L'adaptation à l'environnement est essentielle à la survie cellulaire et des organismes en général. La capacité d'adaptation aux variations en oxygène repose sur des mécanismes de détection de l'hypoxie et une capacité à répondre en amorçant un programme d'angiogenèse. Bien que la contribution du facteur induit par l'hypoxie (HIF) est bien définie dans l'induction d'une telle réponse, d'autres mécanismes sont susceptibles d'être impliqués. Dans cette optique, les études démontrant l'influence du métabolisme énergétique sur le développement vasculaire sont de plus en plus nombreuses. L'un de ces composés, le succinate, a récemment été démontré comme étant le ligand du GPR91, un récepteur couplé aux protéines G. Parmi les différents rôles attribués à ce récepteur, notre laboratoire s'intéressa aux rôles du GPR91 dans la revascularisation observée suite à des situations d'hypoxie dont ceux affectant la rétine. Il existe cependant d'autres conditions pour lesquelles une revascularisation serait bénéfique notamment suite à un stress hypoxique-ischémique cérébral. Nos travaux ont pour objectifs de mieux comprendre le rôle et le fonctionnement de ce récepteur durant le développement et dans le cadre de pathologies affectant la formation de vaisseaux sanguins. Dans un premier temps, nous avons déterminé le rôle du GPR91 dans la guérison suite à un stress hypoxique-ischémique cérébral chez le nouveau-né. Nous montrons que ce récepteur est exprimé dans le cerveau et en utilisant des souris n'exprimant pas le GPR91, nous démontrons que dans un modèle d'hypoxie-ischémie cérébrale néonatal l'angiogenèse prenant place au cours de la phase de guérison dépend largement du récepteur. L'injection intracérébrale de succinate induit également l'expression de nombreux facteurs proangiogéniques et les résultats suggèrent que le GPR91 contrôle la production de ces facteurs. De plus, l'injection de ce métabolite avant le modèle d'hypoxie-ischémie réduit substantiellement la taille de l'infarctus. In vitro, des essaies de transcription génique démontrent qu'à la fois les neurones et les astrocytes répondent au succinate en induisant l'expression de facteurs bénéfiques à la revascularisation. En considérant le rôle physiologique important du GPR91, une seconde étude a été entreprise afin de comprendre les déterminants moléculaires régissant son activité. Bien que la localisation subcellulaire des RCPG ait traditionnellement été considérée comme étant la membrane plasmique, un nombre de publications indique la présence de ces récepteurs à l'intérieur de la cellule. En effet, tel qu'observé par microscopie confocale, le récepteur colocalise avec plusieurs marqueurs du réticulum endoplasmique, que celui-ci soit exprimé de façon endogène ou transfecté transitoirement. De plus, l’activation des gènes par stimulation avec le succinate est fortement affectée en présence d'inhibiteur du transport d'acides organiques. Nous montrons que le profil de facteurs angiogéniques est influencé selon la localisation ce qui affecte directement l'organisation du réseau tubulaire ex vivo. Finalement, nous avons identifié une région conservée du GPR91 qui agit de signal de rétention. De plus, nous avons découvert l'effet de l'hypoxie sur la localisation. Ces travaux confirment le rôle de régulateur maître de l'angiogenèse du GPR91 lors d'accumulation de succinate en condition hypoxique et démontrent pour la première fois l'existence, et l'importance, d'un récepteur intracellulaire activé par un intermédiaire du métabolisme. Ces données pavent donc la voie à une nouvelle avenue de traitement ciblant GPR91 dans des pathologies hypoxiques ischémiques cérébrales et soulèvent l'importance de tenir compte de la localisation subcellulaire de la cible dans le processus de découverte du médicament. / The ability to adapt to the changing environment is essential for the survival of cells and organisms in general. The capacity to adjust to variations in oxygen content not only relies on the ability to sense hypoxia but also depends the time required to induce an angiogenic process. Notwithstanding the important contribution of the hypoxia inducible factor (HIF) in this response, other mechanisms are likely to be involved. Studies that have demonstrated the influence of metabolic compounds on vascular development are increasingly abundant. One of those compounds, succinate, has recently been indentified as the ligand of GPR91, a G-protein-coupled receptor. Amongst the roles of this receptor, our group has been interested in determining its contribution in revascularisation observed following hypoxic events in the retina. Other pathological conditions could benefit from the contribution of GPR91 including cerebral hypoxia-ischemia. Our objective is to better understand the role of this receptor during development and in pathological conditions affecting blood vessel formation. We first, determined the role of GPR91 in revascularisation following cerebral hypoxia-ischemia in the newborn. We show the expression of the receptor in the cerebral cortex. Using mice devoid of GPR91, we demonstrate that angiogenesis normally taking place during the recovery phase is largely dependent upon GPR91. Intracerebral injection of succinate induces the expression of several proangiogenic growth factors by activating GPR91. Furthermore, injection of succinate before cerebral H-I model substantially reduces the infarct size. In vitro, gene transcription shows that neurons and astrocytes respond to succinate and produce factors beneficial to revascularisation. Considering the important physiological role of GPR91, a second study was initiated to better determine the molecular determinants controlling the receptor's activity. The plasma membrane has classically been considered the typical GPCR's location of action but several new publications indicate the presence of such receptors within the cell. We observe, by confocal microscopy, the colocalisation of GPR91 (endogenous or transfected) with several marker of the endoplasmic reticulum. In addition, the gene induction observed when stimulated with succinate is severely affected in presence of the compound probenicid, an organic anion transporter inhibitor. We also demonstrate that the profile of genes expressed is largely dependent on the localisation of the receptor and consequently affects the organization of the tubular network ex vivo. Finally, we have identified a conserved region of GPR91 that acts as a retention signal. Lastly, we have uncovered the consequence of hypoxia affecting the post-translational modification of GPR91 and its change in location from the ER to the plasma membrane. This work confirms the role of GPR91 as a master regulator of angiogenesis in situations where succinate accumulates and demonstrated for the first time the existence, and importance, of an intracellular receptor activated by a metabolic intermediate. These results pave the way for future treatment targeting GPR91 in cerebral hypoxic ischemic pathologies and demonstrate the importance of taking into account the subcellular localisation in the drug discovery process.

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est un outil puissant permettant d’acquérir des profils biochimiques du cerveau et de quantifier de nombreux paramètres cellulaires in vivo. Au cours de ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à trois techniques : (i) la spectroscopie RMN du 1H pondérée en diffusion, (ii) la spectroscopie RMN du carbone-13 (13C) et (iii) de l’oxygène-17 (17O) pour étudier la microstructure et la fonction cellulaire in vivo.Les métabolites cérébraux sont des traceurs endogènes spécifiques d’un type cellulaire (neurones et astrocytes) dont la diffusion dépend des nombreuses propriétés cellulaires (par exemple la viscosité du cytosol et la restriction intracellulaire). L’étude de la dépendance du coefficient de diffusion (ADC) aux temps de diffusion (td) permet de quantifier chacun de ces paramètres. En particulier, la mesure de l’ADC aux td longs permet d’évaluer la compartimentation des métabolites. Dans une première étude, nous avons mesuré l’ADC de plusieurs métabolites neuronaux et astrocytaires sur une large gamme de td (de ~80 ms à ~1 s) dans un large voxel dans le cerveau du macaque. Aucune dépendance de l’ADC de l’ensemble des métabolites au td n’a été observée suggérant que les métabolites diffusent majoritairement dans les prolongements neuronaux (axones, dendrites) et astrocytaires et ne sont pas confinés dans le corps cellulaire ou les organelles (mitochondries, noyau). La grande taille du voxel, liée à la sensibilité de détection limitée, ne nous a pas permis d’étudier la compartimentation des métabolites dans la substance blanche (SB) et la substance grise (SG). C’est pourquoi, une nouvelle étude a été réalisée dans le cerveau de l’Homme. Les résultats montrent que les métabolites diffusent dans des structures fibrillaires dans la SG et la SB. Enfin, une dernière étude, avec une gamme de td jusqu’à 2 s chez le macaque, nous a permis d’estimer, à l’aide de modèles analytiques simples mimant la structure cellulaire, la longueur des fibres neuronales (~110 μm) et astrocytaires (~70 μm). L’oxydation du glucose au sein des mitochondries permet de produire l’ATP (adénosine triphosphate), la principale source d’énergie de l’organisme. La spectroscopie du 13C permet de mesurer la vitesse de dégradation du glucose dans le cycle de Krebs (VTCA). Cette méthode est largement reconnue pour l’étude du métabolisme. Néanmoins, de nombreuses limitations, en termes de modélisation des données en détection indirecte ou de puissance émise dans le contexte du découplage hétéronucléaire en détection directe, ont été rencontrées sur notre scanner IRM. C’est pourquoi, la spectroscopie du 17O a ensuite été développée afin de quantifier la vitesse de consommation de l’oxygène pendant la phosphorylation oxydative (CMRO2). Des développements méthodologiques et technologiques ont été nécessaires et sont encore en cours pour mettre en place et valider cette technique qui n’a encore jamais été utilisée chez le macaque. / Magnetic Resonance Spectroscopy is a unique tool that allows acquiring brain biochemical profiles and quantifying many cellular parameters in vivo. During this thesis, three different techniques have been developed: (i) 1H diffusion-weighted, (ii) carbone-13 (13C) and (iii) oxygen-17 (17O) NMR spectroscopy to study brain structure and function in vivo. Brain metabolites are cell-specific endogeneous tracers of the intracellular space whose translational diffusion depends on many cellular properties (e.g.: cytosol vicosity and intracellular restriction). Studying the variation of the diffusion coefficient (ADC) as a function of diffusion time (td) allows untangling and quantifying those parameters. In particular, measuring metabolites ADC at long diffusion times gives information about the metabolites compartmentation in cells. In a first study, we measured neuronal and astrocytic metabolites ADC over a large time window (from ~80 ms to ~1 s) in a large voxel in the macaque brain. No dependence of all metabolites ADC on td was observed suggesting that metabolites primarily diffuse in neuronal (dendrites and axons) and astrocytic processes and are not confined inside the cell body and organelles (nucleus, mitochondria). The large size of the voxel, due to low detection sensitivity, did not allow us to study metabolites compartmentation in pure white (WM) and grey matters (GM). Therefore, we performed a new study in the human brain. Results showed that in both WM and GM metabolites diffuse in fiber-like cell structure. Finally, using an even larger time window (up to 2 s) in the macaque brain and analytical models mimicking the cell structure, we estimated the length of neuronal (~110 μm) and astrocytic (~70 μm) processes. ATP (adenosine triphosphate), the main source of energy in the organism, is produced thanks to glucose oxidation inside the mitochondria. 13C NMR spectroscopy is a well-known technique to study brain energy metabolism and can be used to estimate the rate of glucose degradation within the Krebs cycle (VTCA). However, many limitations, concerning data modeling when performing indirect detection or power deposition due to heteronuclear decoupling during direct detection, were encountered on our MRI scanner. Therefore, 17O NMR spectroscopy was developed to quantify the rate of oxygen consumption during oxidative phosphorylation (CMRO2). Methodological and technological developments were necessary and are still ongoing to validate this technique, which has never been used with macaque.

Tesis por compendio / [ES] El cambio climático ha aumentado la exposición de los cultivos a estreses como la sequía o la salinidad y, por tanto, tiene un impacto negativo en el rendimiento de las plantas y los cultivos en un mundo con una población en aumento en el que la seguridad alimentaria está amenazada. Existe un interés en desarrollar variedades y cultivares con mayor tolerancia a estreses abióticos. Con esta finalidad desarrollamos un abordaje, en cultivos con un alto valor económico y nutricional como brócoli y melón, para identificar rasgos fisiológicos y bioquímicos posiblemente limitantes de estrés abiótico y, por tanto, podrían ser dianas biotecnológicas para mejorar la tolerancia a estrés abiótico o que pueden ser útiles para predecir la tolerancia de variedades no caracterizadas previamente. En la presente tesis, empleamos fisiología y metabolómica para identificar como rasgos distintivos de tolerancia a estrés por sequía en brócoli, la fotosíntesis neta, la eficiencia en el uso del agua, la conductancia estomática, el ácido abscísico, metabolitos relacionados con el metabolismo del azufre y otras moléculas como la urea, el ácido quínico y el ácido glucónico lactona. Por otra parte, en melón encontramos el potencial hídrico y varios aminoácidos como serina, fenilalanina, glicina, isoleucina, asparagina y triptófano como rasgos distintivos entre cultivares tolerantes o sensibles bajo estrés por sequía. Al respecto del estrés salino, identificamos el ratio Na+/K+ como rasgo distintivo tanto para brócoli como para melón mientras que sólo en brócoli, la transpiración y la conductancia estomática como rasgos fisiológicos útiles y, en cuanto a rasgos bioquímicos, hormonas como el ácido abscísico, el ácido jasmónico y el ácido indol-3-acético así como metabolitos del ciclo de Krebs y el contenido total de los relacionados glutatión, cisteína y metionina y prolina, se mostraron como indicadores de respuestas a estrés salino en brócoli. Sin embargo, en melón, encontramos prolina, fenilalanina e histidina como rasgo distintivo de tolerancia a estrés salino. También utilizamos herramientas metabolómicas para identificar que el ácido γ-aminobutírico correlaciona con un mejor sabor del brócoli. Además, dada la importancia del metabolismo del azufre y la tolerancia al estrés, así como su relación con las propiedades nutricionales del brócoli, llevamos a cabo la caracterización de las enzimas serina O-acetiltransferasas de brócoli. La evidencia que encontramos sugiere que las dianas biotecnológicas más prometedoras para mejorar la tolerancia al estrés son los parálogos BoSAT1d y BoSAT3. / [CA] El canvi climàtic ha augmentat l'exposició dels cultius a estressos com la sequera o la salinitat i, per tant, té un impacte negatiu en el rendiment de les plantes i els cultius en un món amb una població en augment on la seguretat alimentària està amenaçada . Hi ha un interès a desenvolupar varietats i cultivars amb més tolerància a estressos abiòtics. A aquest efecte desenvolupem un abordatge, en cultius amb un alt valor econòmic i nutricional com ara bròquil i meló, per identificar trets fisiològics i bioquímics possiblement limitants d'estrès abiòtic i, per tant, podrien ser dianes biotecnològiques per millorar la tolerància a estrès abiòtic o que poden ser útils per predir la tolerància de varietats no prèviament caracteritzades. En aquesta tesi, utilitzem fisiologia i metabolòmica per identificar com a trets distintius de tolerància a estrès per sequera en bròquil, la fotosíntesi neta, l'eficiència en l'ús de l'aigua, la conductància estomàtica, l'àcid abscísic, metabòlits relacionats amb el metabolisme del sofre i altres molècules com la urea, l'àcid quínic i l'àcid glucònic lactona. D'altra banda, en meló trobem el potencial hídric i diversos aminoàcids com a serina, fenilalanina, glicina, isoleucina, asparagina i triptòfan com a trets distintius entre cultivars tolerants o sensibles sota estrès per sequera. Pel que fa a l'estrès salí, identifiquem la ràtio Na+/K+ com a tret distintiu tant per a bròquil com per a meló mentre que només en bròquil, la transpiració i la conductància estomàtica com a trets fisiològics útils i, quant a trets bioquímics, hormones com l'àcid abscísic , l'àcid jasmònic i l'àcid indol-3-acètic així com metabòlits del cicle de Krebs i el contingut total dels relacionats glutatió, cisteïna i metionina i prolina, es van mostrar com a indicadors de respostes a estrès salí en bròquil. Tot i això, en meló, trobem prolina, fenilalanina i histidina com a tret distintiu de tolerància a estrès salí. També utilitzem eines metabolòmiques per identificar que l'àcid γ-aminobutíric correlaciona amb un millor sabor del bròquil. A més, atesa la importància del metabolisme del sofre i la tolerància a l'estrès, així com la seva relació amb les propietats nutricionals del bròquil, duem a terme la caracterització dels enzims serina O-acetiltransferases de bròquil. La seva evidència suggereix que les dianes biotecnològiques més prometedores per millorar la tolerància a l'estrès són els paràlegs BoSAT1d i BoSAT3. / [EN] Climate change has increased the exposure of crops to stresses like drought and salinity and, thus, it has a negative impact on plant performance and crop yield in a world with an increasing population. This threatens food security. There is an interest in developing new varieties and cultivars of crops with enhanced tolerance to abiotic stresses. With this aim, we developed an approach in crops with high economic and nutritional values, such as broccoli and melon, to identify physiological and biochemical traits that could be limiting factors for abiotic stress and, thus are likely biotechnological targets for improving abiotic stress tolerance or may be useful for predicting tolerance of uncharacterized varieties. In the present thesis, we used physiology and metabolomics to identify as distinctive traits for drought stress tolerance in broccoli, net photosynthesis, water use efficiency, stomatal conductance, abscisic acid, metabolites related to sulfur metabolism and other molecules such as urea, quinic acid and gluconic acid lactone. On the other hand, in melon, we found water potential and several amino acids as serine, phenylalanine, glycine, isoleucine, asparagine and tryptophan to be differential traits among tolerant and sensitive cultivars under drought stress. Regarding salt stress tolerance, we identified Na+/K+ ratios as a distinctive trait for both broccoli and melon whereas in broccoli, but not melon, transpiration, and stomatal conductance were useful physiological traits. Concerning biochemical traits, hormones, such as abscisic acid, jasmonic acid and indole-3-acetic acid, metabolites of the Krebs cycle and total content of the related glutathione, cysteine and methionine and proline proved to be indicative of saline stress responses in broccoli. However, in melon, we found only proline, phenylalanine and histidine as a distinctive trait of salt stress tolerance. We also used metabolomic tools to identify that γ-Aminobutyric acid correlates with a better taste in broccoli. Given the importance of sulfur metabolism in stress tolerance, as well as its link with the nutritional properties of broccoli, we also carried out the characterization of the serine O-acetyltransferase enzymes in broccoli. Among the eight isoforms found in this species, our data suggest that the most promising biotechnological targets for enhancing stress tolerance are the BoSAT1d and the BoSAT3 paralogues. / I am a recipient of the FPU19/01977 grant from the Spanish Ministerio de Universidades. This work was funded by the RTC-2017-6468-2-AR project (APROXIMACIONES MOLECULARES PARA INCREMENTAR LA TOLERANCIA A SALINIDAD Y SEQUÍA DEL BRÓCOLI) awarded by the “Agencia estatal de Investigación” / Chevilly Tena, S. (2024). Molecular approaches to characterize and improve abiotic stress tolerance in broccoli and other crops [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/213681 / Compendio