Las micosis oportunistas son infecciones fúngicas que se producen casi exclusivamente en pacientes con los mecanismos de defensa alterados. Aunque las terapias para las infecciones fúngicas han mejorado mucho en los últimos 10 años, las infecciones por hongos oportunistas siguen siendo una grave amenaza, especialmente para los pacientes inmunocomprometidos. El objetivo de esta tesis ha sido la de contribuir al desarrollo de alternativas terapéuticas experimentales para las micosis oportunistas causadas por los patógenos emergentes Acremonium, Sporothrix y Pseudallescheria / Scedosporium y Candida glabrata. Evaluaciones in vitro e in vivo se llevaron a cabo y han permitido proponer nuevas alternativas terapéuticas para las infecciones causadas por estos patógenos. / Opportunistic mycoses are fungal infections that occur almost exclusively in patients whose normal defence mechanisms are impaired. Although therapies for fungal infections have improved a lot over the last 10 years, opportunistic fungal infections are still a serious threat, especially for immunocompromised patients. The aim of this thesis has been to contribute to the development of experimental therapeutic alternatives to opportunistic mycoses caused by recent emerging pathogens Acremonium, Sporothrix and Pseudallescheria / Scedosporium and Candida glabrata. In vitro and in vivo evaluations were carried out and they have led us to propose new therapeutic alternatives for the infections caused by these pathogens.

Orientadora : Profª Drª Chirlei Glienke / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 29/09/2014 / Inclui bibliografia / Resumo: A obtenção de novos compostos bioativos com diferentes mecanismos de ação, menores efeitos indesejáveis, maior segurança na utilização e maior eficácia é uma necessidade constante na saúde, agronomia e indústria. Essa busca é indiscutivelmente importante tratando-se de compostos antimicrobianos devido a capacidade dos microrganismos tornarem-se resistentes aos mesmos. A bioprospecção é uma das ferramentas utilizadas para a obtenção de produtos naturais com essa ação. Uma das fontes promissoras utilizadas nesse tipo de investigação são os metabólitos secundários produzidos por microrganismos endofíticos obtidos a partir de plantas medicinais. Deste modo, o trabalho a seguir teve como propósito a obtenção de produtos bioativos produzidos por fungos endofíticos das folhas de Schinus terebinthifolius, árvore popularmente conhecida como aroeira. O trabalho de Bioprospecção de Metabólitos Secundários de Endófitos de S. terebinthifolius foi dividido em dois capítulos voltados à otimização da produção de extratos ativos. O primeiro objetiva a obtenção de compostos contra patógenos humanos e o segundo contra o fitopatógeno Phyllosticta citricarpa. O primeiro capítulo, intitulado "Antimicrobial potential of endophytic fungi from Schinus terebinthifolius", explorou a capacidade de produção de extratos de interesse a partir de três fungos pertencentes aos gêneros Alternaria, Bjerkandera e Xylaria, sob diferentes condições de cultivo, comprovando a influência das fontes de carbono e nitrogênio, pH e temperatura sobre o metabolismo secundário dos microrganismos. A obtenção do extrato do fungo Alternaria sp. Sect. Alternata teve a escala ampliada e o mesmo foi avaliado frente à bactéria Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Duas porções do extrato bruto foram ativas contra essa bactéria. Hexadecanoato de metila e um alcaloide pirrolopirazina foram identificados nas frações ativas do isolado de Alternaria sp. Sect. Alternata. O segundo estudo, "Biological activity of Diaporthe terebinthifolii extracts against Phyllosticta citricarpa", possibilitou a obtenção de uma fração biologicamente ativa contra o fitopatógeno. Da biodiversidade fúngica estudada dois isolados de D. terebinthifolii foram os mais promissores contra P. citricarpa. Diferentes meios de cultivo foram avaliados na seleção do isolado mais eficiente, o qual foi escolhido para a produção do extrato em maior escala. O meio sólido arroz foi o mais apropriado. Foram identificados alguns compostos de interesse produzidos pelo endófito: álcool fenetílico, verbanol, hexadecanoato de metila e acetato de verbenil. De modo geral, os fungos endofíticos isolados das folhas de aroeira apresentaram interessante potencial biotecnológico, tanto para a área médica como agronômica, pela produção de metabólitos secundários com atividade antimicrobiana. Palavras-chave: endófitos - metabólitos secundários - Schinus terebinthifolius - atividade antimicrobiana / Abstract: The obtainment of new bioactive compounds with different mechanisms of action, minor side effects, more effective and safest is a constant need in health, agronomy and industry. This search is unquestionably important in the case of antimicrobial compounds because of the ability of microorganisms become resistant to them. The bioprospection is one of the tools used to obtain natural products with this action. One of the promising sources used in this type of investigation are secondary metabolites produced by endophytic microorganisms obtained from medicinal plants. Thus, the following work had as purpose obtaining bioactive products produced by endophytic fungus from the leaves of Schinus terebinthifolius, tree popularly known as aroeira. The work "Secondary Metabolites Bioprospection of S. terebinthifolius Endophytes" was divided into two chapters. The first one focused in the optimization of active extracts production against human pathogens and the second in the obtainment of a product against the phytopathogen Phyllosticta citricarpa. The first chapter, entitled "Antimicrobial potential of endophytic fungi from Schinus terebinthifolius", explored the capacity of production of interest extracts using three fungi belonging to the genera Alternaria, Bjerkandera and Xylaria under different culture conditions demonstrating the influence of carbon and nitrogen sources, pH and temperature on the secondary metabolism of these microorganisms. The scale production of Alternaria sp. Sect. Alternata extract was expanded and the product has been evaluated against the methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Two active portions against the microorganism were isolated from the crude extract. Methyl hexadecanoate and a pyrrolopyrazine alkaloid were identified in the active fractions of the Alternaria sp. Sect. Alternata isolated. The second study, "Biological activity of Diaporthe terebinthifolii extracts against Phyllosticta citricarpa", allowed obtaining a biologically active fraction against the phytopathogen. Of the fungal biodiversity studied two isolates of D. terebinthifolii were the most promising against P. citricarpa. Different culture media were evaluated for selecting the most efficient isolate for the production of the extract on a larger scale. The rice solid medium was the most appropriate. Some compounds of interest produced by the endophyte were identified: phenylethyl alcohol, verbanol, methyl-hexadecanoate and verbenyl acetate. In general, the endophytic fungi isolated from the leaves of aroeira showed interesting biotechnological potential, both for medical and agronomic field, by the production of secondary metabolites with antimicrobial activity. Keywords: endophytes - secondary metabolites - Schinus terebinthifolius - antimicrobial activity

A produção de atividade antimicrobiana por Bacillus sp. P11 foi testada em diferentes subprodutos da indústria de alimentos. Farelo de soja foi o meio escolhido para determinar o efeito de três variáveis (temperatura, pH inicial e concentração do substrato) sobre a atividade antimicrobiana pela metodologia de superfície de resposta, utilizando um experimento fatorial 23. Na faixa estudada, temperatura e pH inicial do meio apresentam efeito significativo sobre a produção de atividade antimicrobiana, já a concentração do substrato não teve nenhum efeito significativo. Os dados mostraram produção máxima em pH inicial entre 7,0 e 8,5 e temperatura entre 39 e 42ºC. Nessas condições a produção de atividade antimicrobiana por Bacillus sp. P11 em farelo de soja foi comparada com a produção em meio de cultivo comercial (caldo BHI). Os resultados obtidos para os dois meios de cultura foram semelhantes, indicando que o farelo de soja pode ser um substrato de baixo custo para produção de antimicrobianos por Bacillus sp. P11. Para demostrar o efeito da temperatura e do pH na produção de peptídeos antimicrobianos, verificou-se a expressão de sboA (subtilosina A) e ituD (iturina A) em Bacillus sp. P11, utilizando a metodologia de qRT-PCR. A produção de subtilosina A e iturina A foi confirmada por espectrometria de massas. A expressão de sboA e ituD foi fortemente afetada pelo pH e pela temperatura e qRT-PCR provou ser uma poderosa ferramenta para investigar o potencial da cepa em produzir subtilosina A e iturina A. Além disso, a produção de peptídeos antimicrobianos por Bacillus sp. P11 foi investigada na presença de células inativadas termicamente de bactérias e fungos. A cepa exibiu maior atividade antimicrobiana na presença de células inativadas de Staphylococcus aureus ou Aspergillus parasiticus. Nessas condições a expressão de genes essenciais relacionadas com a biossíntese dos peptídeos antimicrobianos surfactina, iturina A, subtilosina A e fengicina foi investigada por qRT-PCR. Os resultados sugerem que o aumento da atividade antimicrobiana foi relacionado com a produção de iturina A, um peptídeo antimicrobiano que mostra forte atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de fungos e pode ser usado no controle biológico de doenças de plantas. Por fim, foram testadas diferentes metodologias para a purificação parcial dos peptídeos antimicrobianos produzidos por Bacillus sp. P11. Os melhores resultados foram obtidos por partição em sistema aquoso bifásico com o sal sulfato de zinco, porém estudos adicionais são necessários. / Production of antimicrobial activity by Bacillus sp. P11 was tested in different byproducts of food industry. Soybean meal was the selected medium to determine the effect of three variables (temperature, pH and substrate concentration) on the antimicrobial activity by response surface methodology, using a 23 factorial design. In the range studied, temperature and initial pH of the medium had a significant effect on the production of antimicrobial activity and substrate concentration had no significant effect. The data showed maximum production at initial pH between 7.0 and 8.5 and temperature between 39 and 42°C. Under these conditions the production of antimicrobial activity by Bacillus sp. P11 in soybean meal was compared with the commercial medium (BHI). The results for both culture media were similar, indicating that soybean meal can be a low cost substrate for the production of antimicrobial activity of Bacillus sp. P11. To demonstrate the effect of temperature and pH on the production of antimicrobial peptides, we studied the expression of sboA (subtilosin A) and ituD (iturin A) in Bacillus sp. P11, using qRT-PCR methodology. The production of subtilosin A and iturin A was confirmed by mass spectrometry. The expression of sboA and ituD was strongly affected by pH and temperature and qRT-PCR proved to be a powerful tool to investigate the potential of the strain to produce subtilosin A and iturin A. In addition, the production of antimicrobial peptides by Bacillus sp. P11 was investigated in the presence of thermally inactivated cells of bacteria and fungi. The strain exhibited higher antimicrobial activity in presence of inactivated cells of Staphylococcus aureus or Aspergillus parasiticus. Under these conditions the expression of essential genes related to biosynthesis of antimicrobial peptides surfactin, iturin A, subtilosin A and fengycin was investigated by qRT-PCR. The results suggest that the increase in antimicrobial activity was related to the production of iturin A, an antimicrobial peptide that shows strong antimicrobial activity against a broad spectrum of fungi and can be used in biological control of plant diseases. Finally, we tested different methods for partial purification of antimicrobial peptides produced by Bacillus sp. P11. The best results were obtained by partition in aqueous two-phase system with the salt zinc sulfate, but further studies are needed.

AQUINO, L. F. de. Biorremediação de sedimentos de manguezal contaminados com n-hexadecano por consórcio de actinobactérias imobilizado em esferas de quitosana. 2015. 54 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Marinhas Tropicais) - Instituto de Ciências do Mar, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Geovane Uchoa (geovane@ufc.br) on 2016-06-22T14:07:01Z No. of bitstreams: 1 2015_dislfdeaquino.pdf: 1043349 bytes, checksum: caa0e71b81a94be9f97fb9ebec4c811a (MD5) / Approved for entry into archive by Nadsa Cid (nadsa@ufc.br) on 2016-06-22T18:08:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dislfdeaquino.pdf: 1043349 bytes, checksum: caa0e71b81a94be9f97fb9ebec4c811a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-22T18:08:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dislfdeaquino.pdf: 1043349 bytes, checksum: caa0e71b81a94be9f97fb9ebec4c811a (MD5) Previous issue date: 2015 / Mangrove areas suffer from the direct impact of deforestation for aquiculture and/or urban development, as well as the impacts of pollution. Among the remediation technologies, bioremediation stands out as one of the most suitable for the recovery of contaminated mangrove areas, due to the complexity of this ecosystem. Bioremediation consists of a set of processes in which living organisms are employed, typically plants or microorganisms, aiming to remove or mitigate the effect of environmental pollutants. This study evaluated the capability of seven bacterial strains, previously isolated from mangrove sediment contaminated with nhexadecane, to degrade the aforementioned pollutant in sediment microcosms inoculated with those selected bacterial strains in suspension, free form, or as a consortium immobilized in chitosan beads. Was also evaluated the effects of native micro biota and the biodegradability of the chitosan beads in treatments. Biodegradation potential of the bacterial consortium was evaluated by monitoring the desidrogenasic activity (DHA), estimated by measurements of formazan concentration. Among the seven tested strains, 2 actinobacteria, Gordonia HEXBA05 and Micrococcus HEXBA06, have excelled and were gathered in a consortium CHB56 to be tested in sterilized and unsterilized sediment, both in free form and immobilized in chitosan beads. The consortium, immobilized at a concentration of 106 CFU/g of chitosan beads and inoculated in unsterilized mangrove sediment microcosms contaminated with 10 mg/g of n-hexadecane showed significantly different desidrogenasic activity from the control, demonstrating the capacity to metabolize the pollutant of the consortium. The chitosan beads were completely biodegraded by the native micro biota of mangrove sediment in 12 days. The results of this study point to the fact that the consortium CHB56 immobilized in chitosan beads represents a new option of bioremediation technology, and can be applied in mangroves contaminated with n-hexadecane, an alkane commonly found in oil spill areas, with the advantages of being an ecologically safe technology of easy application and handling. / As áreas de manguezais sofrem com os impactos diretos do seu desmatamento para atividade de aquicultura e/ou urbanização, bem como com os impactos da poluição. Dentre as tecnologias de remediação disponíveis, a biorremediação se destaca como a mais adequada para recuperação de áreas contaminadas de manguezais devido a complexidade desse ecossistema. A biorremediação consiste em um conjunto de processos nos quais são empregados organismos vivos, normalmente plantas ou micro-organismos, com intuito de remover ou atenuar poluentes ambientais. Neste estudo foi avaliado a capacidade de 7 estirpes de bactérias, previamente isoladas de sedimentos de manguezal contaminados com n-hexadecano, para degradar esse poluente em microcosmos de sedimentos inoculados com as estirpes de bactérias selecionadas na forma livre, em suspensão, ou na forma de um consórcio imobilizado em esferas de quitosana. Também foram avaliados os efeitos da microbiota nativa e a biodegradabilidade das esferas de quitosana nos tratamentos. O potencial biodegradativo do consórcio de bactérias foi avaliado pelo monitoramento da atividade desidrogenásica (DHA), estimada por medidas da concentração de formazan. Dentre as sete estirpes testadas, duas actinobactérias, Gordonia HEXBA05 e Micrococcus HEXBA06, se destacaram e foram reunidas em um consórcio CHB56 e testadas em sedimentos esterilizados e não esterilizados, na forma livre e imobilizada em esferas de quitosana. O consórcio imobilizado na concentração de 106 UFC/g de esfera de quitosana e inoculado em microcosmos de sedimento de manguezal não esterilizado contaminado com 10 mg/g de n-hexadecano, mostrou atividade desidrogenásica significativamente diferente do controle, demonstrando a capacidade do consórcio para metabolizar o poluente. As esferas de quitosana foram completamente biodegradadas pela microbiota nativa do sedimento de manguezal em 12 dias. Os resultados desse estudo apontam que o consórcio CHB56 imobilizado em esferas de quitosana representa uma nova opção de tecnologia de bioaumentação, podendo ser aplicada em manguezais contaminados com nhexadecano, um alcano comumente encontrado em áreas de derramamento de petróleo, com a vantagem de ser uma tecnologia ecologicamente segura, de fácil manejo e aplicação.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004Bitstream added on 2014-06-13T19:01:37Z : No. of bitstreams: 1 nogueira_mf_dr_botfmvz.pdf: 3832737 bytes, checksum: d7fb9761e67373f1ac33a3563a947c18 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Serpentes Crotalus durissus terrificus foram avaliadas em três ocasiões: assim que retiradas da natureza e entregues ao Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP) da UNESP, Campus de Botucatu, após um período de quarentena e depois da permanência por aproximadamente 90 dias em uma baia externa. Foram colhidas amostras de sangue para realização de hemograma e sorologia para Paramyxovirus Ofídico (OPMV), swab de glote e lavado traqueopulmonar, para avaliação citológica e pesquisa de OPMV, Mycoplasma e bacilos Gram-negativos. Nos animais que foram a óbito realizaram-se necropsias e pesquisas dos microrganismos citados em traquéia e pulmão. Cepas de Salmonella, Pseudomonas e Aeromonas isoladas foram submetidas a testes de susceptibilidade a drogas. Na primeira colheita (n = 51), os títulos ao teste de inibição da hemaglutinação foram considerados inespecíficos e duas serpentes foram positivas para o OPMV, ao nested PCR. Na quarentena, nove exemplares vieram a óbito, duas das quais mostraram-se positivas para o OPMV. Na segunda colheita (n = 42), os títulos mantiveram-se, porém nove serpentes foram positivas para o OPMV, duas das quais ao teste de hemaglutinação da cultura de células VERO, tornando-se este o primeiro relato do isolamento do OPMV a partir de um animal vivo. Na baia externa, 24 animais foram a óbito, dos quais 23 foram positivos para o OPMV. Na terceira colheita (n = 18), os títulos variaram de 160 a 5.120, e amostras de todas as serpentes foram positivas para o OPMV. Na avaliação citológica, estes lavados apresentaram elevada celularidade com características de processo inflamatório de misto a macrofágico. Salmonella e Pseudomonas foram isoladas a partir de todas as colheitas, porém Aeromonas apenas de amostras de órgãos. Dentre as drogas testadas, os três gêneros de interesse... . / Crotalus durissus terrificus snakes were evaluated in three occasions: as soon as they were captured from nature and delivered at the Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP) - UNESP, Botucatu, SP, Brazil; after quarantine; and after spent nearly 90 days in an outside enclosure. Blood samples were collected for hematology and Ophidian Paramyxovirus (OPMV) serology, and glottis swabs and tracheal washings for cytological evaluation, OPMV, Mycoplasma and Gramnegative bacilli search. Dead animals were necropsied and the abovementioned microorganisms investigated in trachea and lung. Salmonella, Pseudomonas and Aeromonas isolated strains were submitted to antimicrobial susceptibility tests. In the first sampling (n = 51), the titles to the hemagglutination inhibition test were considered negative and two snakes were nested PCR positives to OPMV. During quarantine, nine specimens died, and two of them were positives to OPMV. In the second sampling (n = 42), titles had no change, but nine snakes turned positive to OPMV, two of them in the hemagglutination test of the VERO cells culture, what is the first report of the OPMV isolation from a live animal. In the external enclosure, 24 animals died, with 23 revealing to be OPMV positive. In the third sampling (n = 18), serological titles ranged from 160 to 5,120, and samples from all snakes were OPMV positives. In the cytological evaluation, these washings showed to be highly cellular with features of mixed cell to macrophagic inflammation. Salmonella and Pseudomonas strains were isolated in all three samplings, but Aeromonas only from trachea and lung samples. Among all the tested drugs, the three bacterial genera were susceptible to amikacin, gentamicin and enrofloxacin. The isolation of Mycoplasma was not obtained. Nematodes of the genus Rhabdias were observed in the tracheal washings. OPMV was the microorganism isolated in... (Complete abstract, click electronic address below).

Orientadora : Profª Drª Vanete Thomaz Soccol / Coorientadora : Profª Drª Juliana Ferreira de Moura / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 13/12/2016 / Inclui referências : f. 64-72 / Resumo: Leishmania Ross, 1903 é um protozoário que causa infecção parasitária denominada leishmaniose. Apresentam-se em duas formas clínicas principais, a Leishmaniose Cutânea (LC) e Leishmaniose Visceral (LV). Mais de um milhão de novos casos ocorrem anualmente em todo o mundo, acometendo pessoas de todas as faixas etárias de ambos os sexos. Uma das dificuldades encontradas para o controle dessa doença é a falta de diagnóstico específico, pois não há um que seja considerado padrão ouro. O objetivo deste trabalho foi avaliar doze peptídeos sintéticos, mimotopos de L. amazonensis, quanto ao potencial antigênico para fins imunodiagnósticos. Uma infecção experimental de Balb C com L. amazonensis foi realizada, seguida da purificação das IgGs dos soros por precipitação, cromatografia e western blotting. Após, foi feita a técnica phage display e teste Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) para seleção dos fagos reagentes. Esses fagos foram amplificados e, os peptídeos pertencentes a esses fagos, sequenciados e analisados in silico. Doze peptídeos foram selecionados, sintetizados quimicamente por Fmoc e usados na substituição aos antígenos totais de L. braziliensis e L. infantum. Os peptídeos foram testados frente aos pools de soros humano positivo e negativo para LC e frente aos pools de soros canino positivo e negativo para LV pelo teste ELISA. Diferentes concentrações dos peptídeos e diluições dos soros foram testadas e são discutidas no presente trabalho. Com base na análise feita por meio das absorbâncias, de doze peptídeos, dois apresentaram significativa diferenciação na reatividade entre pool positivo (soros de humanos com LC) e negativo (soros de humanos). Esses doze peptídeos foram testados também frente aos soros de cães com LV e, dois apresentaram significativa diferenciação na reatividade entre pool positivo e pool negativo. Esse estudo indicou que, os peptídeos poderiam representar vantagens por serem antígenos sintéticos com reprodutibilidade na sua produção, podendo ser usados para imunodiagnóstico de LC ou LV. Palavras-chave: Phage Display. ELISA. Peptídeo sintético. Imunodiagnóstico. / Abstract: Leishmania Ross, 1903 is a protozoa that causes parasitic infection called leishmaniasis. They present themselves in two main clinical forms, Cutaneous Leishmaniasis (CL) and Visceral Leishmaniasis (VL). More than one million new cases occur annually worldwide, affecting people of all the age bands of both sexes. One of the difficulties encountered for controlling this disease is the lack of specific diagnosis, because there is no one that is regarded as gold standard. The objective of this work was to evaluate twelve synthetic peptides, mimotopos of L. amazonensis, for the antigenic potential for purposes immunodiagnostic tests. An experimental infection of Balb C with L. amazonensis was performed, followed by the purification of the IgGs of sera by precipitation, chromatography and western blotting. After, it was made the technique phage display and test Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) for selecting the phage reagents. These phage they were amplified and, the peptides belonging to these phage, sequenced and analyzed in silico. Twelve peptides were selected, chemically synthesized by Fmoc and used in substitution to the total antigens of L. braziliensis and L. infantum. The peptides have been tested against the pools of positive human serum and negative for CL and front of the positive and negative canine serum pools for VL by ELISA test. Different concentrations of serum peptides and dilutions have been tested and are discussed ain this work. Based on the analysis made through the absorbances, of twelve peptides, two presented significant differentiation in the reactivity between positive pool (serum of humans with CL) and negative (sera of humans). These twelve peptides were also tested against the sera of dogs with VL and, two presented significant differentiation in the reactivity between positive pool and negative pool. This study indicated that peptides could represent advantages for being synthetic antigens with reproducibility in their production, and can be used for immunodiagnostic of CL or VL. Keywords: Phage Display. ELISA. Synthetic Peptide. Immunodiagnostic.

Resumo: Serpentes Crotalus durissus terrificus foram avaliadas em três ocasiões: assim que retiradas da natureza e entregues ao Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP) da UNESP, Campus de Botucatu, após um período de quarentena e depois da permanência por aproximadamente 90 dias em uma baia externa. Foram colhidas amostras de sangue para realização de hemograma e sorologia para Paramyxovirus Ofídico (OPMV), swab de glote e lavado traqueopulmonar, para avaliação citológica e pesquisa de OPMV, Mycoplasma e bacilos Gram-negativos. Nos animais que foram a óbito realizaram-se necropsias e pesquisas dos microrganismos citados em traquéia e pulmão. Cepas de Salmonella, Pseudomonas e Aeromonas isoladas foram submetidas a testes de susceptibilidade a drogas. Na primeira colheita (n = 51), os títulos ao teste de inibição da hemaglutinação foram considerados inespecíficos e duas serpentes foram positivas para o OPMV, ao nested PCR. Na quarentena, nove exemplares vieram a óbito, duas das quais mostraram-se positivas para o OPMV. Na segunda colheita (n = 42), os títulos mantiveram-se, porém nove serpentes foram positivas para o OPMV, duas das quais ao teste de hemaglutinação da cultura de células VERO, tornando-se este o primeiro relato do isolamento do OPMV a partir de um animal vivo. Na baia externa, 24 animais foram a óbito, dos quais 23 foram positivos para o OPMV. Na terceira colheita (n = 18), os títulos variaram de 160 a 5.120, e amostras de todas as serpentes foram positivas para o OPMV. Na avaliação citológica, estes lavados apresentaram elevada celularidade com características de processo inflamatório de misto a macrofágico. Salmonella e Pseudomonas foram isoladas a partir de todas as colheitas, porém Aeromonas apenas de amostras de órgãos. Dentre as drogas testadas, os três gêneros de interesse... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: Crotalus durissus terrificus snakes were evaluated in three occasions: as soon as they were captured from nature and delivered at the Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP) - UNESP, Botucatu, SP, Brazil; after quarantine; and after spent nearly 90 days in an outside enclosure. Blood samples were collected for hematology and Ophidian Paramyxovirus (OPMV) serology, and glottis swabs and tracheal washings for cytological evaluation, OPMV, Mycoplasma and Gramnegative bacilli search. Dead animals were necropsied and the abovementioned microorganisms investigated in trachea and lung. Salmonella, Pseudomonas and Aeromonas isolated strains were submitted to antimicrobial susceptibility tests. In the first sampling (n = 51), the titles to the hemagglutination inhibition test were considered negative and two snakes were nested PCR positives to OPMV. During quarantine, nine specimens died, and two of them were positives to OPMV. In the second sampling (n = 42), titles had no change, but nine snakes turned positive to OPMV, two of them in the hemagglutination test of the VERO cells culture, what is the first report of the OPMV isolation from a live animal. In the external enclosure, 24 animals died, with 23 revealing to be OPMV positive. In the third sampling (n = 18), serological titles ranged from 160 to 5,120, and samples from all snakes were OPMV positives. In the cytological evaluation, these washings showed to be highly cellular with features of mixed cell to macrophagic inflammation. Salmonella and Pseudomonas strains were isolated in all three samplings, but Aeromonas only from trachea and lung samples. Among all the tested drugs, the three bacterial genera were susceptible to amikacin, gentamicin and enrofloxacin. The isolation of Mycoplasma was not obtained. Nematodes of the genus Rhabdias were observed in the tracheal washings. OPMV was the microorganism isolated in... (Complete abstract, click electronic address below). / Orientador: Carlos Alberto de Magalhães Lopes / Coorientador: João Pessoa Araújo Junior / Doutor

Resumo: Não disponível / Abstract: Not available / Orientador: Vanildo Luiz Del Bianchi / Coorientador: Ranulfo Monte Alegre / Banca: Fernando Leite Hoffmann / Banca: Iracema de Oliveira Moraes / Mestre

A produção de atividade antimicrobiana por Bacillus sp. P11 foi testada em diferentes subprodutos da indústria de alimentos. Farelo de soja foi o meio escolhido para determinar o efeito de três variáveis (temperatura, pH inicial e concentração do substrato) sobre a atividade antimicrobiana pela metodologia de superfície de resposta, utilizando um experimento fatorial 23. Na faixa estudada, temperatura e pH inicial do meio apresentam efeito significativo sobre a produção de atividade antimicrobiana, já a concentração do substrato não teve nenhum efeito significativo. Os dados mostraram produção máxima em pH inicial entre 7,0 e 8,5 e temperatura entre 39 e 42ºC. Nessas condições a produção de atividade antimicrobiana por Bacillus sp. P11 em farelo de soja foi comparada com a produção em meio de cultivo comercial (caldo BHI). Os resultados obtidos para os dois meios de cultura foram semelhantes, indicando que o farelo de soja pode ser um substrato de baixo custo para produção de antimicrobianos por Bacillus sp. P11. Para demostrar o efeito da temperatura e do pH na produção de peptídeos antimicrobianos, verificou-se a expressão de sboA (subtilosina A) e ituD (iturina A) em Bacillus sp. P11, utilizando a metodologia de qRT-PCR. A produção de subtilosina A e iturina A foi confirmada por espectrometria de massas. A expressão de sboA e ituD foi fortemente afetada pelo pH e pela temperatura e qRT-PCR provou ser uma poderosa ferramenta para investigar o potencial da cepa em produzir subtilosina A e iturina A. Além disso, a produção de peptídeos antimicrobianos por Bacillus sp. P11 foi investigada na presença de células inativadas termicamente de bactérias e fungos. A cepa exibiu maior atividade antimicrobiana na presença de células inativadas de Staphylococcus aureus ou Aspergillus parasiticus. Nessas condições a expressão de genes essenciais relacionadas com a biossíntese dos peptídeos antimicrobianos surfactina, iturina A, subtilosina A e fengicina foi investigada por qRT-PCR. Os resultados sugerem que o aumento da atividade antimicrobiana foi relacionado com a produção de iturina A, um peptídeo antimicrobiano que mostra forte atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de fungos e pode ser usado no controle biológico de doenças de plantas. Por fim, foram testadas diferentes metodologias para a purificação parcial dos peptídeos antimicrobianos produzidos por Bacillus sp. P11. Os melhores resultados foram obtidos por partição em sistema aquoso bifásico com o sal sulfato de zinco, porém estudos adicionais são necessários. / Production of antimicrobial activity by Bacillus sp. P11 was tested in different byproducts of food industry. Soybean meal was the selected medium to determine the effect of three variables (temperature, pH and substrate concentration) on the antimicrobial activity by response surface methodology, using a 23 factorial design. In the range studied, temperature and initial pH of the medium had a significant effect on the production of antimicrobial activity and substrate concentration had no significant effect. The data showed maximum production at initial pH between 7.0 and 8.5 and temperature between 39 and 42°C. Under these conditions the production of antimicrobial activity by Bacillus sp. P11 in soybean meal was compared with the commercial medium (BHI). The results for both culture media were similar, indicating that soybean meal can be a low cost substrate for the production of antimicrobial activity of Bacillus sp. P11. To demonstrate the effect of temperature and pH on the production of antimicrobial peptides, we studied the expression of sboA (subtilosin A) and ituD (iturin A) in Bacillus sp. P11, using qRT-PCR methodology. The production of subtilosin A and iturin A was confirmed by mass spectrometry. The expression of sboA and ituD was strongly affected by pH and temperature and qRT-PCR proved to be a powerful tool to investigate the potential of the strain to produce subtilosin A and iturin A. In addition, the production of antimicrobial peptides by Bacillus sp. P11 was investigated in the presence of thermally inactivated cells of bacteria and fungi. The strain exhibited higher antimicrobial activity in presence of inactivated cells of Staphylococcus aureus or Aspergillus parasiticus. Under these conditions the expression of essential genes related to biosynthesis of antimicrobial peptides surfactin, iturin A, subtilosin A and fengycin was investigated by qRT-PCR. The results suggest that the increase in antimicrobial activity was related to the production of iturin A, an antimicrobial peptide that shows strong antimicrobial activity against a broad spectrum of fungi and can be used in biological control of plant diseases. Finally, we tested different methods for partial purification of antimicrobial peptides produced by Bacillus sp. P11. The best results were obtained by partition in aqueous two-phase system with the salt zinc sulfate, but further studies are needed.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O adenovÃrus humano (ADVh) à um agente viral comumente relacionado a infecÃÃes do trato respiratÃrio, tanto superior quanto inferior, principalmente em crianÃas com idade inferior a cinco anos. Os ADVh sÃo classificados em sete espÃcie (A-G) e divididos em 54 tipos. A proteÃna hexon à a principal responsÃvel pela variaÃÃo antigÃnica inter e intragrupos desse vÃrus. O objetivo desse estudo foi caracterizar os perÃodos de circulaÃÃo e a diversidade de espÃcie e tipos de ADVh encontrados em Fortaleza, Cearà â Brasil, durante 150 meses consecutivos (janeiro de 2001 a junho de 2013). A imunofluorescÃncia indireta (IFI) foi utilizada para a detecÃÃo dos ADVh, vÃrus sincicial respiratÃrio, influenza A e B, parainfluenza 1, 2 e 3, jà a imunofluorescÃncia direta (IFD) foi utilizado na detecÃÃo do metapneumovÃrus humano (MPVh) . A PCR e Nested-PCR seguida do sequenciamento das seis primeiras regiÃes hipervariÃvel do gene Hexon foram utilizadas para caracterizar as espÃcies e tipos dos ADVh. Os ADVh foram detectados 290 (3,41%) das 8.517 amostras, sendo 60 (20,69%) destas encontradas em coinfecÃÃo com um, dois ou trÃs vÃrus. Um total de 190 (65,52%) ADVh foram molecularmente caracterizados, sendo 162 pertencente à espÃcie ADVh-B (85,72%), 21 à ADVh-C (11,11%) e 6 à ADVh-E (3,17%), ficando um cepa sem identificaÃÃo. As espÃcies circularam durante todo o perÃodo analisados sendo observado o predomÃnio da espÃcie B em quase todos os anos. Sete diferentes tipos foram identificados circulando em Fortaleza durante o perÃodo analisado. Os tipos predominantes foram o 3 (67,73%) e o 7 (17,80%). O ADVh-3 foi encontrado em todos os anos, jà o ADVh-7 nÃo foi observado nos anos de 2006, 2010 e 2011. Somente em 2011 todos os tipos identificados da espÃcie C circularam, e o Ãnico representante da espÃcie E, o ADVh-4, comeÃou a ser identificado na nossa populaÃÃo apenas a partir de 2007. O melhor conhecimento da circulaÃÃo de ADVh poderà ser alcanÃado se a vigilÃncia for contÃnua e associada ao uso de mÃtodos de maior sensibilidade na detecÃÃo desses vÃrus.