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Sélection sans marqueur pour l'ingénierie ciblée du génome et la thérapie cellulaireLevesque, Sébastien 13 December 2023 (has links)
Les technologies CRISPR-Cas9 révolutionnent la façon dont on interroge les systèmes biologiques et offrent un immense potentiel thérapeutique pour diverses maladies génétiques. Malgré les progrès fulgurants des dernières années, l'ingénierie ciblée du génome des cellules humaines demeure un défi de taille dans certains types cellulaires. La cosélection sans marqueur est une méthode qui consiste à introduire une mutation précise dans un gène endogène pour conférer de la résistance à une molécule toxique pour les cellules non modifiées, permettant l'enrichissement des cellules modifiées par CRISPR-Cas9. Comme deux différents évènements de modifications génétiques ne sont pas statistiquement indépendants au sein d'une même cellule, la sélection des cellules ayant la première modification permet l'enrichissement d'une deuxième modification d'intérêt à un locus distant par cosélection. Dans le cadre du premier chapitre de cette thèse, nous avons développé une méthode de cosélection pour permettre l'enrichissement des cellules modifiées par éditeur de type PE, de l'anglais pour « prime editing ». Nous avons identifié des mutations dominantes avec gain de fonction du gène ATP1A1 qui confèrent différents niveaux de résistance à l'ouabaïne, un inhibiteur de la pompe à sodium/potassium (ATPase Na⁺/K⁺). Ces nouvelles mutations permettent d'effectuer jusqu'à trois étapes successives de cosélection en augmentant la dose d'ouabaïne à chape étape. La cosélection facilite grandement l'enrichissement de populations de cellules hautement modifiées et l'isolement de clones dérivés d'une seule cellule homozygote pour une modification désirée. La caractérisation des clones a révélé que l'utilisation de l'éditeur PE3 génère fréquemment des modifications non voulues et plus difficiles à détecter étant donné leurs plus grandes tailles. En somme, nos méthodes devraient faciliter l'ingénierie ciblée du génome des cellules humaines pour créer des modèles cellulaires pour la recherche biomédicale. Dans le cadre du deuxième chapitre de cette thèse, nous avons développé une méthode de sélection sans marqueur pour l'ingénierie ciblée du génome des lymphocytes T pour diverses applications en thérapie cellulaire. Cette méthode permet de simultanément intégrer un transgène codant pour un récepteur antigénique chimérique (CAR) et une mutation gain de fonction dans le locus MTOR. Cette mutation permet la sélection sans marqueur avec la rapamycine, un inhibiteur de mTOR couramment utilisé en clinique comme immunosuppresseur. Notre approche permet donc d'enrichir les cellules modifiées par CRISPR-Cas9 qui expriment un transgène thérapeutique d'intérêt. À partir d'un rapporteur fluorescent de signalisation mTORC1, nous avons démontré que mTOR demeure fonctionnelle en présence de rapamycine après l'intégration du transgène d'intérêt et de la mutation dominante. Cette méthode permet l'enrichissement efficace de lymphocytes T primaires exprimant un récepteur CD19-CAR. À partir d'essais de cytotoxicité in vitro et d'un modèle murin de leucémie lymphoblastique aiguë, nous avons observé un effet combiné des lymphocytes CAR-T et de la rapamycine en ciblant des lymphocytes B cancéreux (CD19⁺). En somme, notre stratégie devrait faciliter l'ingénierie ciblée du génome des lymphocytes T pour diverses applications en thérapie cellulaire. / CRISPR-based technologies are revolutionizing the way we interrogate biological systems, and offer a diverse array of therapeutic opportunities to treat genetic diseases. Despite significant improvements, genome editing in human cells remains challenging in a variety of cell types. Marker-free co-selection is based on the installation of a specific mutation at an endogenous locus to confer cellular resistance to a molecule that is otherwise toxic for unmodified cells, allowing the enrichment of CRISPR-engineered cells. Considering that two genome editing events at distant loci are not statistically independent within the same cell, selection for the first modification allows the enrichment of a second modification of interest via co-selection. As part of the first chapter of this thesis, we developed a marker-free co-selection method to perform successive rounds of prime editing in human cells. We first identified new ATP1A1 gain-of-function mutations to confer different levels of resistance to ouabain, a plant-derived inhibitor of the essential and ubiquitous sodium-potassium pump (Na⁺/K⁺ ATPase). Introducing these mutations sequentially allowed up to three successive rounds of selection to be performed by increasing the dose of ouabain at each step. Co-selection greatly facilitates the isolation of highly-modified populations of cells and homozygous single cell-derived clones. Characterization of single cell-derived clones revealed that the use of a complementary nick sgRNA (PE3) frequently generates tandem duplications and large deletions at the target site. Overall, our co-selection toolkit should facilitate prime editing in human cells to create cellular models for biomedical research. As part of the second chapter of this thesis, we have developed a marker-free selection method to enrich CRISPR-engineered T cells for cell therapy applications. We devised a strategy to simultaneously introduce a rapamycin resistance mutation and a CAR gene cassette to the MTOR locus via intron nesting to generate rapamycin-resistant CD19-CAR-T cells. Our strategy allows the enrichment of CRISPR-engineered T cells expressing a therapeutic transgene of interest with rapamycin, a widely used immunosuppressant. Using a fluorescent mTORC1 signaling reporter, we confirmed that mTORC1 signaling remained functional in the presence of rapamycin after the installation of the dominant gain-of-function mutation and a therapeutic transgene of interest. Using luciferase-based and FACS-based in vitro cytotoxicity assays, and a mouse model of acute lymphoblastic leukemia, we confirmed that our CAR-T cells could efficiently target CD19⁺ leukemia cells in combination with rapamycin. We foresee that our strategy could both facilitate the enrichment of CRISPR-engineered CAR-T cells and improve tumor eradication.
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Utilisation de la protéine Tat-Foxp3 pour induire la formation des lymphocytes T régulateurs, dans le contexte de la thérapie cellulaire de la dystrophie musculaire de DuchenneMavinga, Laetitia 19 April 2018 (has links)
La dystrophie musculaire de Duchenne est une myopathie héréditaire récessive liée au chromosome X. Elle est causée par l’absence de la dystrophine dans les fibres musculaires. La thérapie cellulaire est l’une des approches thérapeutiques possibles, mais son succès dépend du contrôle du rejet des myoblastes greffés et des fibres musculaires hybrides. À présent, le contrôle du rejet est obtenu par l’administration d’immunosuppresseurs puissants. Notre objectif à long terme est de développer un protocole de tolérance immunologique qui permettrait de prévenir le rejet, sans recours à une immunosuppression soutenue. La première étape du protocole de tolérance immunologique que nous souhaitons développer est d’induire la formation de lymphocytes T régulateurs en utilisant le facteur de transcription Foxp3. Nos travaux nous ont permis de produire, dans des bactéries E. coli, la protéine de fusion Tat-Foxp3. Par des essais in vitro nous avons démontré l’augmentation de l’expression du récepteur CD25 sur les lymphocytes T CD4+ naïfs après transduction de la protéine Tat-Foxp3. Cela suggère que la protéine Tat-Foxp3 pourrait convertir les lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs. D’autres travaux seront nécessaires pour confirmer que ces cellules exprimant le CD25 sont vraiment des T régulateurs. / The Duchenne muscular dystrophy is the most common hereditary muscular disease. This disease is inherited as an X-linked recessive trait. It is caused by the absence of dystrophin in muscle fibers. Cell therapy is the potential treatment but, its success depends on the control of the rejection of the transplanted myoblasts and of the hybrid fibers that they formed. At present, the control of the graft rejection is achieved by administration of powerful immunosuppressive drug. Our long-term aim is to develop a protocol for immune tolerance that would prevent the graft rejection without sustained immunosuppression. The first step of this tolerance protocol that we want to develop is to induce the formation of regulatory T cells using the transcription factor Foxp3. In this study we generated, in bacteria E. coli, a fusion protein Tat-Foxp3. By in vitro assays, we demonstrated that Tat-Foxp3 protein up-regulated the expression of CD25 in naïve CD4+ T cells. Additional experiments will be required to confirm that these CD25 expressing cells are Treg.
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L'ocytocine, l'acide rétinoïque et les map-kinases dans la différenciation mésodermique de cellules souches embryonnaires P19Bouchard, Frédéric 08 1900 (has links) (PDF)
Les maladies cardiovasculaires sont une des premières causes de mortalité dans les pays industrialisés. L'infarctus du myocarde provoque la mort d'un grand nombre de cellules cardiaques, diminuant la qualité de vie des gens qui survivent à une telle attaque. La transplantation d'un organe entier présente des limites telles que la faible quantité de donneurs et la possibilité de rejet par l'organisme du receveur. Le cœur possède une capacité de se régénérer mais le nombre de cellules souches résidentes pouvant accomplir cette tâche apparaît être insuffisant. Afin d'aider à la régénération, des approches thérapeutiques tentent l'implantation de cellules fonctionnelles dans la zone infarcie. Les cellules implantées sont, entre autres, des myoblastes squelettiques, des cellules souches embryonnaires ou adultes (cellules souches mésenchymateuses) indifférenciées, des cardiomyocytes fœtaux. Les résultats positifs parfois obtenus ont vite fait passer ces études des animaux à l'humain. La mise au point de thérapies cellulaires efficaces pour le cœur nécessite la compréhension des mécanismes moléculaires gouvernant la différenciation et la morphogénèse cardiaques, et l'habileté à manipuler ces mécanismes. Les cellules de carcinome embryonnaire P19, un modèle de cellules souches embryonnaires (ES), peuvent se différencier en cardiomyocytes lorsqu'elles sont traitées avec l'acide rétinoïque (AR) ou l'ocytocine (OT). Des cellules de muscle squelettique sont aussi générées. D'autre part, l'AR permet la différenciation de cellules ES en adipocytes et l'OT inhibe la maturation finale de pré-adipocytes. Nous avons émis l'hypothèse que l'AR et l'OT peuvent induire les cellules P19 à générer, de façon concomitante mais dans des rapports différents, des adipocytes, cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique. De plus, des analogues de l'AR capables d'activer préférentiellement les récepteurs de l'acide rétinoïque (RAR) ou les récepteurs de rétinoïdes-X (RXR) pourraient influencer les rapports mésodermiques. Enfin, les kinases ERK1/2 et P38, des protéines-kinases activées par des mitogènes (MAPK), pourraient avoir un rôle dans la différenciation mésodermique induite par l'AR et l'OT. Des marqueurs ont servi à identifier les phénotypes cellulaires : PPARy, aP2, lipoprotéines-lipase et gouttelettes lipidiques colorables à l'huile rouge pour les adipocytes; MyoD et α-actinine sarcomérique pour les cellules de muscle squelettique; troponine I cardiaque (cTpnI), chaîne légère de la myosine cardiaque-2v et α-actinine sarcomérique pour les cardiomyocytes. La culture en agrégats de cellules P19 pendant sept jours, avec une induction à l'AR entre les jours deux (J2) et J5, suivie d'une période de maturation de 20 jours en présence d'insuline et de l'hormone thyroïdienne T3 permet d'obtenir des adipocytes. Des cellules battantes exprimant l'α-actinine sarcomérique sont aussi générées. Une importante proportion de ces cellules montre la forme allongée ou fibrillaire caractéristique de myocytes squelettiques. Une faible proportion a une forme arrondie et exprime la cTpnI, indiquant la génération de
cardiomyocytes. L'induction des cellules P19 avec l'AR, à J2, a donc un effet mésodermique large. L'ajout d'OT au milieu de maturation n'augmente pas la proportion de cellules cardiaques par rapport aux cellules musculaires squelettiques ou aux adipocytes. L'AR agit principalement en se liant aux RAR et RXR. Pour activer de façon spécifique chacune de ces deux familles de récepteurs, nous avons remplacé l'AR comme agent inducteur par le LG100268, un agoniste spécifique des RXR, ou par le TTNPB, un agoniste spécifique des RAR. Le LG100268 génère des adipocytes et des myocytes aussi efficacement que l'AR. Le TTNPB est un agent adipogénique plus efficace que l'AR mais inhibe la myogenèse. Les influences mésodermiques différentes des trois agents sont associées à des actions différentes sur ERK1/2 et P38. Ainsi, l'AR et le LG100268 diminuent similairement phospho-ERK1/2 et augmentent similairement phospho-P38. Par contre, le TTNPB, le rétinoïde le plus efficace à diminuer phospho-ERK.1/2, n'a pas stimulé la phosphorylation de P38. L'inhibition pharmacologique d'ERK1/2 ou de P38 pendant le traitement des cellules avec l'AR a augmenté le rendement myogénique, et l'inhibition de P38 a, de plus, augmenté le rendement adipogénique. La voie des RXR est permissive à la fois à l'adipogenèse et à la myogenèse alors que celle des RAR n'est permissive qu'à l'adipogenèse. P38 serait un régulateur négatif de l'adipogénèse. La différenciation à base d'OT produit des cardiomyocytes et, dans une moindre mesure, des cellules de muscle squelettique. L'OT est ajouté durant les quatre jours de l'agrégation et la période de maturation est de dix jours. Les rendements myogéniques sont faibles et nous avons pensé que l'ajout d'AR à l'OT pouvait les augmenter. Lorsqu'il est ajouté dès le J0 du traitement des cellules avec l'OT (addition précoce), l'AR inhibe la myogenèse. Cette inhibition est reliée aux RAR puisqu'elle est reproduite par le TTNPB et non le LG100268. Étonnamment, l'AR ajouté au J2 du traitement avec l'OT (addition tardive) fait plus que doubler le rendement des cellules musculaires, spécialement celui des cellules de muscle squelettique. L'AR a donc un effet dual, temporellement régulé, sur l'action myogénique de l'OT. Un tel effet est aussi observé sur la phosphorylation d'ERK1/2. OT stimule cette phosphorylation, et la stimulation est fortement inhibée par l'addition précoce mais non tardive d'AR. L'inhibition pharmacologique d'ERK1/2 abolit l'action myogénique d'OT. Par contre, l'ajout d'un activateur indirect d'ERK2 à la combinaison "OT + AR tardif" augmente la phosphmylation d'ERK1/2 ainsi que le rendement en cardiomyocytes. Des niveaux de phospho-ERK1/2 sont critiques pour la myogénèse et pour les rendements respectifs en cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique. En conclusion, les cellules P19 génèrent adipocytes, cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique de façon concomitante lorsqu'elles sont induites avec l'AR. Dans ce processus, l'activation des RAR n'est permissive qu'à l'adipogenèse alors que celle des RXR permet l'adipogenèse et la myogenèse. L'action antimyogénique de l'activation des RAR est aussi observée en présence d'OT, cependant cette action ne se manifeste que si l'activation est faite tôt (J0). AR et OT influencent chacun la phosphorylation de MAPK et, réciproquement, leur action mésodermique est influencée par des modulateurs pharmacologiques de ces kinases. Le sens des influences peut cependant différer. Ainsi, les meilleurs rendements myogéniques ont été observés pour les traitements suivants : "AR + inhibiteur d'ERK (J2 à J5)", "AR + inhibiteur de P38 (J2 à J5)", "OT (J0 à J4) + AR (J2 à J4)", "OT + activateur d'ERK (J0 à J4) + AR (J2 à J4)". La modulation de l'activité des voies RAR, RXR et MAPK a une influence sur les rendements myogéniques et adipogéniques ainsi que sur les rendements en cardiomyocytes et en cellules de muscle squelettique. Le sens de l'influence dépend de la fenêtre temporelle de la modulation et de la présence ou non de l'OT.
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MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cardiomyocytes, Cellules de muscle squelettique, Adipocytes, Acide rétinoïque, Ocytocine, Rétinoïdes, MAPK, ERK, P38, PCR, Immunobuvardage, Cytofluorescence, Cytochimie
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Le TGFβI dans la physiopathologie de l'arthrose et son rôle dans l'effet thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses / The TGFβI in the pathophysiology of osteoarthritis and its role in mesenchymal stem cell therapeutic effectRuiz, Maxime 22 May 2018 (has links)
L’arthrose est une maladie ostéoarticulaire fréquente et sans traitement curatif. Elle se manifeste par une dégénérescence du cartilage, associée à une altération des autres tissus de l’articulation. Dans ce contexte, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) démontrent un effet thérapeutique. Afin d’identifier de nouveaux médiateurs de l’homéostasie articulaire, nous avons analysé le secrétome des CSM en nous focalisant sur les membres de la famille du facteur de croissance transformant β (TGFβ), une voie centrale dérégulée dans l’arthrose.Cette approche nous a permis d’identifier la protéine induite par le TGFβ (TGFβI ou βIGH3), pour laquelle nous avons évalué le rôle dans la différenciation des CSM et comparé l’expression dans les tissus articulaires de patients arthrosiques et de sujets sains.Nous montrons l’importance du TGFβI dans la régulation des processus de différenciation osseuse et chondrogénique des CSM. Nous mettons également en évidence une dérégulation au niveau transcriptionnel et protéique de ce facteur dans le cartilage, l’os sous-chondral ainsi que les CSM de patients arthrosiques. En testant son implication dans l’effet thérapeutique des CSM sur des modèles d’arthrose in vitro et in vivo, nous montrons que la diminution de son expression dans les CSM annule leur effet thérapeutique dans les modèles d’arthrose. Cet effet chondroprotecteur du TGFβI est associé à une inhibition du remodelage osseux et de la calcification des tissus mous articulaires.L’ensemble de nos résultats démontrent l’importance de la régulation de la voie TGFβ, et plus particulièrement du TGFβI, dans l’homéostasie articulaire. En parallèle, nos travaux illustrent le rôle de ce facteur dans l’effet thérapeutique des CSM, et suggèrent que l’altération de son expression dans les CSM de patients arthrosiques soit à l’origine d’une diminution de leur potentiel régénératif. / Osteoarthritis (OA) is the most common form of joint diseases without curative treatments. The disease is mainly characterized by the degradation of articular cartilage which is associated with other pathological changes in joint tissues. In this context, mesenchymal stem cells (MSC) have demonstrated a therapeutic effect. In order to identify new mediators involved in articular homeostasis, we analyzed MSC secretome, focusing on the transforming growth factor β (TGFβ) members, a central pathway dysregulated in OA.This approach allows us to identify the TGFβ induced protein (TGFβI or βIGH3). In the present study, we evaluated its role in the differentiation of MSC and compared its expression in articular tissues from OA patients and healthy donors.We highlight the importance of TGFβI in the regulation of differentiation of MSC towards bone and cartilage. We also demonstrate its dysregulation at both transcript and protein level in cartilage, bone and MSC from OA patients. We then evaluated its role in the therapeutic effect of MSC in vitro and in vivo and demonstrated that its decreased expression in MSC is associated with a loss of their therapeutic effect in OA models. The chondroprotective effect of TGFβI is associated with an inhibition of bone remodeling and calcification of soft articular tissues.Together, our results highlight the importance of the TGFβ pathway, and specially of TGFβI regulation, in joint homeostasis. Moreover, our work demonstrates its role in the therapeutic effect of MSC, suggesting that its dysregulation in OA MSC could lead to a decreased regenerative potential.
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Cellules souches adultes MuStem : phénotype, myogénicité, immunomodulation et contexte immunologique d'administration in vivo / Adult stem cells named MuStem : phenotype, myogenicity, immunomodulation and immunological context of in vivo deliveryLorant, Judith 16 December 2016 (has links)
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie récessive liée au chromosome X qui résulte d’une mutation sur le gène de la dystrophine aboutissant à l’absence complète de la protéine. Elle correspond à la plus fréquente des dystrophies musculaires et reste aujourd’hui sans traitement curatif. L’UMR a fait la preuve de concept de l’administration systémique d’une population de cellules souches adultes résidentes du muscle, les cellules MuStem canines chez le chien dystrophinopathe, modèle cliniquement pertinent de la DMD. L’objectif de la thèse a consisté à caractériser la population humaine (hMuStem) en terme de phénotype, myogénicité, immunomodulation et de contexte immunologique d’administration in vivo. La population hMuStem se compose de progéniteurs myogéniques précoces d’origine mésenchymateuse-périvasculaire. Elle se définit par une forte capacité proliférative, une oligopotence et une participation à la régénération musculaire après administration dans un muscle lésé. Elles présentent des propriétés immunomodulatrices en interagissant avec l’immunité adaptative et innée par inhibition de la prolifération lymphocytaire et du complément via un ensemble de molécules de surface et/ou de facteurs sécrétés. Enfin, un traitement immunosuppressif restreint à la période d’injection in vivo de la population allogénique s’avère nécessaire mais suffisant pour éviter une réaction immune de l’hôte. L’ensemble de ces résultats aboutit à une meilleure compréhension de l’identité et des modalités d’action de la population MuStem. / Duchenne Muscular Dystrophy is a X-linked recessive disorder that results from mutation in the dystrophin gene leading to a total lack of the protein. It is the most frequent muscular dystrophy with no curative treatment. The lab made a proof of concept of the systemic delivery of a muscle-derived adult stem cell population called MuStem cells in dystrophic dog, the clinically relevant DMD model. The aim of my Ph.D. was to characterize the human population (hMuStem) in terms of phenotype, myogenicity, immunomodulation and immunological context of in vivo delivery. hMuStem cell population is composed of myogenic progenitors with mesenchymal/perivascular imprint. It exhibits a high proliferative capacity, an oligopotency and a participation to muscle regeneration after transplantation into injured muscle. It displays immunomodulatory properties by interacting with adaptive and innate immunity with inhibition of lymphocyte proliferation and complement thanks to expression of surface molecules and/or secreted factors. At last, an immunosuppressive regimen restricted to the allogeneic injection period is necessary but sufficient to avoid host immune response. Collectively, these results allow a better understanding of identity and action modalities of MuStem cell population.
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Cellules souches du muscle squelettique : étude d'une population capable de différenciation multipotente / Skeletal muscle stem cells : study of cell population capable of multipotent differentiationMitutsova, Violeta 30 October 2015 (has links)
L'utilisation des cellules souches est une approche prometteuse pour le traitement des maladies dégénératives neuromusculaires. De nombreuses études portent actuellement sur les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules pluripotentes induites par reprogrammation (IPs) dont l'utilisation en médecine régénérative reste sujette à caution à cause du potentiel de ces cellules à former des tératomes. Des lors, aussi bien les ES que les IPs nécessitent une différenciation vers un type cellulaire précis. Cette différenciation peut mener à des risques supplémentaires tels que la dérive génique ou diverses sources de contamination.Le muscle squelettique adulte, avec sa grande plasticité et capacité régénératrice, contient une population de cellules souches qui est spécifique de ce compartiment tissulaire et qui a été isolée et étudiée au laboratoire. Les cellules souches du muscle squelettique adulte: skeletal Muscle-Derived Stem Cells, MDSC, repeuplent et réparent en quelques jours le muscle squelettique lésé avec une haute efficacité, même en présence des cellules satellites endogènes. (Arsic et al Exp. Cell Res. 2008). Le laboratoire d'accueil a entrepris de caractériser cette population cellulaire, en particulier par son origine histologique, de tester le potentiel de réparation tissulaire de ces cellules transplantées dans des modèles murins, et de déterminer la bio-distribution de ces cellules en vue d'utilisation thérapeutique.Mon travail de thèse s'est intéressé à cette population de cellules souches issues du muscle qui ont une propriété commune : la faible adhérence au substrat. La faible adhérence est une propriété très intéressante car en plus de définir des cellules plus proches de l'état pluripotent, cette propriété leur confère une grande capacité de migration. Ces cellules seraient donc plus facilement utilisables en médecine régénératrice. Dans cette perspective il est intéressant de disposer de cellules souches multipotentes qui pourrait se comporter comme des cellules pluripotentes en terme de capacité régénératrice, mais sans les inconvénients de ces dernières à savoir ; risque tératogène et prolifération incontrôlée, et manipulation des cultures cellulaires longues et couteuses.Au début de ma thèse je me suis donc intéressée aux différentes populations de cellules présentes dans le muscle et je me suis concentrée sur différents marqueurs connus chez les cellules souches, dont la présence a été établie chez différentes cellules souches y compris chez les cellules souches dérivées du muscle squelettique, mais pas clairement identifiés d'un point de vue histologique. Les cellules souches du muscle expriment le facteur de pluripotence Sox2, mais aussi des marqueurs d'immaturité tels que BCRP1/ABCG2, Sca-1 et SSEA1. J'ai examiné leur potentiel de différenciation in vitro en plusieurs lineages tels que des cellules cardiaques spécifiques (dites pacemakers), des cellules productrices d'insuline et des cellules qui présentent des marqueurs neuronaux. Je me suis également concentrée sur les possibles applications thérapeutiques grâce à l'utilisation de modèles génétiques murins et notamment dans les cas de problèmes du rythme cardiaque, et du diabète insulinodépendant. Pour ces études in vivo du potentiel réparateur des MDSC on procède à une simple injection des cellules souches dérivées du muscle squelettique (MDSC). Le fait de retrouver des MDSC injectées dans les organes cibles des souris modèles pose aussi la question de la biodistribution de ces cellules dans l'organisme. J'ai donc consacré plus d'un an de mon financement doctoral pour examiner cette biodistribution et montré un recrutement ciblé dès 48h après injection, vers les organes ou tissus lésés. / The use of stem cells is a promising approach for the treatment of neuromuscular degenerative diseases. Many studies currently focus on embryonic stem cells (ES) and induced pluripotent stem cells (IPs) for use in regenerative medicine. But some problems remain for their use in cell therapy in particular the potential of these cells to form teratomas. This problem requires both ES and IPs to be differentiated towards a specific cell type. Such induction of differentiation can lead to additional risks such as genetic drift or various sources of contamination.The adult skeletal muscle, has a high plasticity and regenerative capacity, it contains a stem cell population that is specific for muscle, and has been isolated and studied in the laboratory. Adult skeletal Muscle-Derived Stem Cells, MDSC repopulate and repair damaged skeletal muscle with high efficiency in a few days, even in the presence of endogenous satellite cells. (Arsic et al Exp. Cell Res. 2008). The host laboratory is characterizing this cell population and its histological identity and testing the tissue repair potential of transplanted MDSC in mouse models, as well as their bio-distribution for therapeutic use.My thesis work addressed the study of this stem cells population isolated from skeletal muscle showing low adhesion to substrate. Poor/low adherence is an interesting property because in addition to be defined as closer to the pluripotent state, this property is associated with a higher migration capability. This population of muscle stem cells should be easier to use than pre-differentiated stem cells in regenerative medicine. In this perspective it is interesting to use multipotent stem cells that are close to pluripotent cells in terms of differentiation and regenerative capacity, but without the inconveniencies like teratogenic risk and uncontrolled proliferation, as well as expensive and time-consuming cell culture.At the beginning of my thesis I was interested by the different populations of cells present in muscle and I focused my work on known markers of stem cells, whose presence has been established in skeletal muscle, but not clearly identified histologically. Muscle stem cells expressed the pluripotency factor Sox2, but also markers, such as BCRP1/ABCG2, Sca-1 and SSEA1. I have examined the potential of MDSC to differentiate in vitro into several cell types such as cardiac pacemaker-like cells, insulin-producing cells and cells that exhibit neuronal markers. I also focused on the possible therapeutic applications of MDSC, particularly in the case of heart rhythm problems and in the case of insulin-dependent diabetes. For these in vivo studies of the repair potential of MDSC, a single systemic injection is carried out in mouse models of the diseases. The histological recovery of injected MDSC into target organs also raises the question of the biodistribution of MDSC in the body. Therefore I spent more than a year of my doctoral thesis to address this issue and showed a targeted recruitment of MDSC to injured tissue or organs within 48h of their systemic injection.
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Régénération hépatique : stimulus pour la transplantation d'hépatocytes / Liver regeneration : stimulus for hepatocyte transplantationTranchart, Hadrien 01 February 2017 (has links)
Le foie a des capacités de régénérations importantes qui lui permettent de reconstituer progressivement sa masse cellulaire suite à une agression. L’induction d’une régénération hépatique est une approche qui a été utilisée dans de nombreux modèles animaux afin de favoriser la prise de greffe hépatocytaire pour le traitement des maladies métaboliques héréditaires hépatiques (MMHH). Par ailleurs, les capacités de régénération du foie sont utilisées en pratique clinique courante dans le cadre de la chirurgie hépatique afin de préparer le foie à une hépatectomie majeure. Les principaux objectifs de ce travail ont été d’étudier des moyens peu invasifs pour induire une importante régénération hépatique dans deux buts précis : i) favoriser la transplantation d’hépatocytes thérapeutiques pour le traitement des MMHH ; ii) élargir les possibilités de prise en charge des patients nécessitant une hépatectomie.Dans un premier temps, nous avons évalué l’effet d’une embolisation portale partielle (EPP) au cours de la transplantation d’hépatocytes dans un des modèles animaux de l’hypercholestérolémie familiale de type IIA, le lapin Watanabe. Dans un deuxième temps, nous avons mis au point chez le rat, une technique d’EPP résorbable répétée visant à entrainer un stimulus répété de régénération hépatocytaire afin d’envisager par la suite l’utilisation de cette technique avant transplantation d’hépatocytes. En parallèle de ces travaux fondamentaux, nous avons évalué en approche clinique l’intérêt de l’EPP résorbable avant hépatectomie majeure. Nos travaux dans le modèle du lapin Watanabe ont montré la faisabilité du protocole, une correction phénotypique in vitro, une amélioration de la prise de greffe hépatocytaire et une expression prolongée du transgène. Notre équipe a développé chez le rat un stimulus additionnel de prolifération hépatocytaire qui permet une augmentation du poids et du volume du foie non embolisé en comparaison à une seule EPP résorbable. Enfin, dans une série rétrospective préliminaire, la technique d’EPP résorbable a été utilisée avant hépatectomie majeure. L’approche a été bien tolérée chez tous les patients et a permis de systématiquement envisager la chirurgie.L’EPP résorbable est une technique peu invasive capable d’induire une régénérative hépatique efficace. Cette approche pourrait permettre notamment d’augmenter les capacités de proliférations hépatiques par la répétition du stimulus d’embolisation. A terme, l’EPP résorbable répétée pourrait permettre de modeler à la demande l’organisation du volume hépatique favorisant ainsi l’hypertrophie de tel ou tel secteur en fonction des besoins. / The liver has an important regenerative capacity allowing progressive reconstitution of the hepatic volume after an aggression. The induction of liver regeneration was used in different animal models in order to increase engraftment during hepatocyte transplantation for the treatment of inherited metabolic liver diseases (IMLD). Furthermore, liver regenerative capacities are used in routine clinical practice before liver surgery in order to prepare the liver for major hepatectomy.The main objective of this doctoral thesis was to evaluate minimally invasive approaches inducing substantial liver regeneration, focusing in two specific aims: i) increasing the engraftment of therapeutic cells for the treatment of IMLD; ii) expanding the therapeutic options for patients requiring an hepatectomy In a first study, we evaluated the impact of a partial portal vein embolization (PVE) during hepatocyte transplantation in the animal model of familial hypercholesterolemia type IIA, the Watanabe rabbit. In a second investigation, we developed an approach of repeated reversible PVE in a rat model to further boost liver hypertrophy, planning to apply this approach in hepatocyte transplantation. In parallel, we evaluated the clinical interest of reversible PVE before major hepatectomy.Our results of PVE during hepatocyte transplantation in the Watanabe rabbit model demonstrated the feasibility of the procedure, in vivo phenotypic correction, increase of liver cell engraftment and stable transgene expression. Our team developed in the rat an additional stimulus of hepatocyte proliferation allowing increase of non-embolized liver lobe weight and volume in comparison to a single reversible PVE. Finally, the reversible PVE approach was evaluated before major hepatectomy in a preliminary retrospective series of 20 patients. The procedure was well tolerated and allowed to plan surgery in all patients.Reversible PVE is a minimally invasive technique allowing to successfully induce liver regeneration. This approach could increase hepatocyte proliferation capacity by using an additional stimulus of repeated embolization. In the future, reversible PVE may allow on demand modeling of liver volumes organization by supporting the hypertrophy of a specific liver lobe when required.
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Potentiel thérapeutique des progeniteurs endothéliaux dans le traitement de la défaillance ventriculaire droite secondaire à l'hypertension pulmonaire / Therapeutic potential of endothelial progenitors cells in the treatment of right ventricular dysfonction secondary to pulmonary hypertensionLoisel, Fanny 17 January 2019 (has links)
L’hypertension pulmonaire est une pathologie rare et grave résultant d’une obstruction des artères pulmonaires et provoquant une dysfonction cardiaque droite, caractérisée par une ischémie. C’est cette dysfonction cardiaque qui conditionne la survie des patients.L’objectif de ce travail de thèse était de mettre au point une thérapie cellulaire permettant de soutenir le ventricule droit et ainsi de prolonger la survie des patients.Une thérapie cellulaire à base de cellules endothéliales progénitrices, capables d’induire et de participer à l’angiogénèse, a été administrée par voie intracoronaire, intracardiaque et par l’intermédiaire d’un patch chez un modèle porcin d’hypertension pulmonaire.Nous avons mis en évidence une amélioration de la fonction cardiaque droite, une augmentation de la densité capillaire et une diminution de l’hypertrophie suite à l’administration intracoronaire. En revanche, les injections de cellules dans le ventricule droit ont révélé une augmentation de la densité capillaire de manière localisée mais n’ont pas permis d’améliorer la fonction cardiaque. Enfin, l’administration par patch n’a pas permis la migration cellulaire dans le ventricule droit. En conclusion, l’injection intracoronaire donne des résultats pré-cliniques encourageants en améliorant la fonction du ventricule droit chez un modèle animal d’hypertension pumonaire. Ces résultats sont à confirmer sur d’autres modèles et sont à compléter par des études mécanistiques approfondies. / Pulmonary perturbation is a rare and serious pathology resulting from obstruction of the pulmonary arteries and causing right cardiac dysfunction, characterized by ischemia. It is this cardiac dysfunction that conditions the survival of patients.The goal of this thesis work was to develop a cell therapy to support the right ventricle and thus prolong the survival of patients.Cell therapy with endothelial progenitor cells, capable of inducing and participating in angiogenesis, has been administered intracoronally, intracardiacally and via a patch in a porcine model of pulmonary hypertension.We found improvement in right heart function, increased capillary density, and decreased hypertrophy following intracoronal administration. In contrast, injections of cells into the right ventricle revealed an increase in capillary density in a localized manner but failed to improve cardiac function. Finally, patch administration did not allow cell migration into the right ventricle. In conclusion, intracoronal injection gives encouraging preclinical results by improving the function of the right ventricle in an animal model of pulmonary hypertension. These results are to be confirmed on other models and are to be completed by detailed mechanistic studies.
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Utilisation de facteurs motogéniques afin d'améliorer le succès de la thérapie cellulaire pour le traitement de la dystrophie musculaire de DuchenneLafrenière, Jean-François 13 April 2018 (has links)
À cause de l’absence de dystrophine, les fibres musculaires d’un enfant atteint de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) sont fragiles et leurs ruptures fréquentes entraînent une dégénérescence progressive du tissu musculaire. Basée sur les mécanismes de la régénérescence musculaire, la transplantation de myoblastes consiste à fournir des précurseurs myogéniques sains afin que ces derniers participent à la réparation du tissu musculaire dystrophique. Bien que cette approche ait permis de restaurer l’expression de dystrophine lors d’études cliniques menées auprès de patients DMD, la faible dispersion des fibres exprimant la dystrophine s’est révélée un problème majeur requérant que des injections de myoblastes soient effectuées à tous les millimètres afin d’obtenir un succès de greffe optimal. Une faible migration des cellules greffées à l’extérieur des sites d’injection étant suspectée comme principale cause de la restriction des fibres hybrides au niveau des sites d’injections, l’objectif de nos travaux fut d’établir que l’IGF-1, le bFGF et l’interleukine-4 présentent des propriétés chémokinésiques et que leur co-injection avec les cellules greffées est une approche physiologique et efficace pour favoriser la migration intramusculaire des myoblastes squelettiques humains ou de singe. Bien que la co-injection de facteurs de croissance fût envisagée dans l’espoir que les cellules ayant migré puissent fusionner avec les fibres retrouvées à l’extérieur de la trajectoire d’injection, les résultats de transplantation obtenus chez le primate suggèrent que l’augmentation du potentiel migratoire n’est pas, à elle seule, une approche suffisante pour accroître la quantité et la dispersion des fibres hybrides. Globalement, nos travaux ont permis de mieux comprendre et de redéfinir les facteurs limitant le succès de la transplantation de myoblastes. Bien que les cellules myogéniques aient effectivement un potentiel migratoire limité, l’absence de fusion entre les cellules greffées et les fibres non endommagées est sans doute la cause réelle de la restriction des fibres hybrides. Tant que ce problème subsistera, toutes les approches permettant d’améliorer la migration des cellules greffées ne pourront se révéler efficaces pour améliorer la dispersion des fibres et pour réduire la quantité d’injections requises pour le traitement d’un patient dystrophique. / Due to the absence of dystrophin, muscle fibers of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) patients are fragile and their constant ruptures induce a progressive lost of muscular tissues. Myoblast transplantation (MT) is an experimental treatment for DMD. Following their intramuscular injection, healthy myogenic precursor cells are able to fuse with host fibers and restore dystrophin expression. Although MT had efficiently restore dystrophin expression in DMD patients; transplantation success following a single injection is limited. The low dispersion of dystrophin expressing fibers is a major problem that requires myoblast injections every millimetre to obtain an optimal graft success. Since poor transplanted cell migration outside the injection sites has been proposed to explain the restriction of hybrid myofibers, motogenic factors were tested to verify whether their co-injection with transplanted myoblasts is a physiological and effective approach to stimulate proteolytic activity as well as myoblast intramuscular migration. Results demonstrated that insulin growth factor-1, basic fibroblast growth factor and interleukin-4 show strong chemokinetic potential for human skeletal myoblasts and increase the migration distances reached by transplanted cells. By improving cell migration through muscular tissue, we hoped that growth factors co-injection would help transplanted cells to fuse with myofibers located outside the injection sites. However, experiments conducted in monkeys suggest that improvement of transplanted cell migration is not, per se, a sufficient approach to increase the quantity and dispersion of hybrid fibers. Generally, our work helped to clarify and redefine a major problem, which limits graft success. Even if short-term observations suggest that transplanted cells are not always trapped inside the injection sites, myofibers including grafted cell nuclei remain restricted to the injection trajectories one month post transplantation. Lack of fusion with undamaged myofibers located outside the injection sites will probably have to be resolved to improve dispersion of hybrid myofibers and thus reduce the number of injections required for the treatment of DMD patients. As long as this fusion problem remains, all approaches, which increase transplanted cell migration, will not be sufficient to increase MT success.
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Les vecteurs viraux pour le développement de thérapies géniques ex vivo dans les cellules du muscle squelettique humainDoucet, Gilles 12 April 2018 (has links)
Les thérapies génique et cellulaire sont à l'avant-garde de la recherche sur le traitement des dystrophies musculaires. La thérapie par transfert de myoblastes a été proposée comme traitement potentiel de ces dystrophies et les transplantations de myoblastes ont donné des résultats significatifs. Dans cette optique, une thérapie cellulaire autologue est à favoriser et cette approche implique une modification génétique ex vivo. Cette méthode nécessite une efficacité exemplaire du transfert, de l'implantation et de l'expression de l'ADN recombinant. Les myoblastes du muscle squelettique humain sont cependant plus ou moins réfractaires à certains vecteurs viraux. Nous avons donc procédé à l'étude de l'efficacité de vecteurs dérivés d'un rétrovirus, d'un lentivirus, d'un adénovirus et de virus adéno-associés, dans la transduction d'un transgène dans les myoblastes humains. Nous établissons que les vecteurs rétroviraux et lentiviraux démontrent un potentiel remarquable dans une perspective de thérapie génique ex vivo, dédiée à la musculature squelettique humaine. / Gene and cell therapies are at the forefront of research for the treatment of muscular dystrophies. Myoblast transfer therapy was proposed as a potential treatment for these diseases and myoblast transplantation experiments yielded significant results. In this approach, an autologous cell therapy would be preferable and this implies ex vivo gene therapy. However, gene delivery and expression must be optimal in this context and human myoblast is refractory to some viral vectors. For that reason, we have studied the transduction capacities, on such cells, of viral vectors derived from retrovirus, lentivirus, adenovirus and adeno-associated virus. We concluded that the retroviral and lentiviral vectors are the best suited for ex vivo gene therapy of human skeletal muscle cells dedicated to cell therapy.
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