O presente trabalho teve como principal objetivo selecionar uma linhagem termotolerante de Kluyveromyces marxianus e avaliar a sua aplicação em processos de produção de etanol a partir da celulignina de palha de arroz. Inicialmente, foram avaliadas oito diferentes linhagens de K. marxianus em meio semissintético contendo 50 g/L de glicose sob temperatura de 45 °C. De acordo com os principais parâmetros fermentativos obtidos, a linhagem K. marxianus NRRL Y-6860 foi selecionada e o efeito da oxigenação do meio sobre os parâmetros fermentativos desta levedura foi realizado de acordo com um planejamento experimental 22. Os resultados revelaram que a produção de etanol foi favorecida nas menores condições de agitação e aeração estudadas (100 rpm e relação Vfrasco/Vmeio de 2,5) sendo obtido um valor de conversão de glicose em etanol (YP/S) de 0,44 g/g e produtividade volumétrica em etanol (QP) de 3,63 g/L.h. Nestas condições, K. marxianus NRRL Y-6860 foi também capaz de fermentar elevada concentração de glicose (112 g/L), apresentando valores de YP/S = 0,42 g/g e QP = 3,24 g/L.h. Numa segunda etapa, ensaios de sacarificação da celulignina (8% m/v) permitiram definir a carga de Cellubrix (25 FPU/g) e Novozyme 188 (25 UI/g) as quais promoveram um rendimento de hidrólise de aproximadamente 50 % em 12 horas. A celulignina foi obtida após o pré-tratamento da palha de arroz com H2SO4 diluído e apresentou a seguinte composição (g/100g de matéria seca): celulose (54,9), hemicelulose (7,9), lignina (24,9) e cinzas (8,0). Para os ensaios de sacarificação e fermentação da celulignina com a levedura K. marxianus NRRL Y-6860 duas estratégias foram avaliadas: 1) sacarificação e fermentação em separado (SHF), com e sem inativação das enzimas e 2) sacarificação e fermentação simultânea (SSF) em que o inóculo e as enzimas foram adicionados no início do processo. Os resultados revelaram que na estratégia SHF a inativação das enzimas antes da inoculação não influenciou o desempenho fermentativo da levedura. Além disso, o emprego de um maior teor de celulignina (12 % m/v) proporcionou um ganho de 42 % na produtividade total do processo (QPT) em relação ao teor de 8 % (m/v), atingindo o valor de 0,97 g/L.h. O emprego da estratégia SSF a partir de 8 % (m/v) de celulignina permitiu um incremento de 177 % e 287 % nos valores de QPT quando comparados ao processo SHF com 12 e 8 % de celulignina (m/v), respectivamente. Ensaios de SSF com Saccharomyces cerevisiae mostraram que para ambas as temperaturas avaliadas (30 °C ou 45 °C) a termotolerante K. marxianus NRRL Y-6860 mostrou-se superior com relação a produtividade total do processo. Com os resultados do presente trabalho pode-se concluir que a levedura termotolerante K. marxianus NRRL Y-6860 é um micro-organismo em potencial para produção de etanol celulósico a partir da estratégia SSF devido aos elevados valores de produtividade volumétrica (QPT = 2,69 g/L.h) obtidos a partir da celulignina de palha de arroz. / This work aimed to select a thermotolerant strain of Kluyveromyces marxianus and evaluate its application on ethanol production by using rice straw cellulignin. Initially, were evaluated eight different strains of K. marxianus on semi-synthetic media containing 50 g/L of glucose at 45 °C. According to the main fermentation parameters, the strain K. marxianus NRRL Y-6860 was selected and the effect of oxygenation on ethanol production by this yeast was investigated through a 22 factorial design. The best results of ethanol yield factor (YP/S = 0.44 g/g) and ethanol volumetric productivity (QP = 3.63 g/L.h) were found at the lowest agitation and aeration conditions (100 rpm and 2.5 Vflask/Vmedium ratio) employed. Under this conditions, K. marxianus NRRL Y-6860 was also able to ferment at high glucose concentration (112 g/L), with values of YP/S = 0.42 g/g and QP = 3.24 g/L.h. In a second step, the effect of Cellubrix loading and its supplementation with Novozyme 188 on the cellulignin saccharification were evaluated. The results showed that the highest hydrolysis yield (50 %) was attained when a load of Cellubrix (25 FPU/g dry matter) and Novozyme 188 (25 IU/g dry matter) was used. The cellulignin obtained from dilute sulfuric acid pretreatment of rice straw showed the following composition (g/100g dry matter): cellulose (54.9), hemicellulose (7.9), lignin (24.9) and ash (8.0). For the studies of cellulignin saccharification and fermentation with K. marxianus NRRL Y-6860 two strategies were evaluated: 1) Separate Hydrolysis and Fermentation (SHF), with and without inactivation of enzymes, which inoculum was added after the hydrolysis step and 2) Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF), which inoculum and enzymes were added at the beginning of the process. The results revealed that the enzyme inactivation step prior to inoculation in SHF did not influence the yeast\'s fermentation performance. In addition, the use of a higher loading of cellulignin (12 % w/v) increased the overall ethanol productivity (QPT) in 42 %, reaching a value of 0.97 g/L.h as compared to the loading of 8 % (w/v). The SSF process from 8 % (w/v) of cellulignin increased the values of QPT in 177 % and 287 % when compared to SHF loading of 12 and 8 % (w/v), respectively. By using Saccharomyces cerevisiae in SSF process under different temperatures (30 °C or 45 °C) the overall ethanol productivity was lower in relation with the thermotolerant K. marxianus NRRL Y-6860. Based on the experimental results of this work, it can be concluded that K. marxianus NRRL Y-6860 herein selected represents a potential microorganism to application on ethanol production from lignocellulosic materials in SSF process due to its high fermentative potential at elevated temperatures.

O presente trabalho teve como principal objetivo selecionar uma linhagem termotolerante de Kluyveromyces marxianus e avaliar a sua aplicação em processos de produção de etanol a partir da celulignina de palha de arroz. Inicialmente, foram avaliadas oito diferentes linhagens de K. marxianus em meio semissintético contendo 50 g/L de glicose sob temperatura de 45 °C. De acordo com os principais parâmetros fermentativos obtidos, a linhagem K. marxianus NRRL Y-6860 foi selecionada e o efeito da oxigenação do meio sobre os parâmetros fermentativos desta levedura foi realizado de acordo com um planejamento experimental 22. Os resultados revelaram que a produção de etanol foi favorecida nas menores condições de agitação e aeração estudadas (100 rpm e relação Vfrasco/Vmeio de 2,5) sendo obtido um valor de conversão de glicose em etanol (YP/S) de 0,44 g/g e produtividade volumétrica em etanol (QP) de 3,63 g/L.h. Nestas condições, K. marxianus NRRL Y-6860 foi também capaz de fermentar elevada concentração de glicose (112 g/L), apresentando valores de YP/S = 0,42 g/g e QP = 3,24 g/L.h. Numa segunda etapa, ensaios de sacarificação da celulignina (8% m/v) permitiram definir a carga de Cellubrix (25 FPU/g) e Novozyme 188 (25 UI/g) as quais promoveram um rendimento de hidrólise de aproximadamente 50 % em 12 horas. A celulignina foi obtida após o pré-tratamento da palha de arroz com H2SO4 diluído e apresentou a seguinte composição (g/100g de matéria seca): celulose (54,9), hemicelulose (7,9), lignina (24,9) e cinzas (8,0). Para os ensaios de sacarificação e fermentação da celulignina com a levedura K. marxianus NRRL Y-6860 duas estratégias foram avaliadas: 1) sacarificação e fermentação em separado (SHF), com e sem inativação das enzimas e 2) sacarificação e fermentação simultânea (SSF) em que o inóculo e as enzimas foram adicionados no início do processo. Os resultados revelaram que na estratégia SHF a inativação das enzimas antes da inoculação não influenciou o desempenho fermentativo da levedura. Além disso, o emprego de um maior teor de celulignina (12 % m/v) proporcionou um ganho de 42 % na produtividade total do processo (QPT) em relação ao teor de 8 % (m/v), atingindo o valor de 0,97 g/L.h. O emprego da estratégia SSF a partir de 8 % (m/v) de celulignina permitiu um incremento de 177 % e 287 % nos valores de QPT quando comparados ao processo SHF com 12 e 8 % de celulignina (m/v), respectivamente. Ensaios de SSF com Saccharomyces cerevisiae mostraram que para ambas as temperaturas avaliadas (30 °C ou 45 °C) a termotolerante K. marxianus NRRL Y-6860 mostrou-se superior com relação a produtividade total do processo. Com os resultados do presente trabalho pode-se concluir que a levedura termotolerante K. marxianus NRRL Y-6860 é um micro-organismo em potencial para produção de etanol celulósico a partir da estratégia SSF devido aos elevados valores de produtividade volumétrica (QPT = 2,69 g/L.h) obtidos a partir da celulignina de palha de arroz. / This work aimed to select a thermotolerant strain of Kluyveromyces marxianus and evaluate its application on ethanol production by using rice straw cellulignin. Initially, were evaluated eight different strains of K. marxianus on semi-synthetic media containing 50 g/L of glucose at 45 °C. According to the main fermentation parameters, the strain K. marxianus NRRL Y-6860 was selected and the effect of oxygenation on ethanol production by this yeast was investigated through a 22 factorial design. The best results of ethanol yield factor (YP/S = 0.44 g/g) and ethanol volumetric productivity (QP = 3.63 g/L.h) were found at the lowest agitation and aeration conditions (100 rpm and 2.5 Vflask/Vmedium ratio) employed. Under this conditions, K. marxianus NRRL Y-6860 was also able to ferment at high glucose concentration (112 g/L), with values of YP/S = 0.42 g/g and QP = 3.24 g/L.h. In a second step, the effect of Cellubrix loading and its supplementation with Novozyme 188 on the cellulignin saccharification were evaluated. The results showed that the highest hydrolysis yield (50 %) was attained when a load of Cellubrix (25 FPU/g dry matter) and Novozyme 188 (25 IU/g dry matter) was used. The cellulignin obtained from dilute sulfuric acid pretreatment of rice straw showed the following composition (g/100g dry matter): cellulose (54.9), hemicellulose (7.9), lignin (24.9) and ash (8.0). For the studies of cellulignin saccharification and fermentation with K. marxianus NRRL Y-6860 two strategies were evaluated: 1) Separate Hydrolysis and Fermentation (SHF), with and without inactivation of enzymes, which inoculum was added after the hydrolysis step and 2) Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF), which inoculum and enzymes were added at the beginning of the process. The results revealed that the enzyme inactivation step prior to inoculation in SHF did not influence the yeast\'s fermentation performance. In addition, the use of a higher loading of cellulignin (12 % w/v) increased the overall ethanol productivity (QPT) in 42 %, reaching a value of 0.97 g/L.h as compared to the loading of 8 % (w/v). The SSF process from 8 % (w/v) of cellulignin increased the values of QPT in 177 % and 287 % when compared to SHF loading of 12 and 8 % (w/v), respectively. By using Saccharomyces cerevisiae in SSF process under different temperatures (30 °C or 45 °C) the overall ethanol productivity was lower in relation with the thermotolerant K. marxianus NRRL Y-6860. Based on the experimental results of this work, it can be concluded that K. marxianus NRRL Y-6860 herein selected represents a potential microorganism to application on ethanol production from lignocellulosic materials in SSF process due to its high fermentative potential at elevated temperatures.

Neste trabalho foi estudadaaproduÃÃo de etanol por processos de SacarificaÃÃo e FermentaÃÃo SimultÃneas (SSF) usando o bagaÃo de caju prÃ-tratado com Ãcido-Ãlcali (CAB-OH) como matÃria-prima. Nos processos de SSF foi utilizada a levedura KluyveromycesmarxianusATCC36907e o complexo enzimÃtico Celluclast 1.5L (30 FPU.gcelulose-1). Os experimentos foram conduzidos em Erlenmeyers de 250 mL com 100 mL de meio SSF (tampÃo citrato de sÃdio 50 mMapH 4,8; suplementado com 1 g/L de extrato de levedura e 1 g/L de sulfato de amÃnio, e a carga de CAB-OH desejada em %m/V), a concentraÃÃo inicial de cÃlulas de 5 g/L, temperatura de 40ÂC e rotaÃÃo de 150 rpm. Primeiramente, um processo em batelada foi realizado para avaliar a necessidade de suplementaÃÃo com a enzima celobiase (NS50010âNovozymes) com atividade de 60 CBU/gcelulose-1. O processo SSF conduzido com a suplementaÃÃo decelobiaseobteveuma maior produÃÃo mÃxima de etanol (30 g/L) e maior eficiÃncia (93%) em relaÃÃo ao nÃo-suplementado, sendo os estudos posteriores conduzidos com as enzimas celulases e celobiases. Em seguida, realizou-se o estudo da avaliaÃÃo da carga de CAB-OH (7,5, 10, 15 e 20 %m/V), em processos sem prÃ-sacarificaÃÃo (SSF) e comprÃ-sacarificaÃÃo(PSSF). A maiorconcentraÃÃo de etanol (58 g/L)ocorreu nos processos SSF com carga de 15%, sendo esse tambÃm o de maior produtividade, e PSSF com carga de 20%, nÃo apresentando diferenÃa significativa na produÃÃo mÃxima de etanol entre os dois processos. No entanto, osprocessos SSF e PSSFusando 10% CAB-OH apresentaram a maioreficiÃncia (98%)e rendimento global em etanol do estudo (40gEtanol/KgCAB).Posteriormente, foram realizadas estratÃgias de alimentaÃÃo, em conjunto com processos SSF, de forma a eliminar efeitos inibitÃrios presentes em processos em batelada com elevadas cargas de sÃlidos. Foram avaliadas estratÃgias de alimentaÃÃo de substrato: duas com carga inicial de 10% e atingindo 20% (uma com duas alimentaÃÃes e outra com quatro) e uma com carga inicial de 15% e final de 25% (quatro alimentaÃÃes). Todos os processos, exceto os de carga de 7,5%, apresentaram %Vetanol/VsoluÃÃo acima de 4% e os processos em batelada alimentada atingiram a maior produÃÃo de etanol do estudo(68g/L). Os processos com carga inicial de 10 % e final de 20 % apresentaram uma maior eficiÃncia (81 %), porÃm o processo que apresentou maior produtividade foi com carga inicial de 15% e final de 25% (2,4 g/L.h), e tambÃm rendimento global em etanol elevado (32 gEtanol/KgCAB), de forma que esse foi o processo com melhores resultados do presente estudo. Com isso, o CAB-OH se mostrou um substrato promissor para a produÃÃo de etanol por processos SSF e PSSF, conduzidosem batelada e batelada alimentada, utilizando elevadas cargas de sÃlidos. / In this work was studied ethanol production from cashew apple bagasse after acid followed by alkali pretreatment (CAB-OH) using theSimultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) processes. In SSF process was utilized the yeast Kluyveromycesmarxianus ATCC36907and the enzymatic complex Celluclast1.5L (30 FPU.gcellulose-1). The assays were conducted in 250mL Erlenmeyer flasks with 100mL of culture medium (sodium citrate buffer 50mM pH 4.8, supplemented with yeast extract 1 g/L and ammonium sulfate 1 g/L and the desired bagasse concentration in %w/v), the initial cells concentration was 5 g/L, the temperature was 40ÂC and 150rpm of rotation. First, a batch process was performed to evaluate the enzymatic supplementation of culture medium with cellobiase (NS50010-Novozymes) with an activity of 60 CBU.gcellulose-1. The supplemented process with cellobiase had the highest ethanol production (30 g/L) and ethanol efficiency (93%) than the non-supplemented and the subsequent studies were performed with supplementation. After, was realized the evaluation of CAB-OH load (7.5, 10, 15 e 20%w/V) in processes with (PSSF) and without pre-saccharification (SSF). The highest ethanol production corresponded to SSF processes with bagasse load of 15%, this being also the highest productivity, and PSSF with bagasse concentration of 20% and these processes were statistic similar within the standard deviation of the samples in relation to ethanol production. However, the SSF and PSSF processes with 10% of dry matter had the highest efficiency (98%) and yield feedstock in ethanol of study (32gEthanol/KgCAB). After, feeding strategies with SSF processes have been made to eliminate inhibitory effects in batch processes with high loadings of solids. There were evaluated feeding strategies: two with initial CAB-OH load of 10% and 20% in the end (a strategy with two feeds and one with four) and another with initial load of 15% and final of 25% (with four feeds). All processes, with the exception of 7.5% load, had %VethanolVsolution-1 above 4% and the fed batch processes reached a similar ethanol production (68 g/L), towering in 17% the ethanol concentration compared to batch process with load of 20%. All processes, with the exception of 7.5 % load, had %Vethanol/Vsolution above 4% and the fed batch processes reached the highest ethanol production of study (68 g/L). The processes with initial load of 10 % and final of 20 % reached a higher efficiency (81 %), but the process that reached the highest productivity was the process with the initial load of 15 % and final of 25 % (2,4 g/L.h), and high ethanol global yield too (32 gEthanol/KgCAB), so this process achieved the best results of present study. Based on the results presented, CAB-OH showed a promising substrate for ethanol production by SSF and PSSF processes, conducted by batch and fed batch method, using high loadings of solids.

Orientador: Ranulfo Monte Alegre / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-05T19:04:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ogrodowski_Rodenei_D.pdf: 1087647 bytes, checksum: 05b46b0950dd59d53fe5d62523de3047 (MD5) Previous issue date: 2006 / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

O presente trabalho teve como principal objetivo avaliar o potencial de linhagens termotolerantes da espécie Kluyveromyces marxianus para produção de xilitol a partir do hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz. Foi também objetivo deste trabalho estabelecer condições de tratamento alcalino diluído (desacetilação) previamente ao processo de hidrólise ácida da palha de arroz com vistas à obtenção de um hidrolisado com menor toxicidade. Numa primeira etapa do trabalho, foram avaliadas 4 cepas de K.marxianus (Y-6860, Y-6373, Y- 265 e Y-8287) quanto a produção de xilitol em meio semidefinido variando a temperatura de 30 a 40 °C. Com base nos resultados obtidos, foi selecionada a linhagem Y-6373, que apresentou os maiores valores de conversão de xilose em xilitol (YP/S = 0,70 g/g) e produtividade volumétrica (QP = 0,60 g/L.h) na temperatura de 40 °C. Esta linhagem foi então utilizada nos ensaios fermentativos a partir dos hidrolisados obtidos. Para obtenção do hidrolisado hemicelulósico, a palha de arroz foi primeiramente submetida a um tratamento alcalino, em escala de frascos Erlenmeyer, onde se avaliou o efeito da temperatura (50 - 70 °C) e da carga de NaOH (20 - 80 mg/g de biomassa) sobre a remoção de grupos acetil. De acordo com o modelo obtido, a máxima remoção de acetil (97,2 ± 3,4%) pôde ser alcançada empregando 70 °C; 80 mg de NaOH /g de palha por 45 min. Nestas condições do processo, o modelo previu remoções de lignina e de cinzas de 41,3 ± 4,3 e 62,3 ± 5,3%, respectivamente, sem perda significativa das frações açucaradas. Em maior escala (reator de 50L), o tratamento alcalino mostrou resultados de remoção de acetil próximos aos previstos pelo modelo. Com a palha desacetilada, foram então realizados ensaios de hidrólise ácida variando a concentração de H2SO4 (0,5 - 1,5% m/v) e tempo de residência (30 - 90 min) visando estabelecer as condições que maximizem a eficiência de hidrólise da hemicelulose (EHH). Nas condições otimizadas, (H2SO4 1,0% m/v e 85 minutos) foi alcançada uma EHH de 75% em frascos e de 76% em reator. Os resultados referentes à fermentabilidade do hidrolisado empregando a K. marxinuas Y-6373 demonstraram que independentemente da suplementação nutricional, a conversão de xilose em xilitol foi elevada ~ 0,87 g/g e superior a obtida em meio semidefinido contendo apenas xilose como fonte de carbono, porém os valores de produtividade volumétrica foram cerca de 6,5 vezes inferiores ~ 0,13 g/L.h, devido a baixa eficiência de utilização da xilose (XC) ~ 20%, após 72 h de cultivo. A fermentabilidade dos hidrolisados foi melhorada após o procedimento de destoxificação e os resultados variaram com o método empregado. Os melhores resultados foram obtidos em hidrolisado tratado com CaO (YP/S= 0,74 g/g; QP = 0,32 g/L.h e XC =92%). Neste trabalho, foi também demonstrado o efeito repressivo da glicose sobre a assimilação e conversão da xilose em xilitol por K. marxianus, uma vez que em meio semidefinido simulando as concentrações de xilose e glicose presentes no hidrolisado, os valores de XC e YP/S foram reduzidos em torno de 40%. De uma forma geral, conclui-se que a linhagem de K. marxianus selecionada neste estudo, apresenta grande potencial para a produção de xilitol em elevadas temperaturas, porém são ainda necessários estudos para otimizar as condições de produção de xilitol a partir de hidrolisados hemicelulósicos. / In this work the potential of thermotolerant strains of Kluyveromyces marxianus to produce xylitol from rice straw hemicellulosic hydrolyzed was evaluated. In addition, were also established conditions of diluted alkaline treatment (deacetylation) previously to the process of rice straw acid hydrolysis, aiming to decrease the toxicity of the hydrolysate . Initially, four yeast strains of K.marxianus (Y-6860, Y-6373, Y-2265 e Y-8287) were evaluated regarding to the xylitol production in a semi-defined medium, varying the temperature from 30 to 40 ºC. From these results, the strain Y-6373 was selected, due to high values of xylose conversion into xylitol (YP/S = 0.70 g/g) and volumetric productivity (QP = 0.60 g/L.h) at 40ºC. This strain was thus used in the fermentative tests employing the hemicellulosic hydrolysate obtained. The hemicellulosic hydrolysate of rice straw was prepared in two steps; firstly the rice straw was submitted to the alkaline treatment, which was carried out in Erlenmeyer flasks scale. In these experiments, the effects of temperature from 50 to 70 °C and NaOH load from 20 to 80 mg/g biomass on the removal of acetyl groups were evaluated. According to the model obtained, the maximum acetyl removal (97.2 ±3.4%) could be achieved by employing 70 ºC; 80 mg of NaOH/g of straw during 45 minutes. Under these conditions, the model predicted lignin and ashes removals of 41.3±4.3 and 62.3±5.3%, respectively, without significant loss of sugars. On a large scale (reactor of 50L), the alkaline treatment showed outcomes of acetyl removal near the ones predicted by the model. After, the deacetylating straw was submitted to acid hydrolysis process, varying the H2SO4 concentration from 0.5 to 1.5% w/v, and the residence time from 30 to 90 minutes, aiming to stablish the conditions that maximize the efficiency of hemicellulose hydrolysis (EHH). Under optimized conditions, (H2SO4 1.0% w/v and 85 minutes) 75% EHH was achieved in Erlenmeyers flasks and 76% in reactor. As regarding the hydrolysate fermentability employing K. marxinuas Y-6373, the results showed that, regardless of the nutritional supplementation, the conversion of xylose into xylitol was high ~ 0.87 g/g and superior in relation to the one obtained at a semidefined medium containing only xylose as a carbon source. Nevertheless, the values ofvolumetric productivity were approximately 6.5 times inferior ~ 0.13 g/L.h, due to the lowefficiency of xylose consumption (XC) ~ 20%, after 72h of cultivation. The hydrolysate fermentability was improved after detoxification and the results varied with the method employed. The best results were obtained on hydrolysate treated with CaO (YP/S= 0.74 g/g; QP = 0.32 g/L.h and XC = 92%). The glucose effect was further examined in semi-defined medium. The results showed that xylose assimilation and xylitol production by K. marxianus was repressed by glucose, since in a semi-defined media simulating the concentrations of xylose/glucose found in the hydrolyzed, the values of XC e YP/S were reduced in approximately 40%. Based on the results, was concluded that the strain of K. marxianus selected on this study, presents a great potential to produce xylitol at elevated temperatures. However, studies are still necessary to optimize the conditions of this bioconversion from the hemicellulosic hydrolysate.

Orientador: Maria Isabel Rodrigues / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:07:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Treichel_Helen_D.pdf: 2336096 bytes, checksum: bb4f87554ce5aa94a9f62d576648ac87 (MD5) Previous issue date: 2004 / Doutorado / Engenharia de Alimentos / Doutor em Engenharia de Alimentos

Submitted in fulfilment of the requirements of the Degree of Master of Technology: Biotechnology, Durban University of Technology, 2001. / Kluyveromyces sp. have adapted to existence in milk due to the evolution of permeabilisation and hydrolytic systems that allow the utilisation of lactose, the sugar most abundant in milk. Lactose hydrolysis, to equimolar units of glucose and galactose, is facilitated by a glycoside hydrolase, i.e., β-galactosidase (EC 3.2.1.23). The versatility of this enzyme allows its application in numerous industrial processes, amongst the most significant of which, is its role in the alleviation of lactose intolerance, one of the most prevalent digestive ailments, globally. In this study, β-galactosidase production by Kluyveromyces lactis UOFS y-0939 was initially optimised in shake flask culture with lactose as the sole carbon source, and thereafter, production was scaled up to batch, fedbatch and continuous culture. Shake flask studies revealed optimum conditions of 30°C, pH 7 and a 10% inoculum ratio, to be most favourable for β-galactosidase synthesis, producing a maximum of 0.35 ± 0.05 U.ml-1 when cell lysates were prepared by ultrasonication with glass beads. Batch cultivation in 28.2 and 40 g.L-1 lactose revealed that elevated levels of the carbon source was not inhibitory to β-galactosidase production, as maximum enzyme activities of 1.58 and 4.08 U.ml-1, respectively, were achieved. Cell lysates prepared by ultrasonication and homogenisation were compared and homogenised cell lysates were more than 3.5 fold higher that those prepared by ultrasonication, proving homogenisation to be the superior method for cell disruption. The lactose feed rate of 4 g.L-1.h-1 in fed-batch culture operated at ± 20.4% DO, appeared to be inhibitory to biomass production, as indicated by the lower biomass productivity in fed-batch (0.82 g.L-1.h-1) than batch culture (1.27 g.L-1.h-1). Enzyme titres, however, were favoured by the low DO levels as a maximum of 8.7 U.ml-1, 5.5 fold more than that obtained in batch culture, was achieved, and would be expected to increase proportionally with the biomass. Continuous culture operated at a dilution rate of 0.2 h-1, under strictly aerobic conditions, revealed these conditions to be inhibitory to the lactose consumption rate, however, the non-limiting lactose and high DO environment was favourable for β-galactosidase synthesis, achieving an average of 8 ± 0.9 U.ml-1 in steady state.

Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2014-09-22T17:50:15Z No. of bitstreams: 3 license_text: 22228 bytes, checksum: 65eccae6ba48e4ed6b2a75cb6a5f37bb (MD5) license_rdf: 21686 bytes, checksum: f60c8e7b7ea9f3ba141b21b00747aece (MD5) 2014ElvioLeandroBurlani.pdf: 2196003 bytes, checksum: d505b809756057eda4fc0e9260181cf5 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2014-09-29T13:14:40Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_text: 22228 bytes, checksum: 65eccae6ba48e4ed6b2a75cb6a5f37bb (MD5) license_rdf: 21686 bytes, checksum: f60c8e7b7ea9f3ba141b21b00747aece (MD5) 2014ElvioLeandroBurlani.pdf: 2196003 bytes, checksum: d505b809756057eda4fc0e9260181cf5 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-29T13:14:40Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_text: 22228 bytes, checksum: 65eccae6ba48e4ed6b2a75cb6a5f37bb (MD5) license_rdf: 21686 bytes, checksum: f60c8e7b7ea9f3ba141b21b00747aece (MD5) 2014ElvioLeandroBurlani.pdf: 2196003 bytes, checksum: d505b809756057eda4fc0e9260181cf5 (MD5) / No setor industrial muitos resíduos gerados são tratados e posteriormente descartados nos cursos hídricos. Na indústria láctea para produção de um quilo de queijo são gerados nove litros de soro de queijo, resíduo de elevada carga orgânica, rico em aminoácidos essenciais e vitaminas de importância nutricional. Algumas formas de aproveitamento do soro de queijo são a produção de ricota e de concentrado proteico de soro. Porém esses processos geram outros dois resíduos, respectivamente, o soro de ricota e o permeado de soro de queijo, que são importantes contaminantes ambientais devido à sua elevada carga orgânica. O principal constituinte desses resíduos é a lactose, açúcar que pode ser transformado através de processos fermentativos com auxílio de leveduras, em etanol. Este trabalho teve como objetivo utilizar o soro de ricota e o permeado de soro de queijo para a produção de bioetanol, através do emprego de diferentes cepas da levedura Kluyveromyces spp. Inicialmente foi selecionada entre cinco cepas de leveduras, quatro Kluyveromyces marxianus e uma Kluyveromyces lactis, a que apresentava maior produção de etanol a partir do soro de ricota e permeado de soro de queijo. Nessa etapa foi avaliado também o emprego dos subprodutos, soro de ricota e permeado de soro, nas formas autoclavado e não autoclavado. Posteriormente, empregando a cepa selecionada e a metodologia de planejamento experimental, foram estudados os efeitos do pH inicial, temperatura de incubação e concentração inicial de lactose sobre a produção de etanol, tanto para o soro de ricota e permeado de soro de queijo. Após, avaliou-se em biorreator de 3 L a conversão da lactose em etanol pela cepa selecionada para ambos os subprodutos. Como última etapa do trabalho realizou-se a estimativa de investimento em uma estação de tratamento de efluentes (ETE) e em uma usina de biotransformação de soro de ricota e permeado de soro de queijo. A melhor produção de etanol foi com soro de ricota e permeado de soro de queijo autoclavados utilizando a cepa da levedura Kluyveromyces marxianus ATCC 46537, que produziu 15,75 e 10,40 g/L de etanol, respectivamente. No planejamento experimental foi observada que a fermentação da lactose presente no soro de ricota e permeado de soro de queijo foi mais eficiente com temperaturas entre 35 e 45º C e pHs entre 4 e 5. Com esse estudo foi possível estimar que o investimento de uma usina pode ser viável ao longo de 10 anos, mesmo com um custo elevado de investimento. Além disso, a usina gera lucro, já na ETE o investimento para a instalação é alto e não gera lucro. Os resultados obtidos indicam que é possível obter etanol a partir da lactose presente no soro de ricota e no permeado de soro de queijo empregando a levedura Kluyveromyces marxianus ATCC 46537.

Το τυρόγαλα είναι το βασικό απόβλητο των γαλακτοβιομηχανιών με σημαντικές περιβαλλοντικές επιπτώσεις, λόγω του υψηλού οργανικού του φορτίου, κυρίως της λακτόζης (4,8-5% w/v) που περιέχει. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε ο ζυμομύκητας Kluyveromyces marxianus για τη ζύμωση του τυρογάλακτος προς παραγωγή αιθανόλης και προσδιορίσθηκαν οι βέλτιστες φυσικοχημικές συνθήκες (pH και θερμοκρασία) για τη διεργασία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε pH 5,5 και 30oC επιτυγχάνεται μέγιστη ταχύτητα ζύμωσης και συγκέντρωση αιθανόλης. Στις ίδιες συνθήκες, μέτρηση του ρυθμού πρόσληψης λακτόζης επισημασμένης με 14C από το μικροοργανισμό έδειξε ότι αυτός σχετίζεται άμεσα με την κινητική της ζύμωσης. / Cheese whey is the main waste of dairy industries with significant environmental impacts due to the high organic load, mainly lactose (4,8-5% w / v) containing. In this work we used the yeast Kluyveromyces marxianus for whey fermentation to produce ethanol and determined the optimal physico-chemical conditions (pH and temperature) for the process. The results showed that at pH 5,5 and 30oC achieve maximum speed of fermentation and ethanol concentration. Under the same conditions, measuring the rate of uptake of 14C-labeled lactose by the microorganism showed that this is directly related to the kinetics of fermentation.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-07T16:46:59Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7523105 bytes, checksum: a1b40bb2fc7f6707988b2c59b1367cc4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-07T16:46:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7523105 bytes, checksum: a1b40bb2fc7f6707988b2c59b1367cc4 (MD5) Previous issue date: 2015-03-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste trabalho foi construída uma biblioteca metagenômica a partir de um consórcio microbiano termofílico com aproximadamente 135.000 clones, abrigando cerca de 3,5 Gpb de DNA metagenômico. Essa biblioteca foi construída com o objetivo de identificar genes que codificam enzimas lignocelulolíticas para serem expressos na levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). De 6.720 clones analisados (5 % do total), foram obtidos 182 hits positivos para atividades de celulases, xilanases e β-glicosidases, com seleção e sequenciamento de 30 fosmídeos que deram origem à identificação de 34 ORFs codificando para enzimas glicosil hidrolases, relacionadas com a hidrólise de celulose e hemicelulose. Paralelo à construção da biblioteca, foi obtido uma linhagem de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3) mutante (ura3 ̄ ). Pela primeira vez nesta levedura a deleção deste gene foi realizada utilizando-se a técnica split-marker, com seleção dos mutantes primeiramente em placas contendo geneticina e, posteriormente, associados à seleção em placas contendo ácido 5-fluorótico (5-FOA). Os resultados apresentados mostram que esta técnica de deleção pode ser eficientemente empregada para K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), mesmo levando-se em conta a diploidia desta linhagem. A partir da obtenção do mutante ura3 ̄ , deu-se a construção do vetor pKmLPG para ser usado como sistema de expressão para essa levedura, uma vez que a marca de seleção contida neste vetor é o gene URA3. A característica diferencial e promissora deste sistema de expressão é o uso da sequência do promotor do gene que codifica a enzima endo-polygalacturonase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). A confirmação do vetor pKmLPG será realizada por sequenciamento. Sem essa confirmação, utilizou-se então o vetor de expressão pKMCL para clonagem de três genes de β-glicosidase isolados a partir da biblioteca fosmidial na levedura K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). O vetor pKMCL é derivado do vetor de expressão pKLAC2 de K. lactis e utiliza a marca de seleção que confere resistência ao antibiótico geneticina. Por realização de teste enzimático dos transformantes em meio sólido, observou-se a presença de atividade extracelular de β-glicosidase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3). Com o genoma desta levedura anotado, foi possível identificar o gene, e juntamente com os demais genes de β-glicosidase (P3Gli, P8Gli e P9Gli), foram preditas as estruturas tri-dimensionais dessas proteínas. A confirmação dos transformantes para os genes P3Gli, P8Gli e P9Gli foi realizada por PCR, e atividade de β-glicosidase foi detectada tanto no sobrenadante extracelular quanto na região do periplasma em oito das nove cepas transformantes analisadas. Os resultados de expressão heteróloga de β-glicosidades em K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) mostram que esta linhagem pode ser usada como hospedeira na expressão de diferentes genes lignocelulolíticos, com expectativa de uso das linhagens recombinantes capazes de secretar celulases visando a produção de etanol celulósico. / A metagenomic library harboring around 3,5 Gpb was constructed from a thermophilic microbial consortium. The aim of this library was to identify genes coding lignocellulolytic enzymes that could be expressed in the yeast Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). In total, 6,720 clones (5% of all clones) were analysed and 182 positive hits were found for cellulases, xylanases and β-glucosidases. The sequencing of 30 selected fosmids resulted in the identification of 34 putative open reading frames (ORFs) coding glycoside hydrolases involved with cellulose and hemicellulose degradation. Simultaneously, a defective mutant strain of K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) for gene ura3 was obtained. The gene was deleted by using, for the first time in this yeast, the split- marker technique that consisted in a first selection of mutants in solid medium with the antibiotic geneticin followed by a second selection in the presence of 5- Fluoroorotic Acid. The results presented here demonstrated the efficiency of the split-marker technique in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), even though this is a diploid strain. Once the ura3 - was obtained, the vector pKmLPG was constructed using the URA3 as a marker gene in order to have an expression system for the ura3 - mutant strain. The differential and promising feature of this vector lies in the presence of the promoter sequence of the gene coding an endo-polygalacturonase enzyme from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). The confirmation of the correct vector construction will be performed by sequencing. In order to express genes isolated from the metagenomic library in the yeast K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) three genes coding β-glucosidase were cloned onto the vector pKMCL. This vector is derived from pKLAC2 of Kluyveromyces lactis and it uses the resistance gene for the antibiotic geneticin as a marker. Extracellular activity of endogenous β- glucosidase from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) was detected by enzymatic assay in solid medium during the analyses of transformants, and based in the annotated genome of this yeast, was possible to identify the β-glucosidase gene. The three dimensional structure of the endogenous protein as well from those codified by the β-glucosidase genes (P3Gli, P8Gli and P9Gli) were predicted. The confirmation of transformants for the cloned genes P3Gli, P8Gli and P9Gli was done by PCR, and the β-glucosidase activity was detected in both extracelllular supernatant and periplasm region in eight of nine transformants analysed. Results of heterologous expression of β-glucosidase in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) demonstrated that this strain can be used as a host for expression of various lignocellulolytic genes, with the expectation to use recombinant yeast strains capable to secret celulases targeting the production of cellulosic etanol. / Tese liberada do Sigilo pelo departamento em 04-04-2017, ver arquivo