Zugl.: Bonn, Univ., Diss.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T20:05:11Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 217487 bytes, checksum: 5604261524efd57a87ca9eed998aafa3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T20:05:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 217487 bytes, checksum: 5604261524efd57a87ca9eed998aafa3 (MD5) Previous issue date: 2004-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Com o objetivo de estabelecer a condição fisiológica para a conversão máxima da lactose do permeado de soro de queijo em etanol, avaliaram-se os efeitos da concentração de substrato e do nível de oxigênio no direcionamento do fluxo metabólico para a via fermentativa da levedura K. marxianus UFV-3. Inicialmente, as fermentações foram conduzidas em meio YNB sintético com altas concentrações de lactose, em condições aeróbica e microaeróbica (injeção de nitrogênio gasoso por 12 minutos), em regime de batelada. Nas fermentações sob microaerobiose, os rendimentos máximos de etanol por substrato foram próximos a 85% do rendimento teórico, ou seja, superiores aos obtidos em aerobiose, por volta de 55% desse rendimento. O rendimento de etanol máximo por massa celular também foi maior em microaerobiose, sendo a produtividade volumétrica maior em microaerobiose apenas na fermentação, cuja concentração inicial de lactose foi de 67,0 g L -1 . As fermentações realizadas em permeado de soro de queijo com 10 diferentes concentrações de lactose, que variaram de 1,0 g L -1 a 240,0 g L -1 , em regime de batelada, sob condições aeróbica, microaeróbica e anaeróbica (injeção de nitrogênio gasoso por todo o tempo de fermentação), apresentaram rendimento máximo de etanol por substrato e por massa celular, bem como de produtividade máxima volumétrica, superior àqueles obtidos em YNB. Além disso, K. marxianus UFV- 3 exibiu maiores velocidades específicas de crescimento, maior produção de massa celular e maior produção de glicerol nas fermentações em permeado que naquelas em YNB. Os parâmetros fermentativos da produção de etanol em permeado foram maiores em microaerobiose e anaerobiose do que em aerobiose. As fermentações em permeado – cujas concentrações iniciais de lactose foram acima de 50 g L -1 – e o nível de oxigênio reduzido (microaerobiose e anaerobiose) apresentaram altos rendimentos máximos de etanol por substrato, correspondendo a quase 100% do teórico. A velocidade de consumo de lactose e de produção de etanol aumentou à medida que a concentração inicial de substrato também aumentou e o nível de oxigênio diminuiu. A tolerância do produto (etanol) foi verificada no permeado acrescido de etanol, em concentrações que variaram de 5 a 80 g L -1 . Em 50 gL -1 , K. marxianus UFV-3 manteve um crescimento próximo a 80% em relação ao controle em condição anaeróbica e perto de 60% sob condições microaeróbica e aeróbioca. / To establish the physiological condition for maximum conversion of lactose from permeated of cheese whey in ethanol, the effects of substrate concentration and level of oxygen in the directioning of the metabolic flow for the fermentative pathway of the yeast K. marxianus UFV-3 were evaluated. Initially, fermentation was carried out in synthetic YNB medium with high lactose concentrations, in aerobic and microaerobic conditions (injection of nitrogen gas for 12 minutes), in batch culture. For fermentation under microaerobiosis, the maximum ethanol yield per substrate was close to 85% of the theoretical yield, in other words, superior to the obtained in aerobiosis, about 55% of that yield. The maximum ethanol yield per cellular mass was also higher in microaerobiosis, being the volumetric yield higher in microaerobiosis only in fermentation, with initial lactose concentration of 67,0 g L -1 . The fermentation performed in permeated of cheese whey with 10 different lactose concentrations which that varied from 1,0 g L -1 to 240,0 g L -1 , in batch regime, under aerobic, microaerobic and anaerobic conditions, (injection of nitrogen gas xifor the entire fermentation) presented maximum ethanol yield per substrate and per cellular mass, as well as maximum volumetric yield, higher than those obtained in YNB. Besides, K. marxianus UFV-3 gave greater specific growth rates, greater cellular mass production and greater glycerol production in fermentation in permeated than in YNB. The fermentative parameters of ethanol production in permeated were greater in microaerobiosis and anaerobiosis than in aerobiosis. The fermentation in permeated – with initial lactose concentrations above 50 g L -1 – and reduced oxygen level (microaerobiosis and anaerobiosis) gave high ethanol maximum yield per substrate, corresponding to almost 100% of the theoretical value. The lactose consumption rate and ethanol production rata increased with the increase in the initial substrate concentration and the oxygen level decreased. The tolerance of the product (ethanol) was verified in permeated added to ethanol, in concentrations ranging from 5 to 80 g L -1 . In 50 gL -1 , K. marxianus UFV-3 maintained a growth close to 80% in relation to the control in anaerobic conditions and close to 60% under microaerobic and aerobic conditions.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-23T11:41:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 388479 bytes, checksum: 3f6213e3987bc7cbece94deab1128175 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-23T11:41:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 388479 bytes, checksum: 3f6213e3987bc7cbece94deab1128175 (MD5) Previous issue date: 2001-03-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A região codificadora do gene LAC4, que codifica a β-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. lactis, foi isolada do plasmídeo pLAC4-12, por meio da técnica de reação de polimerização em cadeia (PCR) com oligonucleotídeos iniciadores, que amplificam um fragmento de aproximadamente 3.000 pb. Com os objetivos de expressar e secretar a β- galactosidase, este fragmento foi clonado em um vetor de expressão e secreção pPIC9 do sistema de expressão de Pichia pastoris. A região codificadora LAC4 intacta e uma versão truncada foram fundidas em fase com a seqüência sinal de secreção do fator-α, sob controle do promotor AOX1. A hidrólise dos DNAs recombinantes obtidos com as enzimas de restrição apropriadas confirmou a clonagem da região codificadora LAC4 intacta nas orientações anti-senso e senso e da versão truncada no vetor pPIC9. Os clones foram linearizados e usados para transformar células eletrocompetentes de Pichia pastoris GS115 (His - e Mut + ). Colônias recombinantes foram isoladas e as inserções da região codificadora LAC4 intacta e truncada no genoma da levedura foram confirmadas por “PCR” com iniciadores específicos. Colônias recombinantes positivas foram cultivadas em glicerol e a expressão dos genes recombinantes foi induzida com metanol. Amostras foram coletadas periodicamente e o meio extracelular e a massa de células analisados quanto à atividade de β -galactosidase. Nenhum aumento na atividade de β - galactosidase foi observado perante o controle. Espera-se que a transformação de linhagens da levedura Mut - com os clones obtidos possa resultar na produção de uma proteína funcional. / The codins Kluyveromyces region marxianus of var. the lactis β-galactosidase was isolated LAC4 from gene, pLAC4-12, from by polimerase chain reaction (PCR) technique with primers that amplify a fragment of approximately 3.000 bp. Expression and secretion vector to expresse and secrete β-galactosidase, the intact and truncated LAC4 coding regions were fused in phase with the factor-α secretion signal sequence in the Pichia pastoris pPIC9. Appropriate restriction enzyme hydrolates confirmed the insertion of the intact LAC4 coding region in sense and antisense orientations, as well as its truncated version in to the pPIC9 vector. The clones were linearized and used to transform electrocompetent Pichia pastoris GS115 (His - e Mut + ) cells. Recombinant cells were isolated and the insertions of intact and truncated LAC4 coding regions in the yeast genome were confirmed by PCR with specific primers. Positive recombinant colonies were grown in glycerol and the expression of the heterologous genes was induced with methanol. Samples were periodically collected and the extracellular medium and cell mass were analyzed for β-galactosidase activity. No increase in β-galactosidase activity was observed over the control. The transformation of Mut - yeast cell lines with the clones is expectial to result in the production of a functional protein. / Dissertação importada do Alexandria

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-09-02T16:33:25Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 818272 bytes, checksum: b93f482c5170531d886647a1db1ab445 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T16:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 818272 bytes, checksum: b93f482c5170531d886647a1db1ab445 (MD5) Previous issue date: 2015-10-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A produção de etanol combustível pode ser aumentada pelo estabelecimento de novas tecnologias que utilizam subprodutos agroindustriais como matéria-prima. O soro de queijo é um subproduto que pode ser utilizado como substrato para a produção de etanol. A levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7735 é capaz de produzir etanol da lactose do soro de queijo, contudo concentrações de etanol superiores a 6% (v/v) afetam o crescimento dessa levedura. Apesar de esse ser o principal entrave para a utilização de Kluyveromyces marxianus em processos de produção de etanol, existem poucas informações sobre os efeitos e respostas adaptativas ao etanol nessa levedura. Recentemente, o transcriptoma dessa levedura cultivada sob estresse por etanol foi obtido, todavia os dados ainda não foram confirmados. Neste trabalho, o transcriptoma foi validado por meio da análise da expressão dos genes que codificam as enzimas transcetolase, hexoquinase, succinato desidrogenase e isocitrato lisase, respectivamente, por PCR em tempo real (qPCR). No intuito de compreender as respostas adaptativas de Kluyveromyces marxianus ao etanol, foi analisado o perfil metabólico desta levedura sob estresse por esse biocombustível. Os metabólitos intracelulares foram analisados por um sistema de cromatografia a gás (GC) acoplado a um espectrômetro de massa (MS). Posteriormente, os metabólitos identificados foram correlacionados com os dados do transcriptoma, também obtido sob estresse por etanol. A análise dos componentes principais indicou que o etanol provocou alterações no perfil metabólico da levedura. O aumento da abundância relativa dos metabólitos ácido nicotínico, alanina, valina, prolina, inositol, gentibiose, melibiose e lactulose parece estar associado às respostas adaptativas ao etanol em Kluyveromyces marxianus CCT 7735. Além disso, a análise do perfil metabólico, juntamente com as informações do transcriptoma, evidenciou que a via glicolítica é inibida pelo etanol e a via das pentoses fosfato e o ciclo do glioxilato são importantes no período de 4 h sob estresse por etanol. / The production of ethanol may be enhanced by setting up new technologies that use agroindustrial by-products as raw material. Cheese whey is a by-product that can be used as a substrate for the production of ethanol. The yeast Kluyveromyces marxianus CCT 7735 is able of producing ethanol from the lactose present in the cheese whey, concentrations higher than 6% (v/v) affect the growth of such yeast, however. Although being the main obstacle for using Kluyveromyces marxianus in ethanol production processes, there is little information on the effects and the adaptive responses to the ethanol on such yeast. Recently, the transcriptome of that yeast, cultivated under stress in the ethanol, has been obtained. Nevertheless, the data have not been confirmed yet. In this work, the transcriptome was validated by analysis of gene expression that encodes the enzym estransketolase, hexokinase, succinato desidrogenase and isocitratolisase, respectively by PCR in real time (qPCR). In order to understand the adaptive responses of Kluyveromyces marxianus to the ethanol, the metabolic profile of this yeast under ethanol stress was analysed. The intracellular metabolites were analysed by a gas chromatography system (GC) coupled with a mass spectrometer (MS). After that, the identified metabolites were correlated to data of transcriptome, which was also obtained under ethanol stress. The analysis of the principal components revealed that ethanol promoted changes in the metabolic profile of this yeast. The increase in the relative abundance of nicotinic acid, alanine, valine, proline, inositol, gentibiose, melibiose and lactulose may be associated with adaptive responses to ethanol in Kluyveromyces marxianus CCT 7735. In addition, the analysis of the metabolic profile together with information of transcriptome revealed that the glycolytic pathway is inhibited by the ethanol, and the phosphate pentose pathway and the glyoxylate pathway are important in the 4-hour period under ethanol stress.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-09-05T12:16:57Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1427163 bytes, checksum: 6b6a30efc47f3eda1d294da762ef5845 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T12:16:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1427163 bytes, checksum: 6b6a30efc47f3eda1d294da762ef5845 (MD5) Previous issue date: 2015-07-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leveduras floculantes são usadas em processos industriais pois representam uma estratégia simples e econômica para recuperar as células a partir do mosto fermentado. No entanto, as leveduras só conseguem expressar o fenótipo floculante em condições extremas, nas quais, a integridade da população esteja sendo afetada. Neste trabalho, foi descrita a construção de novas linhagens de Kluyveromyces marxianus CCT 7735 capazes de expressar constitutivamente um fenótipo floculante a partir da integração de DNA linear correspondente aos genes FLO1, FLO5, FLO9 e FLO10 de Saccharomyces cerevisiae BY4700. Todas as linhagens recombinantes mostraram fenótipo floculante a temperaturas de 40°C e 45°C. As linhagens recombinantes de K. marxianus CCT 7735 FLO1 e FLO9 mostraram um perfil similar de produção de etanol quando comparadas com K. marxianus CCT 7735 tipo selvagem. Estas linhagens recombinantes possuem um fenótipo floculante estável que proporciona uma vantagem sobre o tipo selvagem em relação ao uso em sistemas de fermentação em temperaturas elevadas. / Flocculent yeasts are used in industrial processes because is a simple and cost-effective strategy for cell recovery from fermentation mash. However, yeast only shows natural flocculent phenotype in extreme conditions, which makes it a complex phenotype. Here, we describe the construction of novel Kluyveromyces marxianus CCT 7735 strains expressing constitutive flocculent phenotype by linear DNA integration of FLO1, FLO5, FLO9 and FLO10 genes from Saccharomyces cerevisiae BY4700. All recombinant strains showed flocculation ability at 40°C and 45°C, K. marxianus CCT 7735 FLO1 and FLO9 strains showed similar ethanol production profile when compared to K. marxianus CCT 7735 wild type. These novel strains have special flocculent characteristics that provide an advantage over wild type for use in continuous ethanol fermentation systems at high temperatures.

LIMA, Ariosvana Fernandes. Imobilização de uma β-galactosidase produzida por Kluyveromyces lactis NRRL Y-1564 cultivada em soro de leite. 2012. 100 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, RENORBIO, Centro de Ciências, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-19T13:46:24Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-19T13:47:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T13:47:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) Previous issue date: 2012 / The enzymatic hydrolysis of lactose by β-galactosidase plays an important role in the processing of dairy products, such as the production of milk containing low concentrations of lactose, the prevention of crystallization in dairy products, and the use of galactosyltransferase for synthesizing galacto-oligosaccharides. In this context, this work aims to study how Kluyveromyces strains can be used to produce β-galactosidase from an agro-industrial by-product such as whey. The species studied were K. marxianus (LAMI CE 025, CCA 510, ATCC 36907) and K. lactis(NRRL Y-1564 and Y-4087). This work also aims to investigate the immobilization of the enzyme onto chitosan and determine its properties such as the optimal operating pH and temperature, the thermal stability of the enzyme, the thermal desnaturation constant, the half-life and the kinetic parameters Km and Vmax using ONPG as substrate of the enzyme β-galactosidase from Kluyveromyces lactis strain NRRL Y1564. K. marxianus LAMI CE 025 and CCA 510 did not consume lactose of the complex medium. The other strains were studied for β-galactosidase production in whey. The maximum enzymatic activity of 3.7 U/mL was achieved by K. lactis NRRL Y-1564 after 12h of fermentation at 180 rpm and 30°C, being selected as a microorganism for β-galactosidase production. The optimal pH for soluble β-gal activity was found to be 6.5 while the optimal pH for immobilized β-gal activity was found to be 7.0, while the optimal operating temperatures were 50°C and 37°C, respectively. The soluble and immobilized enzyme showed similar deactivation profiles at 40°C. For more than 200 min, both biocatalysts showed the same stability, retaining approximately 50 % of their initial activities. However, However, the immobilized enzyme showed an increased stability (8 times) at 50°C. In the lactose hydrolysis at 37°C and pH 7.0 by soluble enzyme was observed a conversion of 58.68% using a enzymatic charge of 2.0 U and 17.57% to 0.5 U. The immobilized enzyme was reused for 10 cycles, showing a good operational stability by retaining more than 74% of its initial activity. The immobilized enzyme retained 100% of its initial activity when it was stored at 4°C and pH 7.0 for a period of 93 days. The soluble β-galactosidase lost 9.4% of its initial activity when it was stored at the same conditions. According to these results, an alternative culture medium prepared by using deproteinized whey supplemented with yeast extract was efficiently used for the production of β-galactosidase through the cultivation of Kluyveromyces strains. Chitosan activated with glutaraldehyde is a suitable alternative low cost support for β-galactosidase immobilization, providing the immobilized enzyme with higher thermal, operational and storage stabilities in comparison with the soluble enzyme. / A hidrólise enzimática da lactose por β-galactosidase desempenha importante papel no processamento de produtos lácteos, sendo uma das aplicações à obtenção de leite com lactose reduzida para o consumo por indivíduos com intolerância à lactose, produção de cápsulas de enzimas para tratamento e a prevenção da cristalização em produtos lácteos. Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido visando a seleção de cepas de Kluyveromyces produtoras da enzima β-galactosidase usando um resíduo agroindustrial, o soro de leite como meio de cultivo. Inicialmente, realizou-se a seleção de espécies de Kluyveromyces capazes de produzir β- galactosidase utilizando lactose como fonte de carbono, em meio complexo e posteriormente em soro de leite (50 g/L de lactose) desproteinado e suplementado com extrato de levedura (1 g/L). Após definir a levedura que apresentava maior produção da enzima de interesse, estudou-se a produção e a viabilidade de imobilizá-la em quitosana. Após, caracterizou-se a enzima solúvel e imobilizada, consistindo na determinação do pH e temperatura ótimos, estabilidade térmica, estimativa dos parâmetros termodinâmicos e determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx usando como substrato ONPG. As cepas de K. marxianus LAMI CE025 e CCA 510 não consumiram lactose em meio complexo. As demais cepas foram avaliadas quanto à produção de β-galactosidase em soro de leite. A atividade máxima de 3,7 U/mL foi obtida por K. lactis NRRL Y-1564 após 12 h de cultivo a 180 rpm e 30ºC, sendo selecionada como micro-organismo para a produção da β-galactosidase. O pH ótimo para a enzima solúvel e imobilizada foram 6,5 e 7,0, respectivamente, e temperatura ótima de 50 e 37°C para a β-galactosidase solúvel e imobilizada, respectivamente. A enzima solúvel e imobilizada mostrou perfis semelhantes de desactivação a 40 ° C. Durante mais de 200 min, ambos os biocatalisadores mostrou a mesma estabilidade, retendo cerca de 50% da sua actividade inicial. Entretanto, a 50ºC, a enzima imobilizada mostrou uma maior estabilidade térmica, sendo 8 vezes mais estável. Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx foram 3,34 mM e 1,78 mM/min para a β-galactosidase solúvel comparado com 3,68 mM e 3,38 mM.min para a enzima imobilizada. Na hidrólise de lactose utilizando a enzima solúvel a 37ºC e pH 7,0 foi verificada uma conversão de 30,77% da lactose para a carga de 2,0 U e 9,8% usando 0,5 U. Após o 10º reciclo de uso, a enzima imobilizada reteve 74% da atividade inicial. A β-galactosidase imobilizada, estocada em tampão fosfato de potássio pH 7,0 a 4°C manteve 100% de sua atividade enzimática inicial no período de 93 dias. A β-galactosidase solúvel perdeu 9,4% de sua atividade inicial quando foi estocada nas mesmas condições. De acordo com os resultados obtidos, o soro de leite mostrou-se uma fonte de carbono alternativa para produção de β-galactosidase de K. lactis NRRL Y1564 e a quitosana ativada com glutaraldeído é um suporte alternativo adequado de baixo custo para imobilização da β-galactosidase, proporcionando a enzima imobilizada estabilidades térmicas, operacional e de armazenamento comparado com a enzima solúvel.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Neste trabalho, a enzima β-galactosidase, que catalisa a hidrÃlise da lactose em glicose e galactose, foi produzida pelo cultivo do micro-organismo Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 em soro de leite suplementado com extrato de levedura. A enzima à um metabÃlito intracelular, sendo a liberaÃÃo da enzima para o meio uma condiÃÃo essencial, por isso estudaram-se diferentes mÃtodos quÃmicos e mecÃnicos de extraÃÃo como, agitaÃÃo com pÃrolas de vidro, ruptura em ultrassom com pÃrolas de vidro, adiÃÃo de etanol e tolueno, observando tambÃm, seus efeitos na atividade enzimÃtica. Posteriormente, realizaram-se ensaios para estudar a influÃncia da temperatura (30, 34, 37 e 40 ÂC) na produÃÃo da enzima a partir do soro de queijo. Na extraÃÃo da enzima, o uso de esferas de vidro em vÃrtex foi o mÃtodo mais eficiente quando comparado com os outros avaliados. A enzima, nÃo sofreu inibiÃÃo ou desnaturaÃÃo quando incubadas com etanol, tolueno ou etanol-tolueno. A temperatura Ãtima de produÃÃo da enzima por K. lactis NRRL Y1564 foi 30 ÂC, com atividade enzimÃtica de 4418,37 U/g de cÃlulas em 12 h de fermentaÃÃo. A enzima produzida foi imobilizada em quitosana 2,0% m/v. Diferentes protocolos de ativaÃÃo usando glutaraldeÃdo, epicloridrina ou glicidol foram avaliados. Estudou-se tambÃm, o tempo de contato enzima-suporte (3, 5 e 10 horas) a fim de se obter um biocatalisador que apresentasse alto rendimento, atividade recuperada e tempo de meia-vida, visando a hidrÃlise da lactose em reator batelada e leito fixo. A influÃncia da temperatura e do pH na hidrÃlise da lactose foi avaliada, usando como substrato uma soluÃÃo sintÃtica (lactose 5,0% (m/v) e leite desnatado, contendo 4,3% m/v de lactose. O suporte que apresentou melhores resultados nos parÃmetros de imobilizaÃÃo foi a quitosana 2% reticulada com glutaraldeÃdo no tempo de imobilizaÃÃo de 5 horas. O biocatalisador produzido nesse estudo apresentou um fator de estabilidade de 17,37 vezes maior que a enzima solÃvel, com uma estabilidade de armazenamento de 100% quando armazenada a 4 ÂC por 90 dias. A temperatura Ãtima de hidrÃlise da lactose foi de 40 ÂC e o pH Ãtimo foi 7,0 . A conversÃo da lactose a 40 ÂC para este derivado (3,0 U/g) foi em mÃdia 53% em 10 ciclos (bateladas consecutivas). Em reator batelada, a conversÃo em glicose a partir da hidrÃlise da lactose, usando soluÃÃo sintÃtica, foi aproximadamente 86 % para a enzima solÃvel (3,8 U/mL) e 83 % para a enzima imobilizada (3,8 U/g). A conversÃo obtida na hidrÃlise do leite desnatado foi de 17 % para a enzima solÃvel e 20 % para a enzima imobilizada. / In this work, the enzyme β-galactosidase which catalyzes the hydrolysis of lactose to glucose and galactose, was produced by cultivating the micro-organism Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 in whey supplemented with yeast extract. The enzyme is an intracellular metabolite, the release enzyme is very important, therefore were studied various chemical and mechanical methods of extraction and stirring with glass beads, sonication, addition of ethanol and toluene, noting also their effects on enzymatic activity. Subsequently, trials were carried out to study the influence of temperature (30, 34, 37 and 40  C) in the production of the enzyme from the cheese whey. In the enzyme extraction, using glass beads by a vÃrtex was more efficient method compared to others evaluated. The enzyme not presented inhibited or denatured when incubated with ethanol, toluene or ethanol-toluene. The optimum temperature for enzyme production by K. lactis NRRL Y1564 was 30 ÂC with enzymatic activity of 4418.37 U/g of cells at 12 h of fermentation. The enzyme produced was immobilized on chitosan 2.0% w/v. Different activation protocols using glutaraldehyde, epichlorohydrin or glycidol were evaluated. Was also studied, the contact time the enzyme-carrier (3, 5, and 10 hours) to obtain a biocatalyst to produce high yield, recovered activity and half-life in order to hydrolysis of lactose in batch reactor and fixed bed. The influence of temperature and pH on the hydrolysis of lactose was evaluated using as substrate a synthetic solution (lactose 5.0% (w/v) in potassium phosphate buffer 100 mM with 0.1 mM MnCl2) and skimmed milk containing 4.3% w/v lactose. The support shows better results in the parameters of immobilization was chitosan 2% actived with glutaraldehyde and contact time of 5 hours. The biocatalyst produced in this study showed a stability factor of 17.37 and a storage stability of 100% when stored at 4 ÂC for 90 days. Temperature optimum hydrolysis of lactose was 40 ÂC and the optimal pH 7.0. The conversion of lactose to 40 ÂC for this derivative (3.0 U/g) was on average 53% in 10 cycles (consecutive batches). In batch reactor, the conversion to glucose by the hydrolysis of lactose using synthetic solution was approximately 86% for the soluble enzyme (3.8 U/mL) and 83% of the immobilized enzyme (3.8 U/g). The conversion obtained in the hydrolysis of skim milk was 17% for the soluble enzyme and 20% for the immobilized enzyme.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2827_1.pdf: 3255075 bytes, checksum: 22005ee118cfc8ca27010124cd458070 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Leveduras vêm sendo utilizadas como sistemas de expressão para produção de proteínas de interesse biotecnológico. Dentre as diversas aplicações das proteínas heterólogas, as produzidas com finalidade terapêutica e para diagnóstico clínico vêm recebendo grande destaque, como por exemplo, a lectina frutalina e a oncoproteína E7 do Papilomavírus Humano (HPV). A frutalina, lectina extraída das sementes da fruta-pão, tem sido descrita como importante ferramenta no diagnóstico do câncer devido ao seu tropismo com células tumorais. Enquanto, a oncoproteína viral do HPV, E7, por ser encontrada em células tumorais relacionadas à infecção pelo HPV, torna-se um importante alvo para o desenvolvimento de vacinas profiláticas e terapêuticas contra esta infecção. Neste trabalho utilizamos as leveduras Pichia pastoris KM71H e Pichia pastoris GS115 como sistemas de expressão para a produção das proteínas frutalina e E7 do HPV16, respectivamente. A influência da fonte de carbono e do estresse iônico na produção da enzima β-galactosidase pela Kluyveromyces lactis DSM 3795 foi avaliada em diferentes condições de cultivo. Neste trabalho os níveis de frutalina recombinante (13,4 mg.L-1), obtidos pelo processo de batelada alimentada, foi 4 vezes maior que em testes com frascos aerados e a suplementação com elementos traços permitiu o aumento de 2.5 vezes na produção da proteína recombinante. Enquanto, o gene de E7 do HPV16 foi corretamente clonado e integrado ao genoma da P.pastoris GS115, sendo produzido 218,9mg.L-1 da proteína E7 com o peso molecular de 27KDa. A avaliação da influência da fonte de carbono e do estresse iônico na atividade da enzima β-galactosidase pela K. lactis DSM 3795 permitiu selecionar a lactose como a fonte de carbono ideal, pois favoreceu maior atividade específica da enzima (271,0 U.mg-1). Enquanto que, os cátions Na+, K+, Mg2+ potencializaram a atividade da enzima (410,4; 440,1; and 734.71 U.mg-1, respectivamente), o Ca2+ inibiu parcialmente a produção da β-galactosidase. Por fim, apesar da P. pastoris ter se mostrado um sistema eficiente para a produção de proteína heterólogas, ela ainda apresenta algumas limitações. Dessa maneira, o desenvolver estratégias que permitam a otimização de vetores para a produção dessas proteínas, representa um importante alvo no desenvolvimento de produtos para o diagnóstico, prevenção e tratamento do câncer

Dissertação(mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, 2009. / Submitted by Caroline Silva (krol_bilhar@hotmail.com) on 2012-09-04T19:55:29Z No. of bitstreams: 1 dissertacao.pdf: 1083000 bytes, checksum: b9f5425b7035edb056452ec4c6f3a031 (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-09-20T18:48:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertacao.pdf: 1083000 bytes, checksum: b9f5425b7035edb056452ec4c6f3a031 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-20T18:48:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao.pdf: 1083000 bytes, checksum: b9f5425b7035edb056452ec4c6f3a031 (MD5) Previous issue date: 2009 / A hidrólise enzimática da lactose pela enzima B-galactosidase, formando glicose e galactose, tem se mostrado um dos métodos mais promissores para remover a lactose do leite, facilitando sua utilização em produtos lácteos. Portanto, a seleção de microrganismos produtores dessa enzima, bem como a utilização de co-produtos industriais como fonte alternativa de nutrientes, tem grande importância na maximização da produção da mesma, ocasionando uma contribuição ambiental e econômica em bioprocessos. Nesta dissertação, foi realizada a seleção de microrganismos produtores de B-galactosidase e a enzima foi produzida em meio contendo soro de leite e água de parboilização de arroz, sendo a maximização da produção realizada utilizando técnicas de planejamento experimental e análise de superfícies de resposta. Selecionou-se dentre cepas isoladas de produtos lácteos e de cepas de Kluyveromyces de bancos de cultura a linhagem com maiores atividades da enzima utilizando meio de cultura contendo: 100 g.L-1 de lactose; 17 g.L-1 de extrato levedura e 8,8 g.L-1 de sulfato de amônio. O microrganismo Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 se destacou como melhor produtor dentre os microrganismos avaliados, apresentando atividade enzimática de 9 U.mL-1 em 24 h. Este microrganismo foi selecionado para otimização do meio de cultura. Um planejamento experimental fracionário 26-2 IV foi utilizado para determinar as variáveis que mais influenciavam na produção da enzima. Os parâmetros estudados foram: concentrações de lactose; de extrato de levedura; de peptona; de água de parboilização de arroz; de sulfato de amônio e o pH inicial do meio. De acordo com os resultados, as concentrações de lactose, de extrato de levedura, de peptona e de sulfato de amônio foram selecionadas para serem utilizadas num planejamento experimental completo 24. As ótimas condições para uma maior atividade enzimática foram: concentração de lactose de 120 g.L-1; concentração de extrato de levedura de 5 g.L-1; concentração de peptona de 15 g.L-1 e concentração de sulfato de amônio de 15 g.L-1, a 30 0C e 180 rpm, após 24 h de cultivo em agitador rotatório . A atividade enzimática alcançada foi 10,4 U.mL-1. / Lactose is a disaccharide that, due to its low solubility and its weak sweetening capacity, has its utility limited in food industry, besides existing cases of its intolerance or its bad absorption. The enzymatic hydrolysis of lactose by the enzyme β-galactosidase, forming glucose and galactose, has proved to be one of the most promising methods to remove lactose from milk. In this study the β-galactosidase production from Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 by submerged cultivation was optimizated using techniques of experimental design and analysis of response surfaces. A selection amongst strains isolated and from cultures collection of genus Kluyveromyces, the greatest enzyme producer, through cultivation in agitated flasks, using lactose from whey as carbon source. The microorganism Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 was a very good enzyme producer, showing 9 U.mL-1 of enzymatic activity in 24 h. This microorganism was selected for the optimization of the culture medium for the production of β-galactosidase. A fractional experimental design 26-2 was used to determine the variables that influenced more in the production of the enzyme. The studied parameters were lactose concentrations, extract yeast, peptone, parboiled rice effluents, ammonium sulphate and initial pH, being that all showed significant effect in the production of the enzyme. In accordance with these results, the concentrations of lactose, extract yeast, peptone and ammonium sulphate were selected to be used in a complete experimental design 24. The optimum conditions for a high enzymatic activities were: 120 g.L-1 of lactose, 5 g.L-1 of yeast extract, 15 g.L-1 of peptone and 15 g.L-1 of ammonium sulphate. The enzymatic activity in these conditions was 10.4 U.mL-1.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-07-30T13:09:39Z No. of bitstreams: 1 Patricia de Oliveira Leite Farias.pdf: 2191536 bytes, checksum: 7dcb59d0b9807994dffa19a1d1a70acb (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-30T13:09:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Patricia de Oliveira Leite Farias.pdf: 2191536 bytes, checksum: 7dcb59d0b9807994dffa19a1d1a70acb (MD5) Previous issue date: 2015-08-28 / Cheese whey is the aqueous portion milk rich in lactose, which separates the curd during cheese manufacture which makes it of great importance effluent dairy industries. With the rapid advances in microbial biotechnology, it is considered good alternative to its use, as a substrate inexpensive and available in obtaining β-galactosidase, which is widely used for pharmaceutical and food industries. The sources most widely used for its production are yeasts, as the species Kluyveromyces lactis and Kluyveromyces marxianus. The objective of this study was to evaluate the feasibility of using the cheese whey, in isolation or in combination with other carbon sources for the production of β-galactosidase enzyme, using Kluyveromyces lactis URM 6684, using the planning simplex centroid mixture. 9 fermentations were carried out using three sources of carbon: cheese whey, lactose and sucrose PA PA. During the study it was determined biomass, pH and after cell disruption, enzymatic activity. With regard to biomass, medium with sucrose had better results E5 (7,8 g / L), E8 (6,8 g / L) and E6 (6,1 g / L). The enzyme activity is presented to best results in medium with cheese whey: E1 (0,65 U / ml), E4 (0,33 U / ml) and E6 (0,40 U / ml). Statistical analysis showed that the enzyme activity showed the best fit to the quadratic and cubic models, which presented the best fit quadratic and cubic models, with coefficients, RA2 = 0.86 and RA2 = 0.93. The results showed that whey was presented as a suitable source of carbon and low cost for production of the enzyme, adding more value to its use, and reduce the costs of production of β-galactosidase enzyme, increasing its availability commerce more affordable and enabling their application in the dairy food industry. / O soro de leite ou de queijo é a porção aquosa do leite, rico em lactose, que se separa do coágulo durante a fabricação de queijos o que o torna efluente de grande relevância das indústrias de laticínios. Com os rápidos avanços em biotecnologia microbiana, considera-se boa alternativa para sua utilização, por ser um substrato barato e disponível, na obtenção de β-galactosidase, que é amplamente utilizada pelas indústrias farmacêutica e de alimentos. As fontes mais utilizadas para sua produção são as leveduras, como as espécies Kluyveromyces lactis e Kluyveromyces marxianus. O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade do uso do soro de queijo, de forma isolada ou combinada a outras fontes de carbono, para produção da enzima β-galactosidase, utilizando Kluyveromyces lactis URM 6684, empregando o planejamento de mistura simplex centroide. Foram realizadas 9 fermentações utilizando três fontes de carbono: soro de queijo, lactose PA e sacarose PA. Durante o estudo foram determinados valores de biomassa, pH e, após rompimento celular, atividade enzimática. Com relação à biomassa, meios com presença de sacarose obtiveram melhores resultados: E5(7,8 g/L), E8 (6,8 g/L) e E6 (6,1 g/L). A atividade enzimática apresentou-se com melhores resultados em meios com presença de soro de queijo: E1(0,65 U/mL), E4 (0,33 U/mL) e E6 (0,40 U/mL). A análise estatística evidenciou que a atividade enzimática apresentou melhor ajuste aos modelos quadrático e cúbico, a qual apresentou melhor ajuste aos modelos quadrático e cúbico, com coeficientes, RA2, de 0,86 e 0,93. Os resultados encontrados demonstraram que o soro de queijo apresentou-se como uma fonte de carbono adequada e de baixo custo para produção da enzima, agregando maior valor para seu uso, além de reduzir os custos da produção da enzima β-galactosidase, aumentando sua disponibilidade no comércio a preços mais acessíveis e viabilizando sua aplicação na indústria de alimentos derivados de leite.