Made available in DSpace on 2017-07-10T19:25:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Danielle.pdf: 2045477 bytes, checksum: e87013d4e9e85c9f4d8686bbb3c0dd6e (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / The researches on second generation ethanol, produced by agroindustrial wastes, have demanded special attention as a possible solution that can contribute to energy sustainability. Such production is based on lignocellulosic fiber conversion (cellulose and hemicellulose), which generates fermentable sugars that are biotransformed in bioethanol after some specific pretreatment and hydrolysis. The industries of extracting oil from sunflower seeds have also generated lignocellulosic residues known as sunflower cake and bran. They can be sources for recycling and profitable alternatives on converting biotechnological products with some trading interest. Thus, this trial aimed at evaluating ethanol production from cellulose and hemicellulose fractions of cake and bran, from the processing of sunflower seeds (Hellianhus annuus). After the description concerning contents of cellulose, hemicellulose and lignin, the residues were submitted to a mild acid hydrolysis with sulfuric acid, whose concentration of H2SO4 varied in 1, 2, 4 and 6% v/v, while times of hydrolysis in autoclave were (20, 40 and 60 minutes). After choosing the best of sunflower residue and treatment to obtain a hemicellulosic hydrolysate with high content of xylose and low content of inhibiting compounds, the detoxified hydrolyzate was fermented by the yeast Pichia stipitis ATCC 58376 at 30 °C with some stirring variations (100, 150 and 200 rpm). In order to obtain ethanol from cellulosic fraction, the remaining solid biomass from acid hydrolysis treatment was delignified at 1% NaOH and submitted to simultaneous saccharification and fermentation process (SSF) by yeast Kluyveromyces marxianus ATCC 36907, at 38 °C and 150 rpm. The enzymes concentrations varied at 10, 15 and 20 FPU/g of Cellulase complex NS22086 and 1/3, 1.5/3 and 2/3 of β-glucosidase in relation to NS22118 cellulase, both ones from "Novozymes Cellulosic Ethanol Enzyme Kit ". Regarding chemical composition, the cake has shown the following answers: 27.5, 33.16 and 32.18% of cellulose, hemicellulose and lignin, respectively, while for bran, the answers were: 32.93, 30.90 and 26.62% cellulose, hemicellulose and lignin, respectively. Treatment of sunflower bran with 6% H2SO4 and 20 minutes of hydrolysis resulted in a hemicellulosic hydrolysate with high concentrations of sugars (24.88 g/L xylose, 22.33 g/L glucose, 8.9 g/L arabinose and lower amounts of toxic compounds (1.59 g/L phenol, 1.93 g/L acetic acid, 0.0182 g/L furfural and 0.0514 g/L hydroxymethylfurfural). The stirring influenced the process of ethanol production by P. stipitis in hemicellulosic hydrolyzate, whose best results (ethanol 8.8 g/L, yield 0.23 g/g and productivity 0.12 g/Lh) were with 200 rpm stirring. In relation to the SSF process, the best conditions for ethanol production were 20 FPU/g cellulase and 15 CBU β-glucosidase. This resulted in 27.88 g/L ethanol, 0.35 g/g yield and 0.38 g/Lh productivity. In the same condition, the best efficiency of enzymatic conversion (EEC) was 21.95%. These are promising results since sunflower bran is available to produce second generation ethanol from both xylose and cellulose / Pesquisas sobre o etanol de segunda geração, produzido a partir dos resíduos agroindustriais, têm recebido atenção especial como possível solução para contribuir na sustentabilidade energética. Tal obtenção consiste na conversão das fibras lignocelulósicas (celulose e hemicelulose) que, após passarem por pré-tratamento específico e hidrólise, originam açúcares fermentescíveis, que são biotransformados a etanol de segunda geração. Por sua vez, o setor de extração de óleo, a partir da semente de girassol, gera resíduos lignocelulósicos, conhecidos como torta e farelo de girassol, que podem ser fontes para a reciclagem e alternativa de lucro a partir da conversão biotecnológica em produtos de interesse comercial. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de etanol a partir das frações hemicelulósica e celulósica da torta ou farelo, provenientes do processamento das sementes de girassol (Hellianhus annuus). Após a caracterização da quantidade de celulose, hemicelulose e lignina dos resíduos, os mesmos foram submetidos à hidrólise ácida branda com ácido sulfúrico, com variações na concentração de H2SO4 (1; 2; 4; 6 % v/v) e tempo de hidrólise em autoclave (20, 40 e 60 minutos). Após a escolha do farelo de girassol como melhor resíduo e do melhor tratamento para obtenção do hidrolisado hemicelulósico com alto teor de xilose e baixo teor de compostos inibidores, o hidrolisado foi destoxificado e fermentado pela levedura Pichia stipitis ATCC 58376 a 30 oC com variações na agitação (100, 150 e 200 rpm). Para obtenção do etanol proveniente da fração celulósica, a biomassa sólida restante do tratamento de hidrólise ácida foi deslignificada com 1% NaOH e submetida ao processo de sacarificação simultânea à fermentação (SSF) pela levedura Kluyveromyces marxianus ATCC 36907 a 38 oC, 150 rpm, com variações na concentração das enzimas (10; 15 e 20 FPU/g de Cellulase complex NS22086 e 1/3; 1,5/3 e 2/3 de β - glicosidase NS22118 em relação à celulase), ambas do Novozymes Cellulosic Ethanol Enzyme Kit. A torta apresentou 27,5; 33,16 e 32,18% de celulose, hemicelulose e lignina respectivamente, enquanto o farelo apresentou 32,93; 30,90 e 26,62% celulose, hemicelulose e lignina, respectivamente. O tratamento do farelo de girassol com 6% de H2SO4 e 20 minutos de hidrólise resultou em um hidrolisado hemicelulósico com elevadas concentrações de açúcares (24,88 g/L xilose; 22,33 g/L glicose e 8,9 g/L arabinose) e menores quantidades de compostos tóxicos (1,59 g/L fenóis; 1,93 g/L ácido acético, 0,0182 g/L furfural e 0,0514 g/L hidroximetilfurfural). A agitação influenciou no processo de produção de etanol por P. stipitis no hidrolisado hemicelulósico, cujos melhores resultados (etanol 8,8 g/L; rendimento 0,23 g/g e produtividade 0,12 g/L.h) foram encontrados com a agitação de 200 rpm. No processo SSF, as melhores condições para produção de etanol foram 20 FPU/g de celulase e 15 CBU β-glicosidase, resultando em 27,88 g/L etanol, rendimento 0,35 g/g e produtividade 0,38 g/L.h. Nessa mesma condição, foi verificada a melhor porcentagem na eficiência de conversão enzimática - ECC (21,95%). Os resultados são promissores e demonstram que o farelo de girassol é adequado para a produção de etanol de segunda geração tanto a partir da hemicelulose como de celulose

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:48:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Danielle.pdf: 2045477 bytes, checksum: e87013d4e9e85c9f4d8686bbb3c0dd6e (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / The researches on second generation ethanol, produced by agroindustrial wastes, have demanded special attention as a possible solution that can contribute to energy sustainability. Such production is based on lignocellulosic fiber conversion (cellulose and hemicellulose), which generates fermentable sugars that are biotransformed in bioethanol after some specific pretreatment and hydrolysis. The industries of extracting oil from sunflower seeds have also generated lignocellulosic residues known as sunflower cake and bran. They can be sources for recycling and profitable alternatives on converting biotechnological products with some trading interest. Thus, this trial aimed at evaluating ethanol production from cellulose and hemicellulose fractions of cake and bran, from the processing of sunflower seeds (Hellianhus annuus). After the description concerning contents of cellulose, hemicellulose and lignin, the residues were submitted to a mild acid hydrolysis with sulfuric acid, whose concentration of H2SO4 varied in 1, 2, 4 and 6% v/v, while times of hydrolysis in autoclave were (20, 40 and 60 minutes). After choosing the best of sunflower residue and treatment to obtain a hemicellulosic hydrolysate with high content of xylose and low content of inhibiting compounds, the detoxified hydrolyzate was fermented by the yeast Pichia stipitis ATCC 58376 at 30 °C with some stirring variations (100, 150 and 200 rpm). In order to obtain ethanol from cellulosic fraction, the remaining solid biomass from acid hydrolysis treatment was delignified at 1% NaOH and submitted to simultaneous saccharification and fermentation process (SSF) by yeast Kluyveromyces marxianus ATCC 36907, at 38 °C and 150 rpm. The enzymes concentrations varied at 10, 15 and 20 FPU/g of Cellulase complex NS22086 and 1/3, 1.5/3 and 2/3 of β-glucosidase in relation to NS22118 cellulase, both ones from "Novozymes Cellulosic Ethanol Enzyme Kit ". Regarding chemical composition, the cake has shown the following answers: 27.5, 33.16 and 32.18% of cellulose, hemicellulose and lignin, respectively, while for bran, the answers were: 32.93, 30.90 and 26.62% cellulose, hemicellulose and lignin, respectively. Treatment of sunflower bran with 6% H2SO4 and 20 minutes of hydrolysis resulted in a hemicellulosic hydrolysate with high concentrations of sugars (24.88 g/L xylose, 22.33 g/L glucose, 8.9 g/L arabinose and lower amounts of toxic compounds (1.59 g/L phenol, 1.93 g/L acetic acid, 0.0182 g/L furfural and 0.0514 g/L hydroxymethylfurfural). The stirring influenced the process of ethanol production by P. stipitis in hemicellulosic hydrolyzate, whose best results (ethanol 8.8 g/L, yield 0.23 g/g and productivity 0.12 g/Lh) were with 200 rpm stirring. In relation to the SSF process, the best conditions for ethanol production were 20 FPU/g cellulase and 15 CBU β-glucosidase. This resulted in 27.88 g/L ethanol, 0.35 g/g yield and 0.38 g/Lh productivity. In the same condition, the best efficiency of enzymatic conversion (EEC) was 21.95%. These are promising results since sunflower bran is available to produce second generation ethanol from both xylose and cellulose / Pesquisas sobre o etanol de segunda geração, produzido a partir dos resíduos agroindustriais, têm recebido atenção especial como possível solução para contribuir na sustentabilidade energética. Tal obtenção consiste na conversão das fibras lignocelulósicas (celulose e hemicelulose) que, após passarem por pré-tratamento específico e hidrólise, originam açúcares fermentescíveis, que são biotransformados a etanol de segunda geração. Por sua vez, o setor de extração de óleo, a partir da semente de girassol, gera resíduos lignocelulósicos, conhecidos como torta e farelo de girassol, que podem ser fontes para a reciclagem e alternativa de lucro a partir da conversão biotecnológica em produtos de interesse comercial. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de etanol a partir das frações hemicelulósica e celulósica da torta ou farelo, provenientes do processamento das sementes de girassol (Hellianhus annuus). Após a caracterização da quantidade de celulose, hemicelulose e lignina dos resíduos, os mesmos foram submetidos à hidrólise ácida branda com ácido sulfúrico, com variações na concentração de H2SO4 (1; 2; 4; 6 % v/v) e tempo de hidrólise em autoclave (20, 40 e 60 minutos). Após a escolha do farelo de girassol como melhor resíduo e do melhor tratamento para obtenção do hidrolisado hemicelulósico com alto teor de xilose e baixo teor de compostos inibidores, o hidrolisado foi destoxificado e fermentado pela levedura Pichia stipitis ATCC 58376 a 30 oC com variações na agitação (100, 150 e 200 rpm). Para obtenção do etanol proveniente da fração celulósica, a biomassa sólida restante do tratamento de hidrólise ácida foi deslignificada com 1% NaOH e submetida ao processo de sacarificação simultânea à fermentação (SSF) pela levedura Kluyveromyces marxianus ATCC 36907 a 38 oC, 150 rpm, com variações na concentração das enzimas (10; 15 e 20 FPU/g de Cellulase complex NS22086 e 1/3; 1,5/3 e 2/3 de β - glicosidase NS22118 em relação à celulase), ambas do Novozymes Cellulosic Ethanol Enzyme Kit. A torta apresentou 27,5; 33,16 e 32,18% de celulose, hemicelulose e lignina respectivamente, enquanto o farelo apresentou 32,93; 30,90 e 26,62% celulose, hemicelulose e lignina, respectivamente. O tratamento do farelo de girassol com 6% de H2SO4 e 20 minutos de hidrólise resultou em um hidrolisado hemicelulósico com elevadas concentrações de açúcares (24,88 g/L xilose; 22,33 g/L glicose e 8,9 g/L arabinose) e menores quantidades de compostos tóxicos (1,59 g/L fenóis; 1,93 g/L ácido acético, 0,0182 g/L furfural e 0,0514 g/L hidroximetilfurfural). A agitação influenciou no processo de produção de etanol por P. stipitis no hidrolisado hemicelulósico, cujos melhores resultados (etanol 8,8 g/L; rendimento 0,23 g/g e produtividade 0,12 g/L.h) foram encontrados com a agitação de 200 rpm. No processo SSF, as melhores condições para produção de etanol foram 20 FPU/g de celulase e 15 CBU β-glicosidase, resultando em 27,88 g/L etanol, rendimento 0,35 g/g e produtividade 0,38 g/L.h. Nessa mesma condição, foi verificada a melhor porcentagem na eficiência de conversão enzimática - ECC (21,95%). Os resultados são promissores e demonstram que o farelo de girassol é adequado para a produção de etanol de segunda geração tanto a partir da hemicelulose como de celulose

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 800491 bytes, checksum: 274cc18672a32ed45926e416e0de5305 (MD5) Previous issue date: 2011-02-15 / The homologue recombination in Kluyveromyces lactis is not the preferential way used as repair mechanism of DNA double strand, desirable in proteins expression construction dependent on gene-specific integration. In order to obtain K. lactis strains to recombinant protein expression efficient in homologue recombination way, KU80 gene was interrupted. The perfect running of non-homologue ends junctions (NHEJ) way depends on that gene and is responsible by exogenous DNA random integration in the host genome. KU80 gene deletion was made by Split-Marker. Two fragments were generated by PCR fusion, each one with a flanker sequence of KU80 coding region (5 and 3 ends) and part of geneticin resistance gene (KanMX). Deletion cassette resulting from in vivo recombination of two fragments had KanMX gene flanked by KU80 coding regions end sand was used for KU80 deletion by homologue recombination in the genome in two K. lactis strains, JA6 and HP108. The 3.7 Kb fragment obtained by PCR amplification with external primers to KU80 coding region confirmed deletion cassette integration in the target gene. Integration efficiency with Split-Marker resulting fragments was 100 %. pKLAC1 and pKLAC1/cStp vectors with streptavidin affinity domain by biotin were used to determine homologue recombination efficiency of KU80 (JA6ΔKU80 and HP108ΔKU80) mutant strains. Pectin lyase coding gene (plg1) from Penicillium griseoroseum was cloned in those vectors to evaluate the capacity of K. lactis strains to produce and secrete the recombinant protein. The transformation efficiency (transformants/μg of DNA) of mutants JA6ΔKU80 and HP108ΔKU80 with pKLAC1/Plg1 and pKLAC1/cStp-Plg1 vectors was higher than to parental strains JA6 and HP108. Target gene integration efficiency was 100 % in most strains, except to strains JA6/Plg1and HP108ΔKU80/Plg1 that showed an integration efficiency of 80 and 70 %, respectively. Although the high efficiency of specific-gene integration there was no pectin lyase (PL) or cStp-Plg1 secretion as expected for pKLAC1 vector. PL intracellular activity was significant when compared with parental strain HP108/Plg1, that presented specific activity of 9,525 U.mg-1 protein. / A recombinação homóloga em Kluyveromyces lactis não é a via preferencial usada como mecanismo de reparo de quebra de fita dupla de DNA, o que pode ser indesejado em construções de expressão de proteínas dependentes de integração gene-específico. Para obter linhagens de K. lactis hospedeiras para a expressão de proteínas recombinantes eficientes na via de recombinação homóloga realizou-se a mutação do gene KU80. Este gene é essencial para perfeito funcionamento da via de junções de extremidades não-homólogas (NHEJ), responsável pela integração aleatória do DNA exógeno no genoma hospedeiro. A deleção do gene KU80 foi feita utilizando a técnica Split-Marker. Dois fragmentos foram obtidos por fusão por PCR, cada um contendo uma sequência flanqueadora da região codificante do gene KU80 (extremidades 5 e 3 ) e uma parte do gene de resistência a geneticina (KanMX). O cassete de deleção resultante da recombinação in vivo dos dois fragmentos gerados continha o gene KanMX flanqueado pelas extremidades da região codificante do gene KU80, e foi utilizado para deleção do gene KU80 por recombinação homóloga no genoma de duas linhagens de K. lactis, JA6 e HP108. O fragmento de 3,7 Kb obtido por amplificação por PCR com oligonucleotídeos externos à região codificante do gene KU80 confirmou a integração do cassete de deleção no gene alvo. A eficiência de integração com os fragmentos resultantes do Split-Marker foi de 100 %. Os vetores pKLAC1, e pKLAC1/cStp contendo o domínio de afinidade da estreptavidina pela biotina, foram usados para determinar a eficiência de recombinação homóloga das linhagens mutantes KU80 (JA6ΔKU80 e HP108ΔKU80). O gene da pectina liase (plg1) de Penicillium griseoroseum foi clonado nesses vetores para avaliar a capacidade de linhagens de K. lactis em produzir e secretar a proteína recombinante. A eficiência de transformação (transformantes/μg de DNA) dos mutantes JA6ΔKU80 e HP108ΔKU80 com os vetores pKLAC1/Plg1 e pKLAC1/cStp-Plg1, foi superior à das linhagens parentais JA6 e HP108. A eficiência de integração no gene alvo foi de 100% para maioria das linhagens, com exceção das linhagens JA6/Plg1e HP108ΔKU80/Plg1 que apresentaram, respectivamente, eficiência de 80 e 70 % de integração geneespecífico. Apesar da eficiência de integração por recombinação homóloga, não houve secreção de PL e da fusão cStp-Plg1 como esperado ao se utilizar o vetor pKLAC1. A atividade intracelular de pectina liase (PL) só foi significativa em relação à parental para a cepa HP108/Plg1, que demonstrou atividade específica de 9,525 U.mg-1 proteína.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 996773 bytes, checksum: 7322b4697c096a6f17a4388ca498fede (MD5) Previous issue date: 2014-02-17 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The L-ascorbic acid (ALA) is produced naturally by plants from D-glucose. Yeasts synthesize a similar metabolite, D-eritroascorbic acid (ADEA). Although this compound does not show activity against scurvy, it contains an antioxidant function, but it is produced in low concentrations by the microorganism. Recently, in order to make yeasts are capable of converting D-galactose D-lactose from cheese whey into ALA, the wild strain Kluyveromyces lactis CBS2359 has been transformed with genes that integrate the L-galactose biosynthesis pathway, isolated from Arabidopsis thaliana. In the presence of intermediate L-galactose, ALA can be synthesized by yeast with enzymes responsible for ADEA production. It has been demonstrated that the engineered strain JVC 1-56 was able to synthesize ALA compared to the wild type, but the yield was still low. In this regard, studies to assist the increased of ALA production are relevant. Once the engineered ALA pathway and native cell wall formation pathway of K. lactis have a common intermediate, GDP-D-mannose, we need to evaluate the effect of uncoupling of vitamin C synthesis route of the growth that requires constant wall synthesis. Moreover, considering the antioxidant properties of ALA, the expectation is that the production of this metabolite increase when JVC 1-56 is exposed to a oxidative stress condition by menadione. In this context, this study investigated the both physiological conditions, using the media Yeast Galactose Base (YGB) and ultrafiltered cheese whey (SQU - byproduct of cheese industry that predominates lactose as carbon source). It was analyzed that Kluyveromyces lactis JVC 1-56 produces higher yields of ALA when it is grown for 96 hours in batch culture in the middle YPGal. Cultivation at low growth rates (0.04 h-1) predisposes the cells to synthesize more ALA per unit cell mass (0.80 mg/mg). However, the yield of continuous culture operated as quimostato, limiting the substrate nitrogen, still proved to be lower than expected in the batch (1.94 mg/mg). Oxidative stress by 12.5 mM menadione on K. lactis JVC1 -56, in the conditions applied, was not effective in the increasing the ALA production (1.47 mg/mg). Still, ADEA yield was higher than ALA in two strategies: 1.37 mg/mg at 0.21 h-1 in culture under steady state, 8.52 mg/mg in batch under oxidative stress and 10.33 mg/mg in the batch in the absence of oxidizing agent, indicating that ADEA may be in a more stable configuration than vitamin C. Finally, the permeate cheese whey remains a prospect for the conversion of lactose into a biotechnological product of higher value aggregate. / O ácido L-ascórbico (ALA) é produzido naturalmente por plantas a partir de D-glicose. Leveduras sintetizam um metabólito semelhante, o ácido D-eritroascórbico (ADEA). Embora este composto não mostre atividade contra o escorbuto, ele contém uma função antioxidante, mas é produzido pelo micro-organismo em baixas concentrações. Recentemente, com a finalidade de fazer as leveduras serem capazes de converter o componente D-galactose da D-lactose do soro de queijo em ALA, a linhagem selvagem de Kluyveromyces lactis CBS2359 foi transformada com genes, que integram a via de biossíntese de L-galactose, isolados de Arabidopsis thaliana. Na presença do intermediário L-galactose, ALA pode então ser sintetizado pela levedura com as enzimas responsáveis pela produção de ADEA. Foi demonstrado que a linhagem engenheirada JVC 1-56 foi capaz de sintetizar ALA em comparação com a selvagem, mas com baixo rendimento. Neste sentido, estudos que auxiliem o aumento da produção de ALA são relevantes. Uma vez que a via engenheirada da síntese de ALA e a via nativa da formação da parede celular de K. lactis possuem um intermediário comum, GDP-D-manose, faz-se necessário avaliar o efeito do desacoplamento da produção de ALA do crescimento que requer constante síntese da parede. Além disso, considerando a propriedade antioxidante do ALA, a expectativa é de que a produção deste metabólito aumentasse quando JVC 1-56 fosse exposta a uma condição de estresse oxidativo por menadiona. Neste contexto, este trabalho investigou as condições fisiológicas mencionadas utilizando os meios Yeast Galactose Base (YGB) e soro de queijo ultrafiltrado (SQU - subproduto de indústrias de queijo em que predomina lactose como fonte de carbono). Foi averiguado que Kluyveromyces lactis JVC 1-56 produz ALA com rendimentos maiores quando cultivada por 96 horas em batelada no meio YPGal. O cultivo em baixas velocidades de crescimento (0,04 h -1) predispõe as células a sintetizar mais ALA por unidade de massa celular (0,80 mg/mg). Entretanto, o rendimento da cultura contínua operada como quimostato, tendo nitrogênio como substrato limitante, ainda mostrou ser inferior ao previsto na batelada (1,94 mg/mg). Já o estresse oxidativo por 12,5 μM de menadiona sobre K. lactis JVC1- 56, nas condições aplicadas, não foi eficaz no aumento da produção de ALA (1,47 mg/mg). Ainda, o rendimento de ADEA foi superior ao de ALA nas duas estratégias: 1,37 mg/mg a 0,21 h-1 na cultura sob regime permanente, 8,52 mg/mg na batelada sob estresse oxidativo e 10,33 mg/mg na batelada na ausência do agente oxidante, indicando que ele pode estar em uma configuração mais estável do que a vitamina C. Finalmente, o permeado do soro de queijo continua sendo uma perspectiva para a conversão da lactose em um produto biotecnológico de maior valor agregado.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 587076 bytes, checksum: d1ad8af5f243dc621caec98155378354 (MD5) Previous issue date: 2008-07-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In this work we have created an in silico system to address secretion of a desired protein among the genome data of Kluyveromyces lactis. The completed K. lactis genome sequencing has provided a tool to construct such a system. In order to explore a potential K. lactis extracellular secretome, four computational prediction algorithms have been applied: SignalP (presence or absence of an N-terminal signal peptide and clivage site), Phobius (transmembrane topology), big-PI Predictor (GPI modification site) and WolfPsort (subcellular addressing, including extracellular prediction). These algorithms have correctly predicted 95 yeast secreted proteins sought in public databases (NCBI, UNIProt and MIPS). They have also predicted as intracellular the same number (i.e. 95) of random sequences found in K. lactis database. The K. lactis database consists of 5327 sequences (http://cbi.labri.fr/Genolevures). When analyzed by SignalP 3.0, it has pointed out 698 putative proteins with N-terminal signal peptides. In this group, 260 were predicted by Phobius to have no transmembrane domains and 236 were found by the big-PI Predictor to have no GPI modifications site. Finally, the predicted K. lactis secretome was estimated to consist of up to 101 sequences by WolfPSORT which eliminates proteins with subcellular targeting. In order to validate theses analysis, both groups of predicted and annotated extracellular proteins were compared by Hotelling s T2 test. The analysis has shown no differences between the mean values of these two groups. The physiological significance of those potential extracellular proteins was similarly investigated by analyzing the relationship between the S. cerevisiae transcriptional regulators ortologues in K. lactis and the putative promoters (i.e. 1 KB upstream) of those extracellular proteins. It was applied the methodology proposed by Yeastract which search for elements such as binding sites that indicates associations between transcriptional factor and target genes. The physiological condition favoring protein expression in extracellular medium was obtained by searching Gene Ontology (http://www.geneontology.org). It has been shown that most of the transcriptional regulators of K. lactis extracellular proteins are related to stress response, especially presence of drugs into the medium. Also pH stress and limiting nitrogen can induce the extracellular proteins. / O banco de dados da Kluyveromyces lactis constituído de 5327 seqüências de proteínas (http://cbi.labri.fr/Genolevures) foi submetido a quatro algoritmos de predição para identificar o potencial secretome extracelular. O primeiro,SignalP v3 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0), que identifica a presença de peptideo sinal na porção N-terminal e o sítio de clivagem da peptidase sinalagrupou 698 proteínas.Deste grupo, o Phobius(http://phobius.sbc.su.se), que prevê a topologia de domínios transmembranas a partir das sequencias primárias, indicou 260 sem domínios transmembranas.Outros dois algoritmos, big-PI predictor(http://mendel.imp.ac.at/gpi/gpi_server.html),capaz reconhecer marcas de de ancoras GPI (Glicosilfosfatidilinositol) e WoLF PSORT(http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)capaz de identificar assinaturas para a localização em compartimentos subcelulares apontaram 236 proteínas sem ancoras GPI e 101 endereçadas ao meio extracelular. Como controle positivo, os mesmos algoritmos foram testados e predisseram corretamente 95 proteínas de leveduras Saccharomycetes encontradas nos bancos de dados públicos (NCBI e UNIProt) e anotadas como extracelulares. Como controle negativo foram preditas como intracelular 95 seqüências aleatórias do banco de dados da K. lactis. O grupo controle positivo e o grupo predito foram comparados pelo teste estatístico T2 de Hotelling. Não foram evidenciadas diferenças significativas entre os valores das médias dos grupos.A condição fisiológicana qual estas proteínas extracelulares são expressas foi analisada relacionando suas seqüências promotoras com os fatores transcricionais ortólogos da Saccharomyces cerevisiae. A metodologia aplicada foi o "Yeastract" (http://www.yeastract.com) que localiza sítios de ligação ao DNA dos fatores transcricionais de S. cerevisiaenas seqüências promotoras dos ORFs das proteínas preditas como extracelulares. A condição fisiológica que favorece a expressão para o meio extracelular foi obtida pela pesquisa dos termos descritos pelo "Gene Ontology"(http://www.geneontology.org). Os fatores transcricionais que mais se relacionam com as seqüências preditas foram aqueles associados com resposta a estresse. Também foi indicado que o estresse ácido e limitação de nitrogênio (aminoácidos) exercem influência na expressão das proteínas extracelulares.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 445645 bytes, checksum: f448d5a3c851f1c181e95a80994ffb89 (MD5) Previous issue date: 2007-03-16 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / In order to investigate the stress condition imposed by nitrogen limitation on kinetic of growth and aging of Kluyveromyces lactis, the kinetics constants of K. lactis culture as function of ammonium sulfate concentration were determined. The effect of aging of the culture on its specific initial growth rate was evaluated. Signals of aging such as cell wall chitin concentration and apoptosis markers were analyzed as function of growth rate on continuous culture. K. lactis was cultured in buffered YCB medium supplemented with ammonium sulfate at concentrations of 0.02 to 38.0 mmol.L-1. The growth kinetic followed the model proposed by Monod. The maximum specific growth rate (µmax) and saturation constant (Ks) were 0.44 h-1 and 0.15 mmol.L-1, respectively. The initial specific growth rates decrease as the aging of the culture increases. The cell wall chitin concentration increased with the ammonium concentrate and the aging of the cultures. The cell dimensions raised with aging in all the ammonium sulfate concentration analyzed. Apoptosis markers were only observed in the older cultures, after five days of recycling of the culture on the concentrations of 0.57 mmol.L-1, 3.80 mmol.L-1 and 7.60 mmol.L-1 and after eight days on the concentrations 38.0 mmol.L-1 of ammonium sulfate. Aging signals were investigated at K. lactis cells growing in nitrogen limiting continuous culture at growth rate 0.01, 0.06, 0.18 and 0.35 h-1. Chitin concentration of cell wall of cells growing at 0.01 h-1 and 0.06 h-1 was higher (27µg.mL-1 N-acetylglucosamine and 20µg.mL-1 N-acetylglucosamine) than of cells growing at 0.18 h-1 and 0.35 h-1 (6µg.mL-1 and 5µg.mL-1, respectively). The dimensions of K. lactis cells were largest on the growth rate of 0.01 h-1. It was detected apoptosis markers on the continuous culture under the nitrogen limiting growth rate of 0.01 h-1. The results demonstrate that nitrogen limitation and aging affect growth kinetic and suggest that nitrogen limiteted continuous culture conducted at growth rate 0.01 h-1 can still proven useful to investigate aging response of Kluyveromyces lactis. / Para investigar o estresse imposto por condições limitantes de nitrogênio na cinética de crescimento e na longevidade de culturas de Kluyveromyces lactis, determinaram-se as constantes cinéticas do crescimento de culturas de K. lactis em função da concentração de sulfato de amônio, avaliou-se o efeito da idade das culturas na velocidade específica inicial de crescimento e averiguaram-se os sinais de envelhecimento celular em função de diferentes velocidades de crescimento de culturas conduzidas em regime contínuo sob limitação por nitrogênio. Culturas de K. lactis foram cultivadas em meio YCB tamponado acrescido de sulfato de amônio, nas concentrações 0,02 a 38,0 mmol.L-1. A cinética de crescimento de K. lactis em função da concentração de sulfato de amônio, obedeceu o modelo cinético proposto por Monod. A velocidade específica máxima de crescimento (μmáx.) e a constante de saturação (Ks) foram de 0,44 h-1 e 0,15 mmol.L-1, respectivamente. A velocidade específica inicial de crescimento reduziu com a idade da cultura. Concentrações de quitina na parede celular aumentaram com a idade da cultura e com a concentração de sulfato de amônio. Dimensões celulares aumentaram com a idade independente da concentração de sulfato de amônio. A presença de características morfológicas de apoptose foi verificada a partir do quinto dia de transferência da cultura para meio novo nas concentrações de 0,57 mmol.L-1, 3,80 mmol.L-1, 7,60 mmol.L-1 e a partir do oitavo dia de repicagem na concentração de 38,0 mmol.L-1 de [NH4]2SO4. Culturas contínuas sob estresse por nitrogênio foram conduzidas nas velocidades de crescimento de 0,01, 0,06; 0,18 e 0,35 h-1. Culturas com velocidades de crescimento de 0,18 e 0,35 h-1 produziram maior rendimento em etanol e menor rendimento em glicerol. A concentração de quitina na parede celular de culturas de K. lactis conduzidas nas velocidades de crescimento de 0,01 h-1 e 0,06 h-1 foi maior (27 mg.mL-1 e 20 mg.mL-1 de N-acetilglicosamina) comparada com as culturas conduzidas nas velocidades de crescimento de 0,18 h-1 e 0,35 h-1, que apresentaram 6 μg.mL-1 e 5 μg.mL-1 de N-acetilglicosamina, respectivamente. As dimensões das células de K. lactis foram maiores na cultura conduzida com velocidade de crescimento de 0,01 h-1, se comparada com as demais velocidades de crescimento avaliadas: 0,06; 0,18 e 0,35 h-1. Apesar desses sinais de envelhecimento terem sido detectados, características morfológicas de apoptose só foram identificadas nas culturas de K. lactis conduzidas na velocidade de crescimento de 0,01 h-1. Os resultados mostraram que o estresse por nitrogênio e a idade afetam a cinética de crescimento de culturas de K. lactis e sugerem que culturas contínuas de Kluyveromyces lactis sob condições nitrogênio limitantes conduzidas com velocidade de crescimento correspondente a 0,01 h-1 podem ser úteis em estudos sobre sinais de envelhecimento celular.

Devido à sua vasta biodiversidade, o Brasil dispÃe de uma grande variedade de resÃduos agrÃcolas e agroindustriais, cujo bioprocessamento à de grande interesse econÃmico e social. Entre os biocombustÃveis produzidos em todo o mundo, o etanol produzido no Brasil a partir da cana de aÃÃcar possui lugar de destaque, apresentando notÃvel evoluÃÃo durante as ultimas dÃcadas, alcanÃando assim maturidade e consistÃncia. Contudo, estima-se que a produÃÃo de etanol atravÃs dessa matÃria-prima nÃo seja suficiente para atender a demanda mundial. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produÃÃo de etanol a partir do suco de caju. Para tal fim, inicialmente, avaliou-se a necessidade de suplementaÃÃo do suco de caju para a sua posterior fermentaÃÃo. Nesta etapa, foi observado que nÃo se faz necessÃria a suplementaÃÃo do suco de caju com nutrientes, pois o mesmo in natura jà apresenta todos os nutrientes necessÃrios para o crescimento do microrganismo. Posteriormente, estudou-se o efeito da temperatura na produÃÃo de etanol, avaliando a fermentaÃÃo na faixa de 26 a 42ÂC. Os melhores resultados de rendimento (0,5 g.g-1), produtividade (4,9 g.L-1.h-1), eficiÃncia (92,8%) e produÃÃo mÃxima de etanol (49,3 g.L-1), foram obtidos quando se conduziu a fermentaÃÃo na faixa de 30 a 38ÂC. Os modelos de Monod e Arrhenius foram utilizados para descrever a dependÃncia dos parÃmetros cinÃticos com a temperatura, sendo os resultados obtidos satisfatÃrios. O potencial do suco de caju como fonte de aÃÃcares para a produÃÃo de etanol foi avaliado por diferentes cepas de leveduras dos gÃneros Saccharomyces e Kluyveromyces. Os resultados mostraram que as cepas de Saccharomyces foram bastante superiores quando comparadas Ãs Kluyveromyces quanto à produÃÃo mÃxima de etanol. A levedura que apresentou melhores resultados para os parÃmetros cinÃticos avaliados foi a Saccharomyces cerevisiae CCA008. Por ultimo, para determinar o efeito da concentraÃÃo inicial de substrato na produÃÃo de etanol, estudou-se a faixa de 70, 90, 110, 130 e 150 g.L-1 de substrato inicial. A concentraÃÃo que apresentou melhores resultados para os parÃmetros estudados foi 90 g.L-1. O modelo cinÃtico que conseguiu chegar mais prÃximos dos dados experimentais e assim descrever o processo mais fielmente foi o modelo proposto por Ghose & Thyagi. Com estes resultados, conclui-se que o uso do suco de caju como substrato para a produÃÃo de etanol trarà benefÃcios econÃmicos, pois estaremos utilizando um substrato de baixo custo, e ambientais, jà que o mesmo à um resÃduo agroindustrial proveniente da produÃÃo de castanha de caju. / Despite its big biodiversity, Brazil has a great variety of agriculturists and agroindustrials which its bioprocess has a lot of economic and social interest. Among all the ethanol produced all over the world, the ethanol produced in Brazil made of cane of sugar has great distinction. Its evolution on the last decade is remarkable reaching its maturity and consistency. Within all it is estimated that the ethanol produced with that material is not enough to be spread and supply worldwide. The object of this article is to evaluate the production of the ethanol made with cashew apple juice. In this stage, it was observed that it is not necessary to supplement the cashew apple juice to posterior fermentation because the juice already shows all the nutrients necessary for the growth of the microorganism. Later there was a study showing that the temperature in the production of ethanol evaluating its fermentation between 26 and 42ÂC. The best results of revenue (0,5 g.g-1), productivity (4,9 g.L-1.h-1), efficiency (92,8%) and the maximum production of ethanol (49,3 g.L-1), It was gained when the fermentation was conducted between 30 to 38ÂC. The models of Monod and Arrhenius were used to describe the dependence of the kinetic parameter with the temperature, showing the results to be satisfactory. The potential of the cashew apple juice being a source of sugar for the production of ethanol was evaluated by different sources of the genders Saccharomyces and Kluyveromyces. The results showed that the strains of Saccharomyces were higher when compared to the Kluyveromyces to the maximum production of ethanol. The strain that showed the best results for the kinetic parameter that was evaluated was Saccharomyces cerevisiae CCA008. At last, to determine the effect of the initial concentrate substratum in the production of ethanol, it was studied the range of 70, 90, 110, 130 and 170 g.L-1 of initial substratum. The one that showed the best results for the parameters studied was 90 g.L-1. The kinetic model that came closer to the ones experimented and could explain the process best was the model proposed by Ghose & Thyagi. In conclusion, with those results shows that the cashew apple juice used in the production of ethanol will bring great economic benefits because it is a product of low cost and economic as well as to the environment being a agroindustial product deriving from the production of the cashew nut.

Transfer RNAs (tRNA) function as adaptor molecules in the translation of mRNA into protein. These adaptor molecules require modifications of a subset of their nucleosides for optimal function. The most frequently modified nucleoside in tRNA is position 34 (wobble position), and especially uridines present at this position. Modified nucleosides at the wobble position are important in the decoding process of mRNA, i.e., restriction or improvement of codon-anticodon interactions. This thesis addresses the functional aspects of the wobble uridine modifications. The Saccharomyces cerevisiae Elongator complex consisting of the six Elp1-Elp6 proteins has been proposed to participate in three distinct cellular processes; elongation of RNA polymerase II transcription, regulation of polarized exocytosis, and formation of modified wobble nucleosides in tRNA. In Paper I, we show that the phenotypes of Elongator deficient cells linking the complex to transcription and exocytosis are counteracted by increased level of and . These tRNAs requires the Elongator complex for formation of the 5-methoxycarbonylmethyl (mcmlnGUUGsmcm25tRNALysUUUsmcm25tRNA5) group of their modified wobble nucleoside 5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine (mcm5s2U). Our results therefore indicate that the relevant function of the Elongator complex is in formation of modified nucleosides in tRNAs and the defects observed in exocytosis and transcription are indirectly caused by inefficient translation of mRNAs encoding gene products important for these processes. The lack of defined mutants in eukaryotes has led to limited understanding about the role of the wobble uridine modifications in this domain of life. In Paper II, we utilized recently characterized mutants lacking the 2-thio (s2) or 5-carbamoylmethyl (ncm5) and mcm5 groups to address the in vivo function of eukaryotic wobble uridine modifications. We show that ncm5 and mcm5 side-chains promote reading of G-ending codons, and that presence of a mcm5 and an s2 group cooperatively improves reading of both A- and G-ending codons. Previous studies revealed that a S. cerevisiae strain deleted for any of the six Elongator subunit genes shows resistance towards a toxin (zymocin) secreted by the dairy yeast Kluyveromyces lactis. In Paper III, we show that the cytotoxic γ subunit of zymocin is a tRNA endonuclease that target the anticodon of mcm5s2U34 containing tRNAs and that the wobble mcm5 modification is required for efficient cleavage. This explains the γ-toxin resistant phenotype of Elongator mutants which are defective in the synthesis of the mcm5 group.

The aim of this research was the production of beta-galactosidase from thermophilic fungi for use in low lactose milk production or other possible applications. For this purpose, three thermophilic fungi Humicola insolens, Torula thermophila and Thermomyces lanuginosus were screened for lactase production. Highest lactase activity was observed in Thermomyces lanuginosus. The carbon source inducing highest extracellular lactase production in Thermomyces lanuginosus was determined as arabinose. When grown on arabinose T. lanuginosus produced two major lactase activity peaks, one being at day 4 (beta-galactosidase-A) and second starting following the initiation of biomass degradation at day 3 suggesting the existence of a cell wall-bound beta-galactosidase (beta-galactosidase-B). Maximum activity of the second enzyme was at day 10. Crude enzyme stored at 4&ordm / C and -20&ordm / C was stable over a period of one month. Optimum pH and temperature of crude enzyme were found as pH 6.8 and 65&ordm / C. For concentration of extracellular enzyme, fractional ammonium sulfate precipitation with 60-85% salt was applied. Comparisons with commercial lactase obtained from Kluyveromyces lactis revealed that partially purified lactase from Thermomyces lanuginosus was 1.3 times more efficient in hydrolysis of lactose even at 30&ordm / C which is optimum for Kluyveromyces lactis. Lactose hydrolysis was enhanced at higher temperatures and reached maximum at 50-60&ordm / C giving 4.7 fold higher hydrolysis than Kluyveromyces lactis beta-galactosidase. Molecular weight of the second enzyme was determined as 156 kDa by gel filtration. Being an extracellular enzyme with optimum pH suitable for dairy processes, high thermotolerance and stability, this enzyme has a potential for commercial use.

In this study, we evaluated the potential of water-in-oil microemulsions for the separation of beta-galactosidase (lactase) from other proteins. The ability of beta-galactosidase to break down the milk carbohydrate lactose gives the enzyme considerable commercial importance. The extent of solubilization of a commercial Kluyveromyces lactis preparation of beta-galactosidase into microemulsion droplets formed from 200 mM bis (2-ethylhexyl) sodium sulfosuccinate (AOT) in isooctane was measured as a function of buffer type, pH, ionic strength, and protein concentration. Our results showed that, due to the large molecular weight of beta-galactosidase (MW~ 220-240 kDa, dimeric form), the enzyme was taken up by the microemulsion droplets mainly under very low salt conditions. Based on these results, we designed a one-step separation procedure, in which a small volume of aqueous buffer containing the protein mixture is added to an organic surfactant solution. Microemulsion droplets form in the oil and capture protein impurities of smaller molecular weights, while excluding the high molecular weight target protein. This causes the beta-galactosidase to be expelled into a newly formed aqueous phase. The feasibility of this one-step process as a bioseparation tool was demonstrated on a feed consisting of an equal mixture of beta-galactosidase and the test protein beta-lactoglobulin. Recovery and separation of the two proteins was analyzed as function of buffer type, pH, ionic strength, and protein concentration. Results showed that separation was most complete at 100 mM KCl salt concentration, where the droplets were big enough to carry beta-lactoglobulin but too small for lactase. At 100 mM salt concentration, we recovered 92% of the total lactase activity in a virtually pure form. The same separation scheme was then tested on crude extract obtained from a cell culture broth of the yeast Kluyveromyces lactis. Cells of the yeast K. lactis were disrupted by minibeadbeater, forming a crude extract that was used as the feed in our separation process. A 5.4-fold purification factor of the extract was achieved, with 96% activity recovery. The results showed our one-step separation process to be an interesting method for the production of beta-galactosidase as a technical enzyme: it has the potential to achieve a continuous, large-scale partial purification of the enzyme, potentially reducing the number of steps required in downstream process.