Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-08-29T11:24:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1361685 bytes, checksum: 6cf508d911e3f6c1ff5a61ecf5b8b708 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-29T11:24:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1361685 bytes, checksum: 6cf508d911e3f6c1ff5a61ecf5b8b708 (MD5) Previous issue date: 2017-07-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A conservação de frutos in natura com qualidade é primordial para reduzir as perdas no período após a colheita, devido à recorrente contaminação por fungos patogênicos. No entanto, a forma usual de controle por fungicidas e agentes químicos vem causando danos ao meio ambiente, à saúde humana e selecionando linhagens de patógenos resistentes. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito antagonista da levedura Kluyveromyces marxianus e seu mecanismo de ação contra o fitopatógeno Botrytis cinerea. Os resultados obtidos mostram que K. marxianus é capaz de secretar simultaneamente enzimas hidrolases envolvidas na degradação da ultra-estrutura da parede celular fúngica. O extrato protéico secretado foi testado contra os substratos Azocaseína e ρ-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo e apresentou atividades de glicosidase e proteásica para todas as linhagens testadas. O sequenciamento, por espectrometria de massas, das proteínas majoritárias que foram visualizadas em SDS-PAGE identificou vinte e sete proteínas, sendo 13 delas classificadas como hidrolases. Entre as hidrolases foram identificadas 4 β-glicanases, 4 glicosidases, uma protease aspártica, uma endoquitinase e uma inulinase. Quando se avaliou o efeito do extrato enzimático secretado por K. marxianus sobre a ultra-estrutura da parede celular de Saccharomyces cerevisiae foi observado um dano substancial, causando deformações celulares e redução da viabilidade da população de células. Neste trabalho foi observada a atividade de antagonismo da K. marxianus in vitro e in vivo utilizando conhecidos alvos do patógeno Botrytis cinerea: morangos e uvas de mesa. Os resultados obtidos dos testes de antagonismo in vitro mostram que em cultivo simultâneo K. marxianus inibe 88% a germinação de esporos de B. cinerea (p-valor 0,0003) nas primeiras 12h, sugerindo que, além da competição por nutrientes, a inibição do crescimento micelial esteja relacionada com a capacidade de secretar enzimas líticas exibidas pela levedura antagonista. Os resultados dos testes in vivo em uvas não mostraram atividade de antagonismo da K. marxianus contra B. cinerea. Os resultados dos testes in vivo em morangos sugerem que a habilidade de secretar enzimas líticas fazem da K. marxianus um agente potencial para o controle biológico de B. cinerea. / The conservation of fresh fruits is essential to reduce losses in the post-harvest period due to recurrent pathogenic fungi contamination. However, the usual way of control, which is by using fungicide and chemical agents, has been causing damage to the environment, human health and selecting strains resistant to pathogens. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of the antagonist yeast Kluyveromyces marxianus and its mechanism of action against the phytopathogen fungus Botrytis cinerea. The results show that K. marxianus is able of simultaneously secreting hydrolyses enzymes, which are involved in the degradation of the ultra structure of the fungal cell wall. Recently, our group has identified a β-1-3(4)-glucanase secreted by K. marxianus and defined the best cultivation conditions for glucanases secretion. The secreted protein extract was tested against the substrates Azocasein and p-nitrophenyl-β- D-glucopyranoside, and it showed glycosidase and protease activities for all examined strains. The mass spectrometry sequencing of the major proteins that were visualized on the SDS- PAGE identified twenty seven proteins, thirteen of them being classified as hydrolases. Among the hydrolases, four β-glucanases, four glycosidases, one aspartic protease, one endoquitinase and one inulinase were identified. When the effect of the enzymatic extract secreted by K. marxianus was evaluated against the ultra structure of S. cerevisiae cell wall, a substantial damage was observed, which caused cell deformations and reduction of cell populations viability. In this study, it was observed the antagonist activity of K. marxianus in vitro and in vivo using known targets of the B cinerea: strawberries and table grapes. The results obtained from the in vitro antagonist testes show that the simultaneous cultivation of K. marxianus and spores of B. cinerea inhibit spores germination by 88% (p-valor 0,0003) during the first 12 hours. The simultaneous cultivation with fungal mycelium of B. cinerea suggests that, in addition to nutrient competition, the inhibition of mycelium growth may be related to the ability of the antagonist yeast to secrete lytic enzymes. The results of the in vivo tests on strawberries suggest that the ability of secreting lytic enzymes makes K. marxianus a potential agent for the biological control of B. cinerea.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-09T12:34:35Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1875901 bytes, checksum: 7f1d304af718ecd82eb71caef248e486 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-09T12:34:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1875901 bytes, checksum: 7f1d304af718ecd82eb71caef248e486 (MD5) Previous issue date: 2011-12-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Kluyveromyces marxianus são leveduras promissoras para a fermentação de glicose e xilose, os principais açúcares presente no hidrolisado de bagaço de cana. No presente trabalho, foi investigado o consumo de xilose em presença de glicose bem como a capacidade de K. marxianus em fermentar várias combinações desses dois açúcares. Células de K. marxianus UFV-3 cultivadas em 20 gL-1 glicose e 20 gL-1 xilose apresentaram um período de adaptação de 30h para o início do consumo da xilose, após a glicose ter sido totalmente consumida. Entretanto, esse período de adaptação não foi observado quando as células foram cultivadas em 5 gL-1 glicose e 20 gL-1 xilose. Nessas condições, as células começaram a consumir xilose logo após a glicose ter sido exaurida do meio. Além disso, foi demonstrado que glicose e xilose podem ser consumidas simultaneamente, quando a respiração é bloqueada. A produção de etanol foi maior quando em mistura de glicose e xilose comparado à glicose sozinha. Por outro lado, K. marxianus UFV-3 não foi capaz de produzir etanol a partir de xilose nas condições avaliadas. Visando selecionar uma linhagem capaz de fermentar xilose, células de K. marxianus UFV-3 foram submetidas à engenharia evolutiva. Mutagênese foi aplicada com o intuito de aumentar a variabilidade genética da população e diminuir o tempo de seleção. Duas técnicas para inserção de mutações aleatórias foram utilizadas: REMI (Integração Mediada por Enzima de Restrição) e radiação ultravioleta (UV). Populações mutantes foram submetidas à seleção em quimiostatos e em bateladas sequenciais. Em quimiostato conduzido sob hipoxia, com uma taxa de diluição de 0.15 h-1 e uma mistura de 5 gL-1 glicose e 10 gL-1 xilose, isolou- se um mutante da população de células submetidas à REMI (KmRhyp). Este isolado produziu 12% mais etanol que a linhagem selvagem, mas com dobro de xilitol. Em batelada sequencial foi isolado um mutante da população irradiada por UV (KmUVsb) capaz de formar etanol de xilose e produzir menor quantidade de xilitol que a linhagem selvagem. Diferenças entre a linhagem selvagem e KmUVsb foram relacionadas a diferenças observadas na atividade de algumas enzimas. A razão entre as atividades específicas da xilitol desidrogenase e da xilose redutase foi maior para a linhagem mutante. As atividades específicas das enzimas da via fermentativa: piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase também foram maiores em KmUVsb. Culturas conduzidas em quimiostato limitado por xilose sob condições de aerobiose foram submetidas a um pulso de glicose (50 mmoles.L-1). Nem a linhagem selvagem nem a mutante produziram etanol instantaneamente, confirmando efeito Crabtree-negativo. Etanol foi detectado no sobrenadante após 60 minutos, e a produção deste metabólito foi duas vezes maior na linhagem mutante. Além disso, KmUVsb foi capaz de crescer em anaerobiose estrita na presença de xilose como única fonte de carbono. / Kluyveromyces marxianus strains are promising candidates to ferment glucose and xylose, the main sugars in hydrolyzed sugarcane bagasse. In this work, it was investigated the xylose consumption in the presence of glucose and the K. marxianus UFV-3 ability to ferment various combinations of these two sugars. K. marxianus UFV-3 cultured on 20 gL-1 glucose and 20 gL-1 xylose presented a lag phase of 30h to start xylose consumption after glucose depletion. However, this period of adaptation was not observed when cells were grown on 5 gL -1 glucose and 20 gL-1 xylose. Under these conditions, the cells began to consume xylose after glucose had been exhausted. Furthermore, it was demonstrated that glucose and xylose can be consumed simultaneously, when respiratory chain is blocked. The ethanol production was higher in a glucose/ xylose mixture compared to glucose alone. K. marxianus UFV-3 was not able to produce ethanol from xylose. In order to select a strain able to ferment xylose, K. marxianus UFV-3 were subjected to evolutionary engineering. Mutagenesis was applied to increase the genetic variability of the population and to reduce the selection time. Two methods for random mutations were used: REMI (Restriction Enzyme Mediated Integration) and ultraviolet irradiation (UV). Mutant populations were subjected to selection in chemostats and sequential batches. In chemostats conducted under hypoxia, with a dilution rate of 0.15 h -1 in a 5 gL-1 glucose and 10 gL-1 xylose mixture, a mutant from REMI population was isolated (KmRhyp). The isolate produced 12% more ethanol but with twice xylitol compared to the wild type. In sequential batches, it was isolated a mutant from the UV irradiated population (KmUVsb) which was able to form ethanol from xylose with 2-times less xylitol than wild type strain. The differences between wild type and KmUVsb were related to differences in the activity of some enzymes. The ratio of xylitol dehydrogenase specific activity to xylose reductase specific activity was higher in the mutant strain. The specific activities of fermentative pathway enzymes: pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase were also higher in KmUVsb. Cultures conducted in xylose- limited chemostats under aerobiosis were subjected to glucose pulse (50 mmoles/L). Neither the wild type nor the mutant strain formed ethanol instantly, confirming Crabtree-negative effect. Ethanol was detected on the supernatant after 60 minutes and it was twice as high as for mutant strain. In addition, KmUVsb was able to grow under strict anaerobiosis in the presence of xylose as the only carbon source.

Cette étude visait à vérifier la capacité de deux levures utilisées dans certaines applications alimentaires à dégrader le xylène commercial; deux approches ont été envisagées à savoir l'utilisation du xylène comme seule source de carbone ou encore la biotransformation du xylène en présence d'une autre source de carbone facilement assimilable par les levures. Pour ce faire, l'influence du xylène sur la croissance de Saccharomyces cerevisiae et de Kluyveromyces marxianus ainsi que la tolérance de ces levures en présence de cet hydrocarbure aromatique toxique ont été déterminées. Nos résultats ont démontré que les deux souches pouvaient croître jusqu'à une concentration de 25% (v/v) de xylène dans le milieu. Cette tolérance n'a été observée que lorsque le milieu contenait une source de carbone facilement métabolisable par les levures. Pour ce qui est de vérifier la capacité des levures à dégrader le xylène, un système à deux phases a été conçu et il était composé d'huile de silicone pour la phase organique et d'un milieu à base de sels minéraux (MBS) et de perméat de lactosérum ou de glucose (selon la souche testée) pour la phase aqueuse. Malheureusement, les conditions expérimentales utilisées dans cette étude n'ont pas permis de démontrer la capacité des levures à dégrader le xylène.

A levedura Kluyveromyces marxianus, apesar de apresentar propriedades fisiológicas vantajosas para a produção heteróloga de proteínas, foi utilizada apenas poucas vezes como hospedeira na síntese dessa classe de moléculas. Em contrapartida, a sua congênere Kluyveromyces lactis possui mais de 40 sistemas de expressão desenvolvidos, inclusive comerciais. Além disso, não há literatura disponível sobre glicosilação de proteínas em K. marxianus. Levando-se isso em consideração, este trabalho visou a desenvolver sistemas para a expressão heteróloga da enzima glicose oxidase (GOX) de Aspergillus niger e de uma esterase termófila (EST) de Thermus thermophilus em K. marxianus. A linhagem K. lactis CBS 2359 foi utilizada como parâmetro de comparação em todos os sistemas de expressão construídos. Primeiramente, foi realizado um estudo fisiológico com a finalidade de selecionar, dentre três linhagens de K. marxianus pré-selecionadas a partir de informação da literatura, a que apresentasse as melhores características fisiológicas para se tornar uma hospedeira de expressão heteróloga. A linhagem selecionada foi a CBS 6556, baseando-se numa combinação das seguintes características: velocidade específica de crescimento, formação de metabólitos, rendimento de substrato em biomassa e secreção da enzima homóloga inulinase. Após, foram construídos dois sistemas de expressão epissomais. No primeiro, o gene era expresso sob controle do promotor PGK de S. cerevisiae e no segundo, sob controle de INU1 de K. marxianus. Um sistema integrativo foi utilizado, no qual a expressão era dirigida pelo promotor INU1. Estudos bioquímicos e de glicosilação foram realizados nas enzimas produzidas. Em relação aos sistemas para expressão de GOX, foram alcançados níveis de produção de 1722 U/gMS (unidades por grama de biomassa seca) em K. marxianus transformado com o sistema epissomal no qual a expressão era controlada pelo promotor INU1. As caracterizações bioquímicas da enzima mostraram que a molécula produzida apresentava propriedades semelhantes à enzima homóloga de A. niger. Além disso, os estudos de glicosilação mostraram uma menor tendência de hiperglicosilação de K. marxianus quando comparada com K. lactis. Já em relação à esterase, K. lactis apresentou maiores níveis de expressão (294 U/gMS), porém a enzima produzida em K. marxianus apresentou temperatura ótima de atividade (50 °C) ligeiramente superior à enzima produzida por sua congênere (45 °C), temperaturas abaixo da qual ocorre maior atividade da enzima homóloga (65 °C). Isso pode ser explicado pela glicosilação exercida por ambas espécies de leveduras sobre a proteína, ao contrário da homóloga, não glicosilada. Além disso, os produtos das leveduras apresentaram três padrões de glicosilação. Dessa forma, o trabalho desenvolvido alcançou seu objetivo de desenvolver esses sistemas de expressão, bem como de avaliar a síntese heteróloga de proteínas nessa levedura de destacado potencial. Os resultados obtidos devem servir à comunidade científica, no sentido de estimular e orientar futuros trabalhos que objetivem a síntese heteróloga de proteínas em microrganismos. / In spite of the advantageous physiological properties of the yeast Kluyveromyces marxianus to produce heterologous proteins, this species has not been widely explored for the synthesis of these biomolecules. On the other hand, more than 40 heterologous expression systems, including commercial ones, were developed for Kluyveromyces lactis. Moreover, there is no available literature concerning heterologous protein glycosylation in K. marxianus. Taking these facts into account, this work aimed at developing systems for the heterologous production of Aspergillus niger glucose oxidase (GOX) and of a thermophilic esterase (EST) from Thermus thermophilus in K. marxianus. The strain K. lactis CBS 2359 was utilized as a reference throughout the whole work. First, a physiological study was carried out in order to select one K. marxianus strain, out of three which had been chosen based on literature information, that exhibited the best physiological traits to be a heterologous expression host. The chosen strain was CBS 6556, based on a combination of the following properties: specific growth rate, metabolites formation, biomass yield on substrate, and secretion of the homologous enzyme inulinase. Subsequently, two episomal systems were constructed. In one of them, the heterologous gene was expressed under control of the S. cerevisiae PGK promoter, whereas in the other system, heterologous gene expression occurred under control of the K. marxianus INU1 promoter. An integrative expression system was also constructed, in which the KmINU1 promoter drove foreign gene expression. Both heterologous enzymes were characterized biochemically and also with respect to their glycosylation. The results attained with GOX led to an expression level of 1722 U/g DW (unit per gram of dry cell weight) in K. marxianus transformed with the episomal INU1-based system. The biochemical studies showed that the enzyme was very similar to the A. niger GOX. Furthermore, analysis of the glycosylation pattern showed a lower tendency of K. marxianus to hypermannosylate proteins, when compared to K. lactis. Higher levels of esterase (294 U/gDW) were obtained in K. lactis than in K. marxianus. However, the enzyme produced in the latter host presented a higher temperature for maximal activity ((50 °C), when compared to the former organism (45 °C). Both values are lower than the temperature for maximal activity of the homologous enzyme (65 °C), which can be explained by the glycans added by both yeast species to the peptide, resulting in a glycosylated protein, in contrast to the homologous esterase. Moreover, the yeast products presented three glycosylation patterns. In conclusion, the work presented in this thesis reached its aims, which were to develop these expression systems and to characterize biochemically the heterologous enzymes expressed, which included an analysis of the glycosylation pattern. The results presented here will certainly be of interest and aid the scientific community working on the expression of heterologous proteins in microorganisms.

Submitted by Luis Ricardo Andrade da Silva (lrasilva@uefs.br) on 2017-01-11T20:36:16Z No. of bitstreams: 1 Renata Freitas disserta??o.pdf: 2389915 bytes, checksum: a5eb147a088e89c9ec715df2a0eb6c3f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-11T20:36:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renata Freitas disserta??o.pdf: 2389915 bytes, checksum: a5eb147a088e89c9ec715df2a0eb6c3f (MD5) Previous issue date: 2015-05-26 / The yeasts produce different types of metabolites and macromolecules with huge biotechnological potential. Among them, the Kluyveromyces marxianus, species attracts industrial and economic interests for presenting certain qualities, such as thermal tolerance, high growth rates, broad substrate spectrum and modulation of immune response. This work investigated the effects of treatment with the polysaccharide extracted from the Kluyveromyces marxianus yeast (poly322) in pain and inflammation experimental models. The poly322 pharmacological properties were evaluated with writhing, formalin, nociception (manifested by CFA), tail flick, hot-plate and paw edema tests. The cytokine levels were determined by ELISA and the effects on motor performance were evaluated by rotarod and open field tests. The pretreatment with poly322 resulted in reduced nociception induced by acetic acid, CFA and formalin (late phase). Furthermore, animals treated with poly322 exhibited a significant reduction in mechanical hypernociception, paw edema, and local IL-6 levels increase induced by carrageenan. In contrast, treatment with poly322 did not alter the thermal stimulus response threshold in the tail flick and hot plate tests, indicating no central action. Confirming the specificity of the action suggested by nociceptive tests, the treatment with poly322 did not induce motor impairment. These results demonstrate that the poly322 has a potent antinociceptive and anti-inflammatory effects, possibly mediated by the inhibition of the production and/or release of the IL-6 cytokine. / As leveduras produzem diferentes tipos de metab?litos e macromol?culas com enorme potencial biotecnol?gico. Dentre essas, destaca-se a Kluyveromyces marxianus, esp?cie que desperta interesse industrial e econ?mico por apresentar qualidades, como a toler?ncia t?rmica, altas taxas de crescimento, amplo espectro de substrato e modula??o da resposta imune. O presente estudo investigou os efeitos do tratamento com o polissacar?deo extra?do da levedura Kluyveromyces marxianus (poly322) em modelos experimentais de dor e inflama??o. As propriedades farmacol?gicas do poly322 foram avaliadas nos testes de contor??es abdominais, formalina, nocicep??o manifesta por CFA, retirada da cauda, placa quente e edema de pata. Os n?veis de citocinas foram determinados por ELISA e os efeitos sobre o desempenho motor foram avaliados pelos testes do cil?ndro girat?rio e campo aberto. O pr?-tratamento com o poly322 resultou na redu??o da hipernocicep??o induzida pelo ?cido ac?tico, CFA e formalina (segunda fase). Al?m disso, os animais tratados com o poly322 exibiram uma redu??o significativa no edema de pata e no aumento local dos n?veis de IL-6 induzidos pela carregenina. Em contraste, o tratamento com o poly322 n?o alterou o limiar de resposta a est?mulo t?rmico nos testes de retirada da cauda e placa quente, indicando aus?ncia de a??o central. Confirmando a especificidade da a??o sugerida pelos testes nociceptivos, o tratamento com o poly322 n?o induziu comprometimento motor. Os resultados demonstram que o poly322 possui um potente efeito antinociceptivo e anti-inflamat?rio, possivelmente mediado pela inibi??o da produ??o e/ou libera??o da citocina IL-6.

Este trabalho teve como objetivo a utilização de glicerol, principal subproduto da produção de biodiesel, como fonte de carbono para a produção de biomassa e ribonucleotídeos de leveduras. Com este propósito, foi realizado um screening de leveduras para identificar aquelas cepas com maior capacidade de crescimento em glicerol. As leveduras Hansenula anomala CCT 2648 e Kluyveromyces marxianus var. lactis CCT 4086 apresentaram os maiores valores de fator de conversão (YX/S) e produtividade volumétrica em células (QX) sob condições fixas de glicerol (30 g/L), temperatura (30 oC) e pH (5,5). Foi também detectada a produção de etanol e ácidos orgânicos, por algumas das leveduras estudadas em meios contendo glicerol. Com base no potencial de produção de biomassa das cepas selecionadas na etapa anterior, foram realizados estudos para avaliar a influência da concentração de glicerol (10 - 50 g/L), extrato de levedura (1 - 3 g/L), pH(4,5 - 6,5) e temperatura (28 - 40oC) no crescimento destas linhagens, utilizando planejamento experimental 24. De acordo com os resultados, a levedura Hansenula anomala CCT 2648 foi selecionada para a produção de biomassa e ribonucleotídeos em experimentos conduzidos em bioreator por apresentar maior concentração de biomassa (4,59 g/L) quando comparada com a levedura Kluyveromyces marxianus var lactis CCT 4086 (3,37 g/L). Nesta fase, foi avaliada a influência da agitação (300 - 700 rpm), aeração (0,5 - 2 vvm) e concentração de glicerol (10 - 50 g/L) com o objetivo de estabelecer as melhores condições de processo, por meio de planejamento 23. Os maiores valores de YX/S (0,57- 0,60 g/g) foram obtidos nos ensaios conduzidos sob a menor concentração de glicerol (10 g/L), entretanto, o maiores valores de QX (0,44 - 0,62) foram obtidos em cultivos quando se utilizou valores de agitação superiores a 500 rpm. A análise estatística confirmou a significância das variáveis, concentração de glicerol e agitação, e permitiu estabelecer os modelos matemáticos representativos da influência destas variáveis na produção de biomassa e ribonucleotídeos por Hansenula anomala CCT 2648. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram o potencial de utilização do glicerol derivado da fabricação de biodiesel como fonte de carbono de baixo custo para a produção de biomassa e biomoléculas, como por exemplo os ribonucleotídeos. / Glycerol is considered to be the principle sub-product derived from biodiesel production process. In this work, glycerol was used as the only carbon source for biomass accumulation and ribonucleotides production. For this purpose screening of different strains was achieved, where the yeasts defined as Hansenula anomala CCT 2648 and Kluyveromyces marxianus var. lactis CCT 4086 showed high biomass yield (Y X/S) and productivity (QX) as well as better ribonucleotides production, using an initial concentration of glycerol of 30 g/L, temperature of 30oC and pH of 5,5. In addition, ethanol and organic acids were detected during glycerol assimilation by these two studied yeasts. Since these two selected yeast showed a promising potential in biomass and ribonucleotides production, a 24 complete factorial design was employed in order to study the influence of different parameters: glycerol initial concentration (10 - 50 g/L), yeast extract initial concentration (1-3 g/L), pH (4,5 - 6,5) and temperature (28 - 40oC) on the fermentation yield and productivity. According to the obtained results, the yeast Hansenula anomala CCT 2648 achieved higher biomass production (4,59 g/L) when compared to Kluyveromyces marxianus var lactis CCT 4086 (3,37 g/L). Such fact lead to the selection of Hansenula anomala CCT 2648 for a scale-up production of ribonucleotides using a stirred stank bioreactor, where the influence of the following fermentation parameters were studied: agitation (300 - 500 rpm), air input (0,5 - 2 vvm) and glycerol initial concentration (10 - 50 g/L) using a 23 full factorial design. High values of YX/S (0,57 - 0,6 g/g) were observed when the experiments were carried out at lower glycerol concentration (10 g/L), while high values of QX (0,44 - 0,62 g/L.h) were observed at high agitation rates of 500 rpm and above. Mathematical models were also created to confirm this influence of glycerol initial concentration and bioreactor stirring on biomass and ribonucleotides production by Hansenula anomala CCT 2648. Obtained results in this work demonstrated the feasibility of using glycerol derived from biodiesel production as a promising low-value carbon source for biomass and ribonucleotides accumulation.

Em um contexto de sustentabilidade onde resíduos devem ser aproveitados na tentativa de gerar novos produtos, energéticos ou não encontra-se o bagaço de maçã, o resíduo oriundo da prensagem do fruto no processo de produção de suco. Tal biomassa é composta por cascas, polpa, talos e sementes. Representa cerca de 30% da produção anual de maçã no Brasil e tem como opção de utilização, suplementação de ração animal e adubação orgânica. Uma alternativa de aproveitamento para esta biomassa está na sua utilização em bioprocessos como na produção de etanol, xilitol, dentre outros. O xilitol e o etanol vêm sendo amplamente investigados, o xilitol por suas diversas aplicações nos setores odontológico, farmacêutico e alimentício e o etanol pela sua utilização em substituição aos combustíveis fósseis. Desta forma o presente trabalho avaliou o aproveitamento do bagaço de maçã como matéria-prima em bioprocessos. Para tanto, foram desenvolvidas etapas de caracterização da biomassa; obtenção por hidrólise ácida (1% H2SO4, 121?C, 20 min.), concentração a vácuo e, destoxificação (1% de carvão vegetal ativo e ajuste de pH), do hidrolisado hemicelulósico; e fermentação deste hidrolisado por Candida guilliermondii e Kluyveromyces marxianus. As fermentações foram desenvolvidas em frascos Erlenmeyer (125mL), em shaker rotatório (200 rpm, 30°C) por 96 horas, empregando como meio de cultivo o hidrolisado hemicelulósico suplementado com (g.L-1) solução de extrato de farelo de arroz (20); CaCl2.2H2O (0,1) e (NH4)2SO4 (2,0). No presente trabalho, o bagaço de maçã apresentou teores (%) de 32,62 de celulose, 25,38 de lignina e 23,60 de hemicelulose, enquanto o hidrolisado o qual foi destoxificado em separado para as fermentações com as leveduras teve como constituintes (g.L-1): xilose (29,65), glicose (20,79), arabinose (19,93), ácido acético (2,07), furfural (0,03) e hidroximetilfurfural (0,11). Foi constatado que ambas as leveduras consumiram totalmente a glicose (12h) e parcialmente as pentoses, xilose e arabinose, sendo a última consumida lentamente por C. guilliermondii e apenas nas últimas 24 horas de cultivo por K. marxianus Como resultado, C. guilliermondii produziu xilitol (9,35g.L-1) e K. marxianus tanto xilitol (9,10g.L-1) quanto etanol (10,47 g.L-1) como principais bioprodutos. As máximas atividades enzimáticas (U/mgprot) de xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH) das leveduras empregadas foram 0,23 e 0,53 para C. guilliermondii e 0,08 e 0,08 para K. marxianus, respectivamente. Baseando-se nos resultados obtidos no presente trabalho, pode-se afirmar que o bagaço de maçã é uma biomassa promissora para ser aproveitada como matéria-prima em bioprocessos que visam a produção de xilitol e/ou etanol. / In a sustainability context in which residues must be used for obtaining new energetic or non-energetic products, vegetal biomass becomes an important feedstock for bioprocess. One of those residues is apple pomace, which is produced in the fruit milling during the juice production process. This biomass is composed by skin, pulp, stalk and seeds. It represents about 30% of apple annual production in Brazil, and the conventional uses are animal feeding and organic fertilization. One alternative to use this biomass is its utilization as feedstock in bioprocesses, such as ethanol and xylitol production. Extensive research is being performed in xylitol and ethanol production due to the important applications of xylitol in odontological, pharmaceutical and food industries, as well as because of the utilization of ethanol as substitute of fossil fuels. In this way, the present work evaluated the use of apple pomace as feedstock for bioprocess, through the development of stages of biomass characterization; dilute-acid hydrolysis (1% H2SO4, 121?C, 20 min.), vacuum concentration and detoxification (pH adjustment and activated charcoal adsorption) of the hemicellulosic hydrolysate and fermentation of this hydrolysate by Candida guilliermondii and Kluyveromyces marxianus. The fermentations were performed in Erlenmeyer flasks (125mL) in a rotatory shake (200rpm, 30ºC) for 96h, employing as culture medium the hemicellulosic hydrolysate supplemented with (g.L-1) rice bran extract (20), CaCl2·2H2O (0.1) and (NH4)2SO4 (2.0). In this work, the composition (%) of apple was 32.62 of cellulose, 25.38 of lignin and 23.60 of hemicellulose. The hydrolysate was separately detoxified for the fermentations with the yeasts, and has the following composition (g.L-1): xylose (29.65), glucose (20.79), arabinose (19.93), acetic acid (2.07), furfural (0.03) and 5-hydroxymethylfurfural (0.11). It was verified that both yeasts consumed totally glucose (12h) and partially pentoses, i.e. xylose and arabinose, the latter being consumed slowly by C. guilliermondii and only in the last 24h of fermentation by K. marxianus. The main products for C. guilliermondii was xylitol (9.35g.L-1) while for K. marxianus it was ethanol (10.47g.L-1) and xylitol (9.10 g.L-1) as well. The maximum enzymatic activities (U/mgprot) of Xylose Reductase (XR) and Xylitol Dehydrogenase (XDH) were 0.23 e 0.53 for C. guilliermondii and 0.08 and 0.08 for K. marxianus, respectively. Based on the results of the present work, it can be stated that apple pomace is a promissory biomass to be used as feedstock in bioprocess for xylitol and/or ethanol production.

Este trabalho teve como objetivo a utilização de glicerol, principal subproduto da produção de biodiesel, como fonte de carbono para a produção de biomassa e ribonucleotídeos de leveduras. Com este propósito, foi realizado um screening de leveduras para identificar aquelas cepas com maior capacidade de crescimento em glicerol. As leveduras Hansenula anomala CCT 2648 e Kluyveromyces marxianus var. lactis CCT 4086 apresentaram os maiores valores de fator de conversão (YX/S) e produtividade volumétrica em células (QX) sob condições fixas de glicerol (30 g/L), temperatura (30 oC) e pH (5,5). Foi também detectada a produção de etanol e ácidos orgânicos, por algumas das leveduras estudadas em meios contendo glicerol. Com base no potencial de produção de biomassa das cepas selecionadas na etapa anterior, foram realizados estudos para avaliar a influência da concentração de glicerol (10 - 50 g/L), extrato de levedura (1 - 3 g/L), pH(4,5 - 6,5) e temperatura (28 - 40oC) no crescimento destas linhagens, utilizando planejamento experimental 24. De acordo com os resultados, a levedura Hansenula anomala CCT 2648 foi selecionada para a produção de biomassa e ribonucleotídeos em experimentos conduzidos em bioreator por apresentar maior concentração de biomassa (4,59 g/L) quando comparada com a levedura Kluyveromyces marxianus var lactis CCT 4086 (3,37 g/L). Nesta fase, foi avaliada a influência da agitação (300 - 700 rpm), aeração (0,5 - 2 vvm) e concentração de glicerol (10 - 50 g/L) com o objetivo de estabelecer as melhores condições de processo, por meio de planejamento 23. Os maiores valores de YX/S (0,57- 0,60 g/g) foram obtidos nos ensaios conduzidos sob a menor concentração de glicerol (10 g/L), entretanto, o maiores valores de QX (0,44 - 0,62) foram obtidos em cultivos quando se utilizou valores de agitação superiores a 500 rpm. A análise estatística confirmou a significância das variáveis, concentração de glicerol e agitação, e permitiu estabelecer os modelos matemáticos representativos da influência destas variáveis na produção de biomassa e ribonucleotídeos por Hansenula anomala CCT 2648. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram o potencial de utilização do glicerol derivado da fabricação de biodiesel como fonte de carbono de baixo custo para a produção de biomassa e biomoléculas, como por exemplo os ribonucleotídeos. / Glycerol is considered to be the principle sub-product derived from biodiesel production process. In this work, glycerol was used as the only carbon source for biomass accumulation and ribonucleotides production. For this purpose screening of different strains was achieved, where the yeasts defined as Hansenula anomala CCT 2648 and Kluyveromyces marxianus var. lactis CCT 4086 showed high biomass yield (Y X/S) and productivity (QX) as well as better ribonucleotides production, using an initial concentration of glycerol of 30 g/L, temperature of 30oC and pH of 5,5. In addition, ethanol and organic acids were detected during glycerol assimilation by these two studied yeasts. Since these two selected yeast showed a promising potential in biomass and ribonucleotides production, a 24 complete factorial design was employed in order to study the influence of different parameters: glycerol initial concentration (10 - 50 g/L), yeast extract initial concentration (1-3 g/L), pH (4,5 - 6,5) and temperature (28 - 40oC) on the fermentation yield and productivity. According to the obtained results, the yeast Hansenula anomala CCT 2648 achieved higher biomass production (4,59 g/L) when compared to Kluyveromyces marxianus var lactis CCT 4086 (3,37 g/L). Such fact lead to the selection of Hansenula anomala CCT 2648 for a scale-up production of ribonucleotides using a stirred stank bioreactor, where the influence of the following fermentation parameters were studied: agitation (300 - 500 rpm), air input (0,5 - 2 vvm) and glycerol initial concentration (10 - 50 g/L) using a 23 full factorial design. High values of YX/S (0,57 - 0,6 g/g) were observed when the experiments were carried out at lower glycerol concentration (10 g/L), while high values of QX (0,44 - 0,62 g/L.h) were observed at high agitation rates of 500 rpm and above. Mathematical models were also created to confirm this influence of glycerol initial concentration and bioreactor stirring on biomass and ribonucleotides production by Hansenula anomala CCT 2648. Obtained results in this work demonstrated the feasibility of using glycerol derived from biodiesel production as a promising low-value carbon source for biomass and ribonucleotides accumulation.

Em um contexto de sustentabilidade onde resíduos devem ser aproveitados na tentativa de gerar novos produtos, energéticos ou não encontra-se o bagaço de maçã, o resíduo oriundo da prensagem do fruto no processo de produção de suco. Tal biomassa é composta por cascas, polpa, talos e sementes. Representa cerca de 30% da produção anual de maçã no Brasil e tem como opção de utilização, suplementação de ração animal e adubação orgânica. Uma alternativa de aproveitamento para esta biomassa está na sua utilização em bioprocessos como na produção de etanol, xilitol, dentre outros. O xilitol e o etanol vêm sendo amplamente investigados, o xilitol por suas diversas aplicações nos setores odontológico, farmacêutico e alimentício e o etanol pela sua utilização em substituição aos combustíveis fósseis. Desta forma o presente trabalho avaliou o aproveitamento do bagaço de maçã como matéria-prima em bioprocessos. Para tanto, foram desenvolvidas etapas de caracterização da biomassa; obtenção por hidrólise ácida (1% H2SO4, 121?C, 20 min.), concentração a vácuo e, destoxificação (1% de carvão vegetal ativo e ajuste de pH), do hidrolisado hemicelulósico; e fermentação deste hidrolisado por Candida guilliermondii e Kluyveromyces marxianus. As fermentações foram desenvolvidas em frascos Erlenmeyer (125mL), em shaker rotatório (200 rpm, 30°C) por 96 horas, empregando como meio de cultivo o hidrolisado hemicelulósico suplementado com (g.L-1) solução de extrato de farelo de arroz (20); CaCl2.2H2O (0,1) e (NH4)2SO4 (2,0). No presente trabalho, o bagaço de maçã apresentou teores (%) de 32,62 de celulose, 25,38 de lignina e 23,60 de hemicelulose, enquanto o hidrolisado o qual foi destoxificado em separado para as fermentações com as leveduras teve como constituintes (g.L-1): xilose (29,65), glicose (20,79), arabinose (19,93), ácido acético (2,07), furfural (0,03) e hidroximetilfurfural (0,11). Foi constatado que ambas as leveduras consumiram totalmente a glicose (12h) e parcialmente as pentoses, xilose e arabinose, sendo a última consumida lentamente por C. guilliermondii e apenas nas últimas 24 horas de cultivo por K. marxianus Como resultado, C. guilliermondii produziu xilitol (9,35g.L-1) e K. marxianus tanto xilitol (9,10g.L-1) quanto etanol (10,47 g.L-1) como principais bioprodutos. As máximas atividades enzimáticas (U/mgprot) de xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH) das leveduras empregadas foram 0,23 e 0,53 para C. guilliermondii e 0,08 e 0,08 para K. marxianus, respectivamente. Baseando-se nos resultados obtidos no presente trabalho, pode-se afirmar que o bagaço de maçã é uma biomassa promissora para ser aproveitada como matéria-prima em bioprocessos que visam a produção de xilitol e/ou etanol. / In a sustainability context in which residues must be used for obtaining new energetic or non-energetic products, vegetal biomass becomes an important feedstock for bioprocess. One of those residues is apple pomace, which is produced in the fruit milling during the juice production process. This biomass is composed by skin, pulp, stalk and seeds. It represents about 30% of apple annual production in Brazil, and the conventional uses are animal feeding and organic fertilization. One alternative to use this biomass is its utilization as feedstock in bioprocesses, such as ethanol and xylitol production. Extensive research is being performed in xylitol and ethanol production due to the important applications of xylitol in odontological, pharmaceutical and food industries, as well as because of the utilization of ethanol as substitute of fossil fuels. In this way, the present work evaluated the use of apple pomace as feedstock for bioprocess, through the development of stages of biomass characterization; dilute-acid hydrolysis (1% H2SO4, 121?C, 20 min.), vacuum concentration and detoxification (pH adjustment and activated charcoal adsorption) of the hemicellulosic hydrolysate and fermentation of this hydrolysate by Candida guilliermondii and Kluyveromyces marxianus. The fermentations were performed in Erlenmeyer flasks (125mL) in a rotatory shake (200rpm, 30ºC) for 96h, employing as culture medium the hemicellulosic hydrolysate supplemented with (g.L-1) rice bran extract (20), CaCl2·2H2O (0.1) and (NH4)2SO4 (2.0). In this work, the composition (%) of apple was 32.62 of cellulose, 25.38 of lignin and 23.60 of hemicellulose. The hydrolysate was separately detoxified for the fermentations with the yeasts, and has the following composition (g.L-1): xylose (29.65), glucose (20.79), arabinose (19.93), acetic acid (2.07), furfural (0.03) and 5-hydroxymethylfurfural (0.11). It was verified that both yeasts consumed totally glucose (12h) and partially pentoses, i.e. xylose and arabinose, the latter being consumed slowly by C. guilliermondii and only in the last 24h of fermentation by K. marxianus. The main products for C. guilliermondii was xylitol (9.35g.L-1) while for K. marxianus it was ethanol (10.47g.L-1) and xylitol (9.10 g.L-1) as well. The maximum enzymatic activities (U/mgprot) of Xylose Reductase (XR) and Xylitol Dehydrogenase (XDH) were 0.23 e 0.53 for C. guilliermondii and 0.08 and 0.08 for K. marxianus, respectively. Based on the results of the present work, it can be stated that apple pomace is a promissory biomass to be used as feedstock in bioprocess for xylitol and/or ethanol production.

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:24:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Danielle_ Camargo.pdf: 2743019 bytes, checksum: bb99b3949e2803b846be4f0bae327172 (MD5) Previous issue date: 2016-02-12 / Ethanol is considered a promising alternative to fossil fuels and causes less environmental impact, which implies an increase in the consumption of biofuel. To meet this demand, research has been conducted with alternative raw materials to complement the production of first generation ethanol. In Brazil, sweet sorghum is being studied for the expansion of sugarcane industry due to its rapid growth and the possibility of cultivating it during the season-cropping of sugarcane. However, during processing of sweet sorghum for ethanol production, generation of bagasse occurs, a material composed primarily of cellulose and hemicellulose, which can be considered a potential source of feedstock for bioprocesses. Therefore, the purpose of this study was the use of the sugars from the hemicellulose and the cellulosic fractions of the sweet sorghum bagasse, for the production of second generation ethanol by pentoses and hexoses fermentation yeasts, respectively. After chemical characterization of sorghum bagasse of six cultivars, they were subjected to mild acid hydrolysis with variations in temperature (111; 115 °C and 121), time (40, 50, and 60 min) and concentration of sulfuric acid (075; 1.25 and 1.75% w/v) using a central composite design (DCC) and response surface to find the condition that is conducive to high concentrations of sugars and less toxic compounds in the hemicellulosic hydrolysate. After the hydrolysate was concentrated and detoxified, it was submitted to fermentation by the yeast Schefferosomyces stipitis in a bioreactor at 30 °C, with kLa 4.9 h-1, pH 5.5 and volume of 4.5 liters. The solid biomass (cellulignin) that resulted from the acid treatment was submitted to evaluation of the percentage of cellulose, hemicellulose and lignin and then to studies with variation in the concentration of NaOH (1; 2.5 to 4%) and time (20, 40 and 60 min). After the treatment with the best condition of removal of lignin, cellulosic biomass was subjected to enzymatic hydrolysis with variation in the concentration of cellulase NS22086 (15, 20 and 25 FPU/g) and β-glucosidase NS22118 (1/3 to 2/3) and temperature of 38; 41 to 44 °C, in order to obtain the best saccharification rates and high glucose concentrations. The production of ethanol from the cellulosic fraction was then carried out with Kluyveromyces marxianus, during simultaneous saccharification and fermentation (SSF) at three different temperatures (38, 41 and 44 °C) for fermentation. The chemical composition between different varieties studied was similar and varied from 22-26% of lignin, from 30-32% of hemicellulose and 32-37% of cellulose. In the study of the hydrolysis conditions of hemicellulose, it was found that the acid concentration was the most important factor, and the condition that resulted in the highest concentration of sugars (14.22 g/L xylose and 2.42 g/L glucose) was 1.75% H2SO4, 40 minutes and 121 °C. This same condition showed low quantities of toxic compounds (1.34 g/L of acetic acid, 0.90 g/L of phenol; 124.54 mg/L of hydroxymethylfurfural and 978 mg/L furfural). The production of ethanol by S. stiptis in the hemicellulosic hydrolysate resulted in a concentration of 22 g/L ethanol, Yp/s of 0.40 g/g; Yx/s 0.28 g/g and Qp of 0.34 g/L.h-1. For the study of cellulignin delignification it was found that 2.5% NaOH for 60 minutes was the best condition for the removal of lignin (68%). During the enzymatic hydrolysis of the cellulosic portion, it was verified that the increase of cellulase from15 to 25 FPU/g resulted in higher concentration of glucose. In addition, the increase of β-glucosidase also resulted in the largest amount of glucose in a shorter time. The temperature also increased and accelerated the process of saccharification of cellulose. The simultaneous saccharification fermentation with K. marxianus was shown to be affected by the temperature studied, and the maximum ethanol concentration was reached (9.41 g/L) after 72 hours at 41 °C. With these results, it was possible to consider that the bagasse of sweet sorghum is a promising material in the field of second generation ethanol production both from hemicellulose and cellulose. / O etanol é considerado uma alternativa promissora aos combustíveis fósseis, o que implica no aumento do consumo deste biocombustível. Para suprir essa demanda, pesquisas têm sido realizadas com matérias primas alternativas para complementar a produção de etanol de primeira geração. No Brasil, o sorgo sacarino está sendo estudado para ampliação do setor sucroenergético por ter crescimento rápido e possibilidade de cultivo na entressafra da cana-de-açúcar. Porém, durante o processamento do sorgo sacarino ocorre a geração do bagaço como material excedente, que é constituído principalmente por celulose e hemicelulose, e que pode ser considerado matéria-prima em potencial para bioprocessos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar o aproveitamento dos açúcares das frações hemicelulósica e celulósica do bagaço de sorgo sacarino para produção de etanol de segunda geração por leveduras fermentadoras de pentoses e hexoses, respectivamente. Após a caracterização química do bagaço de sorgo, este foi avaliado através de estudo de delineamento composto central (DCC) e superfície de resposta à hidrólise ácida branda com variações na temperatura (111; 115 e 121 °C), tempo (40; 50 e 60 min) e concentração de ácido sulfúrico (0,75; 1,25 e 1,75% m/v) a fim de encontrar a condição que propiciasse altas concentrações de açúcares e menores de compostos tóxicos no hidrolisado hemicelulósico. Após o hidrolisado ser concentrado e destoxificado, seguiu para fermentação pela levedura Schefferosomyces stipitis em biorreator a 30 °C, com kLa de 4,9 h-1, pH 5,5 e volume de 4,5 litros. A biomassa sólida (celulignina) resultante do tratamento ácido foi submetida à avaliação da porcentagem de celulose, hemicelulose e lignina e seguiu para estudo da deslignificação com variação na concentração de NaOH (1; 2,5 e 4%) e tempo (20, 40 e 60 min). Após tratamento com a melhor condição de remoção da lignina, a biomassa foi submetida à hidrólise enzimática com variação na concentração de celulase NS22086 (15; 20 e 25 FPU/g) e de β-glicosidase NS22118 (1/3 a 2/3) e temperatura (38; 41 e 44 °C), a fim de obter as melhores taxas de sacarificação e altas concentrações de glicose. A produção de etanol a partir da fração celulósica foi então realizada com Kluyveromyces marxianus durante sacarificação simultânea à fermentação (SSF) em três diferentes temperaturas (38; 41 e 44 °C) de incubação. A composição química do bagaço variou entre 22-26% de lignina, 30-32% de hemicelulose e 32-37% de celulose. A concentração de ácido sulfúrico foi o fator que teve maior influência na formação de açúcares e hidrólise da hemicelulose e a condição que resultou na maior concentração de açúcares (14,22 g/L de xilose e 2,42 g/L de glicose) foi 1,75% de H2SO4, 40 minutos a 121 °C. Essa mesma condição apresentou baixas quantidades de compostos tóxicos (1,34 g/L de ácido acético, 0,90 g/L de fenólicos; 124,54 mg/L de hidroximetilfurfural e 978 mg/L de furfural). A produção de etanol por S. stiptis no hidrolisado hemicelulósico resultou em uma concentração de 22 g/L de etanol, Yp/s de 0,40 g/g; Yx/s de 0,28 g/g e Qp de 0,34 g/L.h-1. No estudo de deslignificação da celulignina foi verificado que 2,5% de NaOH, 121 0C por 60 minutos foi a melhor condição na remoção de lignina (68%). Durante a hidrólise enzimática da porção celulósica foi verificado que o aumento da concentração da celulase de 15 para 25 FPU/g resultou na maior concentração de glicose. Além disso, o aumento da β-glicosidase diminui o tempo de hidrólise e o aumento da temperatura favoreceu o processo de sacarificação da celulose. A sacarificação simultânea à fermentação com K. marxianus demonstrou ser afetada pela temperatura estudada e a máxima concentração de etanol foi alcançada (9,41 g/L) com 72 horas a 41 °C. Com esses resultados, é possível considerar que o bagaço do sorgo sacarino é uma matéria prima promissora na produção de etanol de segunda geração tanto a partir da hemicelulose como de celulose.