluyveromyces marxianus CBS 6556, por utilizar um meio de cultura mais simples e barato. Testou-se, então, o crescimento em soro de queijo concentrado (21% w/v), que resultou em uma maior produtividade específica de lactase pela levedura, contudo apresentou, também, maior produção de etanol, tóxico à célula. A caracterização enzimática mostrou que a lactase produzida possui atividade enzimática máxima em torno de 37oC e que possui pouca estabilidade à temperatura ambiente (30oC) e ao armazenamento à 4oC. Durante o armazenamento nas temperaturas de -4oC e -18oC a enzima conservou sua estabilidade durante as nove semanas.

Este trabalho teve por objetivo estudar a produtividade do processo de produção de β-galactosidase de leveduras em biorreator utilizando soro de queijo como meio de cultura. Na primeira parte do estudo determinou-se a influência das velocidades de aeração e de agitação do biorreator na produção de β-galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus. As condições de agitação e aeração testadas foram: 500rpm e 3L/min (condição I); 600rpm e 6L/min (condição II) e 700rpm e 9L/min (condição III). Os resultados mostraram que esta levedura, considerada Crabtree negativa, produz etanol, cuja concentração é maior nas condições de menor aeração. A produção de β-galactosidase mostrou-se dependente das velocidades de aeração, sendo menor na condição de maior aeração, e sendo que a maior produtividade da enzima foi atingida na condição intermediária de oxigenação (condição II). Após, estudou-se diferentes estratégias de alimentação objetivando culturas de alta concentração celular de K. marxianus em cultivos batelada alimentada. Foram testados dois perfis de alimentação (linear e exponencial), três tempos de alimentação (20, 25 e 35 horas) e três diferentes concentrações do meio de alimentação (soro de queijo concentrado duas, três ou quatro vezes). Os resultados mostraram que os cultivos em regime de batelada alimentada não geraram altas concentrações de biomassa. Contudo, a inserção contínua de lactose no meio de cultura induziu uma alta atividade específica de β-galactosidase, aumentando, conseqüentemente, a atividade volumétrica e a produtividade do processo. A melhor estratégia de alimentação, linear crescente durante 25 horas com soro de queijo três vezes concentrado, resultou em uma produtividade β-galactosidase de 291U/(L.h), 50% maior que a produtividade da cultura em batelada. Paralelamente a este estudo, construiu-se uma cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae produtora de β-galactosidase. A levedura S. cerevisiae W303 foi transformada com os plasmídeos integrativos LAC4 e LAC12, que codificam β-galactosidase e lactose-permease de Kluyveromyces lactis. A cepa transformante BLR030 foi escolhida entre as outras devido ao seu crescimento e produção de β-galactosidase. Um meio de cultura composto por soro de queijo desproteinizado suplementado por extrato de levedura (1%) e peptona (3%) foi escolhido, entre os meios testados, para os experimentos em biorreator. Foram realizados cultivos em regime de batelada e batelada alimentada com alimentação linear crescente durante 25 (FB25), 35 (FB35) e 50 (FB50) horas. Os cultivos FB35 e FB50 apresentaram as maiores atividades específicas da enzima (em torno de 1.800U/g) e também a maior produtividade de β-galactosidase (180U/(L.h)).