Les anévrysmes de l'aorte abdominale (AAAs) sont des dilatations artérielles qui exposent le patient au décès par rupture. Ils sont caractérisés notamment par la perte de la monocouche de cellules endothéliales et son remplacement par un épais thrombus mural. Cependant, le lienentre l'accroissement du diamètre anévrysmal, la présence d'un thrombus et la perte en cellules endothéliales reste inexploré. Notre hypothèse est que la perte de l'endothélium contribue au développement des AAAs et que sa restauration par thérapie cellulaire permettrait de stabiliser les AAAs. In vivo, la réparation endothéliale implique le recrutement des cellules endothéliales adjacentes mais également des cellules progénitrices endothéliales (EPCs). Chez l'homme, le nombre et l’activité fonctionnelle des EPCs sont inversement corrélés aux facteurs de risque cardiovasculaire, et très peu de données sont disponibles sur l’activité fonctionnelle des EPCs issues de patients porteurs d'AAA. La présence du thrombus pourrait ainsi diminuer le nombre et les propriétés cicatricielles des EPCs issues de patients porteurs d'AAA. / Summary not transmitted

La maladie de Parkinson (MP) est une pathologie neurodégénérative associée principalement à une perte progressive de neurones dopaminergiques de la substance noire (SN) conduisant à une diminution de dopamine au niveau du striatum. Une des approches thérapeutiques expérimentales de la MP est la greffe de neurones dopaminergiques, non pas au niveau de la SN, mais directement dans la région cible, le striatum, et ceux avec des résultats variables. Dans cette étude, nous avons comparé en détail la récupération fonctionnelle suite à la transplantation de mésencéphale ventral (MV) fœtal provenant de souris exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur de la tyrosine hydroxylase soit au niveau de la SN soit dans le striatum de souris adultes lésées unilatéralement à la 6-hydroxydopamine. Les conséquences anatomiques et fonctionnelles ont été analysées par des approches comportementales, électrophysiologiques et immunohistochimiques. Nos résultats montrent que les neurones greffés dans les deux emplacements envoient des projections vers le striatum. De plus, les deux types de greffes induisent une amélioration significative de la motricité ainsi que de l'activité des neurones du striatum. Toutefois, seule la greffe intranigrale a permis la restauration de la motricité fine des membres antérieurs et un retour à une excitabilité des neurones striataux à l’état basal. / Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disorder associated with a progressive loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra (SN), leading to a loss of dopamine in the striatum. One of the experimental therapeutic approaches in PD is the graft of DA neurons not in their ontogenic site, the SN, but directly into the target region, the striatum and those leads to variable results. In this study, we have analyzed in detail the functional outcome of fetal VM tissue expressing GFP under the control of a tyrosine hydroxylase promoter grafts placed either into the SN or striatum in unilaterally 6-hydroxydopamine lesioned adult mice. Anatomical and functional outcome were analyzed using behavioral, electrophysiological and immunohistochemical approaches. Our results show that transplanted neurons in both locations can survive and re-innervate the striatum. Furthermore, both grafts locations significantly restored motor performance and induced the recovery of striatal firing properties. However, only intranigral transplantation allows recovery of fine motor skills of previous members and efficiently normalized cortico-striatal responses.

La thérapie cellulaire et les médicaments de thérapie innovante sont des solutions prometteuses pour la régénération des tissus ou organes présentant des défauts fonctionnels ou organiques. Avant le stade de l'insuffisance cardiaque terminale (stade IV NYHA) suite à un infarctus du myocarde, l'implantation d'un patch de fibrine cellularisé avec des progéniteurs myocardiques sur le site de nécrose de l'infarctus, est l'une des perspectives qui permettrait de régénérer un muscle cardiaque fonctionnel et apparait comme étant une alternative nouvelle avec notamment un essai clinique de phase I en cours (ESCORT : NCT02057900). Cependant, cette thérapie innovante présente de réelles contraintes, parmi lesquelles, un protocole nécessitant, i) une utilisation pour la production de cellules progénitrices myocardiques CD15+, de DMSO, de sérum foetal bovin, de trypsine porcine, de fibroblastes murins pouvant être la source d'une contamination chimique ou microbiologique, ii) une caractérisation importante des cellules produites, pour déterminer leur viabilité, leur pureté, leur état de différenciation, iii) d'implanter le patch de fibrine cellularisé dans un délai limité avant l'obtention des résultats de stérilité et d'endotoxines, iv) d'inciser le péricarde et de former une poche, geste chirurgical très invasif, afin d'implanter le patch cellularisé. Avec l'objectif de limiter ces contraintes et de renforcer la sécurisation pharmaceutique de ce médicament de thérapie innovante, les différents axes de ce travail ont porté sur i) l'ajout, juste avant l'implantation, d'une étape de cryoconservation des cellules dans un milieu sans sérum et sans DMSO, mais avec des agents cryoprotectants de qualité pharmaceutique. L'avantage apporté par la cryoconservation étant de rendre possible une production par lot, et la réalisation des contrôles sans contrainte de temps avant l'implantation, ii) la vectorisation des cellules par une encapsulation dans des microsphères formant une suspension injectable et permettant une implantation directement au travers du péricarde et immédiatement après la décongélation, iii) l'utilisation de polymères bioadhésifs afin de maintenir les microsphères au site d'implantation. Dans un premier temps, ce travail a permis d'identifier l'alginate de sodium de faible viscosité à 1,2% comme polymère pour réaliser l'encapsulation à l'aide d'une buse vibrante de 120 µm de diamètre. La nature et la concentration d'agents cryoprotectants ont également été définies. Les agents cryoprotectants ont été sélectionnés parmi les oses (glucose, saccharose, tréhalose), les polyols (glycérol, mannitol, sorbitol) et l'urée, à une concentration permettant d'atteindre une osmolarité totale de 500 mOsm/L pour abaisser le point de congélation de l'eau. Enfin le chitosane de faible viscosité à 0,5% a été utilisé comme polymère bioadhésif de surface pour maintenir les propriétés mécaniques et la forme des microsphères après la congélation. Dans un second temps, une évaluation biologique a permis de mesurer l'impact des étapes du procédé d'encapsulation et de cryoconservation, sur des cellules souches mésenchymateuses humaines utilisées comme modèle. Il a ainsi été possible d'optimiser le protocole ce qui a eu pour effet d'augmenter la viabilité, évaluée après encapsulation et congélation par une analyse en cytométrie de flux avec le 7AAD, de moins de 5% à environ 35%. / Cell therapy and advanced therapy medicinal products are promising solutions for the regeneration of tissues or organs with functional or organic defects. Before the terminal heart failure stage (stage IV NYHA) following a myocardial infarction, the implantation of a cellularized fibrin patch with myocardial progenitors at the location of the infarct necrosis, is one of the perspectives that would allow a functional heart muscle to regenerate and appears to be a new alternative, in particular, with an ongoing Phase I clinical trial (ESCORT : NCT02057900). However, this innovative therapy presents real constraints, among which, a protocol requiring, i) the use for the production of CD15+ myocardial progenitor cells of, DMSO, bovine fetal serum, porcine trypsin, and murine fibroblasts which may be the source of chemical or microbiological contamination, ii) an important characterization of the produced cells, to determine their viability, purity, and state of differentiation, iii) to implant the cellularized fibrin patch within a limited time frame before getting the results of sterility and endotoxins, iv) to incise the pericardium and to form a pouch, a very invasive surgical gesture, in order to implant the cellularized patch inside. With the objective of limiting these constraints and strengthening the pharmaceutical safety of this innovative therapy medication, different axes of this work have focused on i) the addition, just before the implantation, of a step of cryopreservation of the cells in a medium without serum and without DMSO, but with pharmaceutical-grade cryoprotectants. The advantages of cryopreservation is to allow production in batches, and controls to be carried out without time constraints before the implantation, ii) the vectorization of the cells by encapsulation in microspheres forming an injectable suspension and allowing direct implantation through the pericardium immediately after thawing, iii) the use of bioadhesive polymers to maintain the microspheres at the location of the implantation. This study initially enabled to identify a low-viscosity sodium alginate at 1.2% as a polymer being used for the encapsulation with the use of a vibrating nozzle which diameter is of 120 µm. The nature and the concentration of the cryoprotectants have also been defined. The cryoprotectants were selected from oses (glucose, sucrose, trehalose), polyols (glycerol, mannitol, sorbitol) and urea, at a concentration which achieves a total osmolarity of 500 mOsm/L in order to lower the freezing point of water. Finally, low viscosity chitosan at 0.5% was used as a bioadhesive polymer at the surface of the microspheres to maintain their shapes and mechanical properties after freezing. In a second step, a biological evaluation allowed to measure the impact of the encapsulation and the cryopreservation processes, on human mesenchymal stem cells used as a model. It was thus possible to optimize the protocol, which in return increased the viability ; evaluation made after encapsulation and freezing by a flow cytometry analysis with 7AAD ; from less than 5% to about 35%.

Les maladies cardiovasculaires constituent un problème de santé publique. Les pré et postconditionnement ischémiques mais aussi pharmacologiques constituent autant d‘avancées qui permettront l‘amélioration de la prise en charge des malades en situation d‘ischémie/reperfusion myocardique. Néanmoins, la morbi-mortalité des maladies cardiovasculaires reste importante et nécessite le développement de nouvelles techniques. Les premiers résultats de la thérapie cellulaire myocardique ont été décevants, et s‘il est désormais établi que l‘on ne peut régénérer le myocarde, les effets bénéfiques observés, notamment avec les cellules souches mésenchymateuses semblent en rapport avec un effet paracrine qui passe par l‘activation de la voie de signalisation PI3kinase/Akt sur un mécanisme comparable à celui du postconditionnement ischémique. Les médiateurs de cet effet sont vraisemblablement des facteurs de croissance comme le VEGF ou l‘IGF-1 même si un effet individuel direct de l‘une ou l‘autre de ces molécules n‘a pu être mis en évidence. La modulation de l‘activité de l‘ATP synthase mitochondriale est également une cible thérapeutique prometteuse. Cette enzyme inverse son activité et hydrolyse l‘ATP durant l‘ischémie, conduisant à dépléter le pool d‘ATP intracellulaire et accélérer la survenue de la mort cellulaire. De nouvelles molécules ayant un effet similaire à l‘IF1 permettent de bloquer cette inversion d‘activité de l‘ATP synthase, de préserver l‘ATP et donc d‘améliorer la survie cellulaire par un effet de type préconditionnement ischémique. Ces 2 techniques, très différentes mais non antinomiques, pourraient faire partie de l‘arsenal thérapeutique dans les années à venir / Cardiovascular diseases are a major problem of public health management. Ischemic and pharmacological pre and postconditioning should significantly improve the prognosis of patients suffering from myocardial ischemia/reperfusion. However, the morbi-mortality of these patients is still high and research must remain active. The first results of myocardial stem cell therapy show that we cannot regenerate myocardium but a recent meta-analysis reported positive effects that can be explained through a paracrine mechanism. Mesenchymal stem cells protect ischemic cardiomyocytes from reperfusion injury through a paracrine activation of the PI3kinase/Akt pathway in a similar way to ischemic postconditioning. The mediators of this protection could be growth factors such as VEGF or IGF-1 though we couldn’t demonstrate a direct effect of one or the other. Modulating the activity of the ATP synthase during ischemia is another promising therapeutic target. This enzyme reverses its activity and hydrolyses ATP when the supply in oxygen is impaired. This leads to the reduction of the cellular pool of ATP and accelerates cell death. We identified new small molecules with a similar effect to IF1 that can selectively inhibit the reverse activity of the ATP synthase, preserve ATP and thus increase cell survival in a preconditioning-like effect. These two different techniques could be part of the therapeutic arsenal against ischemia/reperfusion in the next decades.

Notre laboratoire a isolé à partir de tissu adipeux provenant de nouveau-né, une population de cellules souches mésenchymateuses, dénommée cellules hMADS (human Multipotent Adipose-tissue Derived Stem cells). Les cellules hMADS présentent à l'échelle clonale les propriétés fondamentales associées aux cellules souches telles que la multipotentialité et l'auto-renouvellement.<br />Après extravasion, in vitro ou consécutive à leur transplantation dans un organe secondaire, les cellules souches mésenchymateuses pourraient se différencier en des types cellulaires inhabituels. Nos résultats antérieurs montraient en effet que les cellules hMADS pouvaient, après transplantation dans le muscle Tibialis anterior de la souris mdx, contribuer à la formation de myofibres contenant des noyaux humains et exprimant la dystrophine humaine.<br />L'objectif de ce travail a été d'élucider le mécanisme par lequel les cellules hMADS contribuent à la formation de myofibre squelettique. Dans ce but, nous avons essayé « d'engager » le programme myogénique en testant sur ces cellules de nombreuses conditions de culture. Seules les expériences de co-cultures avec des myoblastes ont permis de mettre en évidence la contribution des cellules hMADS à la formation de myotubes hybrides. Ces myotubes présentent un phénotype « normale » et expriment de nombreux gènes musculaires dont la dystrophine, codés par les noyaux issus de la fusion de cellules hMADS avec les myoblastes murins ou humains.<br />Enfin, nous avons démontré que la conversion myogénique des cellules hMADS dans ces conditions n'était pas due à un processus de « détermination/différenciation », mais à une programmation subie des noyaux hMADS. Cette programmation se produirait après la fusion et nécessiterait l'action des facteurs de transcription myogénique (Myogenic Regulatory Factors) codés par les noyaux issus des myoblastes.

Les maladies cardiovasculaires constituent un problème de santé publique. Les pré et postconditionnement ischémiques mais aussi pharmacologiques constituent autant d'avancées qui permettront l'amélioration de la prise en charge des malades en situation d'ischémie/reperfusion myocardique. Néanmoins, la morbi-mortalité des maladies cardiovasculaires reste importante et nécessite le développement de nouvelles techniques. Les premiers résultats de la thérapie cellulaire myocardique ont été décevants, et s'il est désormais établi que l'on ne peut régénérer le myocarde, les effets bénéfiques observés, notamment avec les cellules souches mésenchymateuses semblent en rapport avec un effet paracrine qui passe par l'activation de la voie de signalisation PI3kinase/Akt sur un mécanisme comparable à celui du postconditionnement ischémique. Les médiateurs de cet effet sont vraisemblablement des facteurs de croissance comme le VEGF ou l'IGF-1 même si un effet individuel direct de l'une ou l'autre de ces molécules n'a pu être mis en évidence. La modulation de l'activité de l'ATP synthase mitochondriale est également une cible thérapeutique prometteuse. Cette enzyme inverse son activité et hydrolyse l'ATP durant l'ischémie, conduisant à dépléter le pool d'ATP intracellulaire et accélérer la survenue de la mort cellulaire. De nouvelles molécules ayant un effet similaire à l'IF1 permettent de bloquer cette inversion d'activité de l'ATP synthase, de préserver l'ATP et donc d'améliorer la survie cellulaire par un effet de type préconditionnement ischémique. Ces 2 techniques, très différentes mais non antinomiques, pourraient faire partie de l'arsenal thérapeutique dans les années à venir

L'endothélium joue un rôle primordial dans le développement et le maintien des multiples fonctions vasculaires. Il est ainsi largement impliqué dans des situations pathologiques comme les maladies cardio-vasculaires. La description de marqueurs endothéliaux circulants a permis une exploration non invasive de l'endothélium. Notre équipe s'est intéressée principalement aux cellules endothéliales circulantes (CEC), dont le taux reflète la lésion ou l'activation de l'endothélium, et aux progéniteurs endothéliaux circulants (PEC), marqueurs de régénération endothéliale. La découverte en 1997 par Asahara de la présence chez l'adulte de ces PEC, participant à la formation de nouveaux vaisseaux par vasculogenèse, a ouvert de nouvelles perspectives, notamment pour la thérapie cellulaire des pathologies ischémiques. Ce travail a consisté à développer les méthodes d'étude de ces cellules dans plusieurs contextes. Tout d'abord, nous avons exploré l'utilité de ces marqueurs dans la physiopathologie de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Puis nous avons analysé le potentiel de mobilisation des progéniteurs endothéliaux à partir de la paroi vasculaire lors d'une ischémie locale chez des volontaires sains dans le cadre du développement d'un produit de thérapie cellulaire autologue. Une partie de ce projet a été de mettre en place et d'optimiser les techniques d'étude de ces marqueurs. Les CEC ont été quantifiées par immunoséparation magnétique (IMS), technique mise au point en 1992 (Dignat-George 1992) et transférée dans notre laboratoire. La quantification des PEC a été réalisée par cytométrie en flux et par culture cellulaire. En culture, deux types de PEC sont décrits : les PEC précoces, dont l'origine est monocytaire et pour lesquels la culture est déjà standardisée, et les " Endothelial Colony Forming Cells " (ECFC), seules cellules présentant des caractéristiques de cellules endothéliales progénitrices et pouvant être proposées comme produit de thérapie cellulaire. Nous avons optimisé la quantification des ECFC en culture en étudiant l'effet de diverses matrices et de la densité d'ensemencement des cellules mononucléées issues du sang total sur l'obtention de ces cellules et leurs propriétés angiogènes. La dysfonction endothéliale a été décrite comme un élément central dans le développement de l'HTAP dont le diagnostic repose sur la mesure de la pression artérielle pulmonaire par cathétérisme cardiaque droit. En l'absence de marqueur biologique non invasif dans cette maladie, nous avons quantifié les CEC et les progéniteurs circulants dans deux études. Une étude réalisée chez des patients adultes a montré une augmentation spécifique des CEC dans l'HTAP et non dans l'hypertension pulmonaire thromboembolique chronique. Ainsi les CEC semblent être le reflet des lésions endothéliales pulmonaires et non de la sévérité clinique des patients. L'autre étude a montré l'intérêt de la quantification des CEC dans la prise en charge thérapeutique des enfants souffrant d'HTAP secondaire à une cardiopathie congénitale, dont les formes irréversibles présentaient des taux élevés de CEC. Nous avons ainsi défini un nouveau marqueur non invasif à utilité diagnostique et pronostique. Les PEC sont des cellules rares dans le sang circulant, difficiles à expandre, et dont les essais de mobilisation médullaire se sont révélés insuffisants. L'hypothèse récente d'une réserve vasculaire des progéniteurs endothéliaux nous a conduits à étudier l'effet d'un processus d'ischémie locale sur la mobilisation de ces cellules chez des volontaires sains. Deux groupes d'âge ont été inclus afin d'évaluer l'impact du vieillissement sur la méthode de mobilisation étudiée. Malgré un effet de cette ischémie sur la dilatation endothéliale cette méthode n'a pas permis de mobiliser significativement les PEC issus de la paroi endothéliale, quel que soit l'âge des sujets. A l'inverse, l'hypoxie a eu un effet délétère sur les capacités angiogènes des ECFC.

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la première cause de handicap de l'adulte. Favoriser la plasticité cérébrale post-lésionnelle représente un objectif thérapeutique majeur. Dans ce contexte, la thérapie cellulaire a récemment émergé. Son action, fondée sur la " réparation " du tissu cérébral, a montré un bénéfice sur la récupération fonctionnelle dans des modèles d'ischémie cérébrale. La transposition de ce traitement à l'homme reste à ce jour limitée à des études pilotes. Dans nos travaux précliniques, nous avons montré, après un infarctus cérébral chez le rat, une bonne tolérance et un bénéfice fonctionnel de l'administration intracérébrale (à la phase aiguë) et intraveineuse (à la phase subaiguë) de cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) de grade clinique. La survie des CSMh greffées (possible durant plusieurs semaines) et leur différenciation en cellules d'intérêt (neurones, astrocytes) sont très faibles et ne peuvent expliquer à elles seules le bénéfice observé. Parmi les mécanismes d'action possibles des CSM (effet neurotrophique, pro-angiogénique, immunomodulation...), nous avons mis en évidence par IRM un effet microvasculaire précoce. Nous avons également montré l'innocuité du marquage des CSMh par microparticules ferriques pour l'IRM cellulaire et la microscopie. Ce marquage cellulaire est utile pour détecter et suivre par IRM des cellules greffées au sein du cerveau (durant au moins 15 jours), mais nous a paru insuffisant dans le cadre d'une injection IV. Pour évaluer la biodistribution des CSMh injectées par voie IV à la phase subaiguë, nous avons effectué une étude par imagerie nucléaire qui a permis d'identifier l'attraction rapide de CSMh vers l'infarctus cérébral. En parallèle, la mise en place d'un essai clinique de phase 2 a été effectuée. Le délai, la voie optimale d'administration ainsi que la source cellulaire à utiliser restent encore controversés. L'optimisation de la thérapie cellulaire nécessite encore le développement de projets de recherche translationnelle associant les études expérimentales et les essais cliniques. C'est dans ces conditions que la thérapie cellulaire pourrait devenir un traitement efficace après un AVC.

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) représentent la première cause de handicap acquis de l'adulte. En dehors de la prise en charge dans une structure de soins spécialisée, l'Unité Neuro-Vasculaire (UNV), le seul traitement efficace est la thrombolyse qui doit être administrée dans les premières heures suivant un AVC ischémique (ou infarctus cérébral). Favoriser la plasticité post-lésionnelle du cerveau représente une alternative thérapeutique majeure. C'est dans ce contexte que la thérapie cellulaire basée sur l'administration de cellules souches a émergé. Son action, fondée sur la " réparation " du tissu cérébral lésé, a montré un bénéfice sur la récupération dans des modèles d'ischémie cérébrale expérimentale. Cependant, de nombreuses questions restent en suspens concernant les mécanismes d'action de ce type de traitement. Par ailleurs, la transposition à l'homme reste à ce jour limitée à des études pilotes encourageantes mais avec de faibles effectifs. L'objectif de nos travaux au Grenoble Institut des Neurosciences (GIN U 836) a été d'évaluer les effets fonctionnels de l'administration de cellules souches mésenchymateuses (CSM) après ischémie cérébrale chez le rat, de préciser les modes d'action possibles. En parallèle de ces travaux expérimentaux, un essai clinique pilote de tolérance chez l'homme (ISIS - HERMES) a été mis en place.

Introduction : L'angiogenèse tumorale conduit au développement de nouveaux vaisseaux destinés à permettre la croissance de la tumeur. Les vaisseaux tumoraux sont caractérisés notamment par des anomalies des cellules murales (cellules musculaires périvasculaires), responsables d'anomalies de la fonctionnalité et de la maturation. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié un modèle tumoral de thérapie cellulaire par injection de cellules murales en IRM et vidéomicroscopie de fluorescence. Matériels et méthodes : Notre étude a porté sur un modèle sous cutané de carcinome épidermoïde chez la souris nude. Les animaux étaient divisés en trois groupes : contrôle (n=17), contrôle négatif (n=16) et " traité " avec injection locale de cellules murales humaines (n=17). Les animaux bénéficiaient d'une IRM et d'une exploration par vidéomicroscopie avant (J7) et après traitement (J14). Les paramètres mesurés étaient la taille tumorale (pied-à-coulisse et IRM), la densité microvasculaire (DMV par IRM, vidéomicroscopie et histologie), l'ADC, f, Dr et D* (IRM de diffusion), les variations de R2* sous air, oxygène et carbogène (IRM par effet BOLD) et " l'index leakage " (reflétant la perméabilité capillaire, en vidéomicroscopie). Résultats : Lors de la croissance tumorale, le groupe contrôle a montré une diminution des vaisseaux circulants (ou fonctionnels) qui se reflétait par une diminution du D* et du R2* sous air, une perte de la capacité à répondre au carbogène qui se reflétait par une augmentation du delta R2* sous carbogène, et une augmentation de la perméabilité capillaire qui se traduisait par un " index leakage " plus élevé. Dans le groupe traité par injection de cellules murales, nous avons observé un ralentissement de la croissance tumorale et une stabilisation de ces paramètres de microcirculation et maturation vasculaire. Conclusion : Nous avons montré un effet biologique de notre thérapie cellulaire par injection locale de cellules murales qui se traduisait par un ralentissement de la croissance tumorale, une stabilisation de l'hémodynamique microcirculatoire et de la maturation, et une perméabilité capillaire diminuée, concordants avec l'effet présumé stabilisateur et normalisateur des cellules murales sur les microvaisseaux.