La thérapie cellulaire constitue une stratégie prometteuse dans le traitement de l'infarctus du myocarde. Afin de mieux contrôler la survie, la différenciation et l'intégration des cellules greffées, nous avons tenté une approche d'ingénierie tissulaire en associant les cellules à un microvecteur comportant une surface biomimétique et pouvant libérer un facteur de croissance (FC), les microcarriers pharmacologiquement actifs (MPA). Parmi les cellules utilisées dans une telle approche, les cellules souches adultes dérivées du tissu adipeux (ADSC) ne soulèvent pas de problèmes d'ordre éthique et permettent de réaliser des greffes autologues. Ces cellules sont largement étudiées pour la régénération de nombreux tissus en vertu de leurs propriétés immuno-modulatrices, de leur capacité à sécréter des FC et chémokines, mais également de leur large potentiel de différenciation. Dans une première étape, nous avons étudié l'effet des molécules de la matrice extracellulaire et des MPA sur la différentiation en cardiomyocytes des ADSC en présence d'un cocktail de FC. Nous avons ainsi pu observer que l'apport du cocktail de FC permettait aux cellules de s'engager dans la voie de différentiation cardiaque après 2 semaines. En comparant l'effet de la laminine (LM) et de la fibronectine sur cette différentiation, nous avons pu observer que la LM permettait d'induire une différentiation dans une cellule plus mature et que ceci était potentialisée par un enrichissement du milieu en TGF!1. Finalement, l'apport de MPA recouverts de LM favorisait une différentiation plus rapide des cellules en présence du cocktail. Les MPA peuvent également libérer un facteur de croissance de manière prolongée au cours du temps. Par conséquent, nous avons encapsulé 3 protéines, le VEGF, le HGF et l'IGF-1, et d'étudier leur effet sur les comportement des ADSC. Nous avons ainsi pu observer que des MPA libérant du HGF et de l'IGF-1 induisaient une différenciation de ADSC dans la voie cardiaque et que cette différentiation était également observée lorsque les complexes ADSCMPA étaient intégrés dans un hydrogel thermosensible. Cependant, nous avons aussi observé que la quantité de protéines libérées à partir des MPA était plus faible dans le gel. Nous avons donc cherché dans une dernière partie à améliorer le profile de libération des protéines à partir des MPA en changeant la composition du polymère. Nous avons ainsi utilisé différents copolymères triblock PLGA-PEG-PLGA pour formuler des microsphères et évaluer leur rôle sur la libération de la protéine mais aussi sur la stabilité de celle-ci durant la dégradation du polymère.

L'accident vasculaire cérébral (AVC) est la principale cause de handicap acquis chez l'adulte. Au-delà de l'étroite fenêtre thérapeutique et des risques éventuels de la thrombolyse et de la thrombectomie mécanique, la thérapie cellulaire par cellules souches présente un fort potentiel. Plusieurs études ont montré que les cellules souches transplantées peuvent améliorer la récupération fonctionnelle après un AVC sur des modèles de rongeurs. L’imagerie multiparamétrique par résonance magnétique (IRM), qui inclue l'imagerie de diffusion et de perfusion, est aujourd’hui le protocole standard pour caractériser l'AVC. L'imagerie permet également de suivre in vivo les mécanismes sous-jacents de la thérapie cellulaire après un AVC de la phase aigüe à la phase chronique. Cependant, la quantification de l'hétérogénéité spatiale des lésions, clairement visible par IRM, reste un défi à l'heure actuelle. En effet, les techniques d'analyses d'images utilisées en routine sont basées sur le calcul des valeurs moyennes à partir de régions d'intérêts (ROI). Cette technique par ROI ne peut pas refléter l'hétérogénéité intra-lésionnelle. C'est pourquoi, de nouvelles stratégies d'analyses d'images doivent être développées et évaluées afin de quantifier l'hétérogénéité des lésions ischémiques mais aussi pour suivre l'évolution de cette hétérogénéité au cours du temps. Des approches utilisant des analyses par histogramme permettent d'évaluer l'hétérogénéité des lésions mais perdent l'information spatiale. Une alternative est l'utilisation d'une analyse d'image à l'échelle du voxel appelée "Parametric Response Map (PRM)". Cet outil a été décrit comme plus sensible que l'analyse par ROI dans le pronostic mais aussi dans le suivi thérapeutique chez des patients porteurs de tumeurs cérébrales ou encore atteints d'hémorragies cérébrales.Mon projet de thèse est divisé en deux parties: une étude préclinique chez le rat et une étude clinique (projet ISIS / HERMES). La première partie de ma thèse vise à évaluer les changements physiopathologiques mesurés par l'IRM après un traitement par cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) sur un modèle d'AVC chez le rat. Des animaux présentant une occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne (oACM) ou non (Sham) ont été traités ou non par une injection de CSMh. Au cours de cette étude, différents paramètres IRM ont été cartographiés en utilisant une IRM 7T (4 temps d'imagerie): le coefficient apparent de diffusion (ADC), le volume sanguin cérébral (CBV) et l'indice de taille des vaisseaux (VSI). Les cartes d'ADC, CBV et VSI ont été analysées en utilisant l'approche classique par ROI mais aussi par PRM. L'objectif de cette étude était de déterminer si l'analyse par PRM était capable de détecter plus précocement l'effet des CSMh que l'analyse par ROI. Durant la seconde partie de ma thèse, 6 paramètres IRM (imagerie de diffusion et de perfusion) ont été acquis chez 30 patients AVC. Les données IRM, analysées par valeur moyenne classique et par PRM, ont été corrélées avec des évaluations de la récupération fonctionnelle : le score NIHSS (National Institutes of Health Stroke Score) et l'échelle de Rankin modifiée (mRS) mesurés à différents temps post-ischémie. L’analyse PRM des cartes paramétriques IRM révèle des changements fins de la lésion et corrèle avec le pronostic à long terme après l’ischémie.En conclusion, la PRM pourrait être utilisée comme biomarqueur d’efficacité thérapeutique (combinaison d’images IRM et d’outils innovants d’analyse d'images) et comme biomarqueur pronostique des patients AVC. / Stroke is the leading cause of disability in adults. Beyond the narrow time window and possible risks of thrombolysis and mechanical thrombectomy, cell-therapies have strong potential. Reports showed that transplanted stem cells can enhance functional recovery after ischemic stroke in rodent models.To assess the mechanisms underlying the cell-therapy benefit after stroke, imaging is necessary. Multiparametric magnetic resonance imaging (MRI), including diffusion-weighted imaging (DWI) and perfusion-weighted imaging (PWI), has become the gold standard to evaluate stroke characteristics. MRI also plays an important role in the monitoring of cerebral tissue following stroke from the acute to the chronic phase. However, the spatial heterogeneity of each stroke lesion and its dynamic reorganization over time, which may be related to the effect of a therapy, remain a challenge for traditional image analysis techniques. To evaluate the effect of new therapeutic strategies, spatial and temporal lesion heterogeneities need to be more accurately characterized and quantified.The current image analysis techniques, based on mean values obtained from regions of interest (ROIs), hide the intralesional heterogeneity. Histogram-based techniques provide an evaluation of lesion heterogeneity but fail to yield spatial information. The parametric response map (PRM) is an alternative, voxel-based analysis technique, which has been established in oncology as a promising tool to better investigate parametric changes over time at the voxel level which concern the therapeutic response or prognosis of disease.The PhD project was divided into two parts: a preclinical and a clinical study. The goal of the first study was to evaluate the PRM analysis using MRI data collected after the intravenous injection of human mesenchymal stem cells (hMSCs) in an experimental stroke model. The apparent diffusion coefficient (ADC), cerebral blood volume (CBV) and vessel size index (VSI) were mapped using 7T MRI. Two analytic procedures, the standard whole-lesion approach and the PRM, were performed on data collected at 4 time points in transient middle cerebral artery occlusion (MCAo) models treated with either hMSC or vehicle and in sham animals. During the second PhD project, 6 MR parametric maps (diffusion and perfusion maps) were collected in 30 stroke patients (the ISIS / HERMES clinical trial). MRI data, analyzed with both a classic mean value and a PRM approaches, were correlated with the evaluation of functional recovery after stroke measured with the National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS) and the modified Rankin Scale (mRS) at 4 time points.In both studies, PRM analysis of MR parametric maps reveals fine changes of the lesion induced by a cell therapy (preclincal study) and correlate with long-term prognosis (clinical study).In conclusion, the PRM analysis could be used as an imaging biomarker of therapeutic efficacy and of prognostic biomarker of stroke patients.

Plusieurs populations de cellules immunitaires possèdent une activité cytotoxique permettant l'élimination de cellules altérées. Cette fonction cellulaire est ainsi déterminante dans le contrôle des infections, des processus tumoraux, ou encore des maladies inflammatoires chroniques. Mon projet de thèse se concentre sur des aspects fondamentaux de l'activité lytique de deux populations de lymphocytes T cytotoxiques : les lymphocytes T CD8+ et les lymphocytes T CD4+ régulateurs de type 1. Pour cela, l'exploration des mécanismes de cette activité a été conduite au travers de deux modèles, pathologique et thérapeutique, à différentes échelles biologiques : au niveau de la population ou de la cellule individuelle, mais aussi différentes échelles d'organisations moléculaires : cellulaire et nanoscopique. Nous avons pu démontrer que l'activité de lyse de lymphocytes T CD8+ cytotoxiques face à un excès de cellules cibles est efficace sur des temps prolongés, reposant sur une capacité individuelle fortement hétérogène à effectuer une lyse multiple. L'importance de cette activité de lyse soutenue a été renforcée par l'identification d'un défaut lytique particulièrement prononcé sur le long- terme chez des lymphocytes T CD8+ issus de patients atteints du syndrome de Wiskott-Aldrich. Ce défaut est lié à une activation réduite de l'intégrine LFA-1 et un délai dans la délivrance du coup létal. De plus, la protéine WASP permet de restreindre LFA-1 de haute-affinité en nanoclusters denses ainsi que de permettre l'organisation en un ring de LFA-1 et la localisation des granules lytiques à l'intérieur de celui-ci. Par ailleurs, les lymphocytes T CD4+ régulateurs de type 1 développés dans le cadre d'une thérapie cellulaire (Ovasave(r)) démontrent une capacité de lyse envers les cellules myéloïdes, en complément d'une activité immunosuppressive sur les lymphocytes T conventionnels. Cette activité est mise en place sur du long-terme, jusqu'à atteindre une efficacité optimale, lié à un délai dans la délivrance du coup létal. De manière surprenante, malgré une spécificité pour l'ovalbumine, l'activité cytotoxique semble être indépendante de l'activation du TCR. En outre, la lyse est granzyme-dépendante mais perforine-indépendante. Ainsi ces lymphocytes T thérapeutiques manifestent une activité cytotoxique alternative. Pour conclure, mon projet de thèse a permis de caractériser une activité de lyse soutenue basée sur une capacité individuelle hétérogène. Cette habilité à soutenir une lyse sur du long-terme implique une stabilité de la synapse, où WASP joue notamment un rôle clé pour l'activation et l'organisation de LFA-1. Les lymphocytes T régulateurs thérapeutiques démontrent aussi une activité de lyse soutenue, cependant les acteurs moléculaires sont non conventionnels. De manière générale, une activité de lyse soutenue permettrait de calibrer une réponse cytotoxique prolongée en rapport à la taille de la population cible, ainsi que le partage avec d'autres fonctions cellulaires comme la sécrétion de cytokines. / During different pathological conditions such as infections, tumoral processes or chronic inflammation diseases, altered cells are eliminated through a cytotoxic activity mediated by several immune cell populations. This cellular function is therefore crucial for carrying out the action of the immune system. My thesis project focuses on fundamental aspects of the lytic activity of two cytotoxic lymphocyte populations: CD8+ T cells and type-1 CD4+ regulatory T cells. To explore the mechanisms of this activity, this study has been driven on two cases, pathological and therapeutic models, at the population and single-cell levels and also at the cellular and nanoscopic scales of the molecular organisation. We have been able to demonstrate that the CD8+ T cell lysis activity against an excess of target cells is effective over prolonged periods, relying on a highly heterogeneous individual capacity to perform multiple lysis. The importance of this sustained cytotoxic activity was reinforced by the identification of a lytic defect, particularly pronounced on a long time period, of CD8+ T cells from Wiskott-Aldrich syndrome patients. This defect is related to a reduced activation of the LFA-1 integrin and delay in the lethal hit delivery. In addition, the WASP protein allows to restrict high affinity LFA-1 to dense nanoclusters as well as the assembly of LFA- 1 ring and the localization of the lytic granules inside this ring. Moreover, type-1 CD4+ regulatory T cells from a cellular therapy (Ovasave(r)) demonstrated a cytotoxic activity toward myeloid cells, additionally to an immunosuppressive activity on conventional T cells. This activity is implemented over long time periods, until reaching optimal efficiency, and is related to a delay in the lethal hit delivery. Surprisingly, despite a specificity for ovalbumin, the cytotoxic activity measured in absence of the antigen suggests a TCR independence. In addition, lysis is not mediated by perforin but is exclusively granzyme-dependent. Thus, these therapeutic T cells exhibit an alternative cytotoxic activity. To conclude, my thesis project permits to characterize a sustained lysis activity relying on a heterogeneous individual capacity. This ability to sustain a lytic activity involves stability of the synapse, where WASP plays a key role towards the activation and organization of LFA-1. The therapeutic regulatory T lymphocytes also demonstrated a sustained cytotoxic activity, however the molecular actors are unconventional. On the whole, sustained lytic activity would be key to the calibration of cytotoxic responses in relation to the size of the target population, as well as sharing with other cellular functions such as cytokine secretion.

Les agressions graves de la surface oculaire peuvent se compliquer d'ulcérations cornéennes épithéliales, de néovascularisation, d'opacification et d'inflammation chroniques, échappant à tout traitement médical. Les progrès dans la compréhension de la physiologie du renouvèlement de l'épithélium et du stroma cornéen ont permis d'introduire une approche thérapeutique, la greffe de cellules souches. L'objectif de notre étude est d'apporter une source de cellules souches cornéennes par thérapie cellulaire afin de restituer une fonction épithéliale et stromale permettant l'obtention d'une cornée claire chez l'animal. Les cellules souches épithéliales limbiques (LSC) et les cellules stromales limbiques (SSC) ont été isolées dans un milieu exempt de produits animaux tout en gardant leur caractère indifférencié. L'effet régénérateur des SSC a été étudié in vivo dans un modèle de fibrose cornéenne chez la souris. Les SSC ont été injectées dans le stroma cornéen et ont permis la restitution d'un stroma organisé et d'une cornée transparente. Le projet a aussi consisté à élaborer et mettre en forme une matrice à base de collagène I afin de favoriser la culture concomitante de tous les types cellulaires présents dans la cornée tout en préservant organisation, transparence et propriétés mécaniques. La connaissance des conditions physico-chimique du collagène a permis de produire des matrices transparentes qui ont pu être colonisées par les SSC et les LSC. Notre étude ouvre de nouvelles perspectives dans le traitement des pathologies provocant des opacités cornéennes afin de faire face au manque de dons de cornée. / Cornea, the outer part of the eye, features high transparency crucial for good vision. The maintenance of a healthy cornea is linked to the presence of corneal stem cells in the limbus (peripheral region of the cornea). Several diseases can lead to its opacification requiring transplantation of donor tissue to restore vision. Although corneal transplantation has achieved clinical success, there is a shortage of donor corneas worldwide. To solve this problem, cell therapy and tissue-engineered artificial cornea are promising approaches that could eventually outperform current treatment. Corneal epithelial stem cells (LSC) and stromal stem cells (SSC) were isolated in feeder free and xeno free medium. The therapeutic effect of SSC was investigated in vivo by their injection in mouse cornea treated with liquid nitrogen. SSC have the ability to restore the extracellular matrix organization and corneal transparency. Transparent collagen I fibrillated matrices have been synthesized and were evaluated for fibril organization, transparency, mechanical properties and their ability to be repopulated by corneal stromal stem cells and to support limbal epithelial stem cell growth. We show that the matrices were organized and transparent. SSC and LSC were able to repopulate and to grow into the collagen matrix. These cells present a potential for stem cell-based treatment of corneal blindness.

Introduction :Les adhérences abdominales post-opératoires représentent les complications les plus fréquentes de la chirurgie abdominale et sont un enjeu de santé publique– douleurs abdominales chroniques, occlusions intestinales et infertilité féminine- et coût de prise en charge. Elles se développent après une mauvaise cicatrisation du péritoine –séreuse composée d’une monocouche de cellules mesothéliales. Leur prévention pourrait passer par des techniques de thérapie cellulaire ou tissulaire, visant à fabriquer un « néo »peritoine alliant des cellules du patient à une « scaffold » ou « échaffaudage ». Les cellules mesothéliales, différenciées, fonctionnelles sont indispensables, mais en nombre limité, potentiellement malades et leur prélèvement invasif. Elles pourraient être remplacées par des cellules souches adipocytaires qui ont un potentiel de différenciation. D’autre part, les polymères d’hydrogels comme biomatériau pour notre substitut sont attractifs par leur tolérance et leurs propriétés de ressemblance à la matrice extra cellulaire native.Les étapes majeures de notre projet de médecine régénérative sont de comparer la thérapie cellulaire à la thérapie tissulaire utilisant une « scaffold », de comparer les deux cellules sources potentielles, d’étudier les qualités de l’hydrogel BD-Purastat® et enfin de transplanter notre substitut cellularisé dans un modèle préétabli d'adhérences chez le rat.Matériel et méthode :La première étape validait le modèle animal d’adhérences post opératoires comparant plusieurs dommages péritonéaux. Puis les cellules étaient comparées en terme d'isolement, de culture, de caractérisation et de différenciation. Une étude de preuve de concept était réalisée afin de comparer les techniques de thérapie cellulaire aux techniques de thérapie tissulaire avec la greffe de péritoine lui-même. Ensuite, BD-Purastat® était testé grâce à une collaboration avec le laboratoire 3D Matrix. Enfin l’implantation in vivo d’une plaque d’hydrogel chargée de cellules autologues était évaluée sur le modèle de rat mis au point.Résultats :Deux modèles d'adhérences post-opératoires étaient validés chez le rat. Les deux techniques étaient efficaces et pertinentes pour l'application clinique. Les cellules mésothéliales présentaient un aspect typique polygonal avec des bords brillants et exprimaient les marqueurs intra-cellulaires de la vimentine et des cytokeratines. Elles présentaient une sénescence précoce comme attendu pour des cellules adultes bien différenciées. Les cellules souches adipocytaires étaient allongées et fines, stellaires, avec une bonne capacité d'expansion, se différenciaient en ostéocytes et en adipocyte et formaient des colonies comme attendu pour des cellules souches. L'étude de preuve de concept a permis de montrer que les cellules mésothéliales contribuaient à la repéritonéalisation seulement si elles étaient bien orientées et transplantées au sein d’un tissu. Ainsi, l’ajout d'une « scaffold » était crucial. Concernant le choix des biomatériaux, BD-Purastat® présentait de bonnes propriétés mécaniques, de biocompatibilité et implanté seul permettait déjà une réduction des adhérences postopératoires. L'implantation du substitut cellularisé n'avait pas permis d’améliorer les résultats obtenus avec le gel seul.Conclusion et perspectives :Notre étude permettait de montrer que des cellules mésothéliales au sein d'une « scaffold » étaient la clé du succès de la repéritonéalisation pour la prévention des adhérences postopératoires en charge abdominale. La différenciation des cellules souches adipocytaires vers le phénotype mésothélial avait encore besoin d'être prouvée. BD-Purastat® diminuait l’étendue des adhérence postopératoires. Le comportement des cellules dans cette « scaffold » nécessitait d'être étudié pour pouvoir obtenir l'efficacité clinique du substitut péritonéal de cellules autologues et d'hydrogel. / Introduction: Postoperative abdominal adhesions are a major complication leading to medical and economical problems. Replace injured peritoneum, which is composed of a monolayer of mesothelial cells (MC), using cell-therapy or cell-laden scaffold are two promising strategies to prevent adhesions. MC as functional and differentiated cells are crucial. However, adipose stem cells (ASCs) could replace MCs thanks to their potential of differentiation. Furthermore, hydrogel polymers are attractive scaffolds mimicking the properties of the native ECM. So, milestones of our project of regenerative medicine are comparison of cell-laden scaffolds and cell-therapy, choice of cell source and biomaterial, and finally transplantation of the cell-laden hydrogel scaffold, in a pre-established rat model of adhesion.Materiel and Method: Firstly, models of adhesion were compared usingdifferent peritoneal injuries. Then, MCs and ASCs were compared for isolation, culture, characterization, and differentiation. Nextly, cell-therapy using MC intra peritoneal injection (IP) or cell-sheet technology was compared with tissue-therapy using peritoneal grafts through a proof of concept study. BD-Purastat® hydrogel was tested in collaboration with 3D Matrix firm. Cell-laden hydrogel gels were implanted and assessed on adhesion prevention.Results: Two animal models of adhesion were validated and both techniques were effective and clinically relevant. MCs and ASCs were isolated from respectively tunica vaginalis and subcutaneous inguinal fat pad. MCs, with typical cobble-stone morphology and bright edges, were positively stained for vimentin and cytokeratin. Senescence arrived after only three passages for these adult well-differentiated cells. Spindle-shaped ASCs had a good capacity of expansion, were able to differentiate in osteocytes and adipocytes, and to form colonies as expected for stem cells. Autologuous peritoneal grafts prevented postoperative abdominal adhesions in the rat model. As the mechanism of this prevention, the MC survived and contributed to reperitonealization, only when they were transplanted as a part of the autologous peritoneal grafts and were located on the surface exposed to the abdomen. Cell sheet technology and MCs IP injection failed in the adhesion prevention. BD-Purastat® presented good mechanical properties and biocompatibility. Alone, it reduced significantly adhesion extent. But, cell encapsulation into BD-Purastat® did not improve this prevention.Conclusion and perspectives: Our study supported that MCs and scaffold are both needed to succeed in peritoneum’s engineering to prevent adhesion. ASCs differentiation into MCs phenotype has still to be shown. BD- Purastat® decreases adhesion extent and behavior of the cell into this scaffold needs to be studied to improve the effectiveness of the cell-laden hydrogel application.

La thérapie cellulaire régénératrice permet de soigner un organe ou un tissu lésé par la transplantation de cellules saines isolées chez le patient ou un donneur sain. Les cellules transplantées se substitueront aux cellules défaillantes et régénéreront le tissu endommagé.Les cellules stromales mésenchymateuses (MSC) utilisées dans le cadre de la thérapie cellulaire sont amplifiées par culture ex vivo avant leur implantation chez le patient. Cette étape requiert la présence de facteurs de croissance généralement apportés par l’ajout de sérum, souvent d’origine animale (sérum fœtal bovin [FBS]), au milieu de culture. L’origine animale du FBS pose de nombreux problèmes de biosécurité. En effet, le risque de contamination du FBS par des virus et/ou des prions n’est pas négligeable et des anticorps dirigés contre les protéines animales ont été mis en évidence dans le sérum de certains patients transplantés. La mise au point de milieux de culture dépourvus de sérum mais préservant la viabilité et les fonctions des cellules représente dès lors un enjeu important.Au cours de ce travail, nous avons étudié les effets de la privation en sérum sur la viabilité de MSC isolées à partir de moelle osseuse humaine et des cellules SaOS-2, une lignée cellulaire ostéoblastique. Dans ces cellules, la carence en sérum inhibe les voies de signalisation MAPK ERK1/2, p38 MAPK ainsi que la voie de la PKB et favorise l’expression et l’activation des membres pro-apoptotiques de la famille des Bcl-2. In fine, elle conduit à l’activation des caspases-3/7 et à l’apoptose. Les MSC présentent toutefois une certaine tolérance à la privation en sérum.Nous avons ensuite évalué l’action de deux facteurs, le Glucose-dependent Insulinotropic Peptide (GIP) et l’adénosine triphosphate (ATP) sur les effets délétères et la mortalité induits par la carence en sérum. En effet, dans d’autres types cellulaires, le GIP et l’ATP exercent une action anti-apoptotique en réponse à différents stress cellulaires dont la privation en sérum.Après avoir vérifié la présence et la fonctionnalité du récepteur au GIP (GIPR) dans les MSC humaines ainsi que dans les cellules SaOS-2, nous avons montré que le GIP diminue de moitié la mortalité cellulaire et l’activation des caspases-3/7 observées dans les MSC carencées en sérum. L’utilisation de la forskoline et d’un inhibiteur spécifique de l’adénylate cyclase nous a permis de montrer que l’effet protecteur du GIP nécessite l’activation de la voie de l’adénylate cyclase et l’accumulation d’AMPc intracellulaire. Le GIP est cependant sans effet sur les voies de signalisation MAPK ERK1/2, p38 MAPK et PKB.L’expression des différents membres de la famille des récepteurs purinergiques avait déjà été documentée dans les MSC humaines. Nos résultats ont montré que l’ATP protège partiellement les MSC et les cellules SaOS-2 de la mort cellulaire provoquée par la culture en absence de sérum. De manière intéressante, nous avons observé que le nucléotide abolit l’activation des caspases-3/7. La présence d’ATP permet également de restaurer l’activité des MAPK ERK1/2 et p38 MAPK. Le nucléotide ne module pas la voie de signalisation de la PKB. Ensuite, nous avons confirmé l’implication des différentes voies de signalisation MAPK ERK1/2 et p38 MAPK grâce à l’utilisation de PD0325901, un inhibiteur des MEK1/2, et de SB203580, un inhibiteur de l’activité de la p38 MAPK. Ces deux inhibiteurs contrecarrent l’effet protecteur de l’ATP sur la viabilité des MSC. En outre, à l’instar du GIP, l’ATP entraine une augmentation de l’AMPc intracellulaire, probablement via l’activation du récepteur P2Y11. Cette accumulation d’AMPc participe à l’effet protecteur de l’ATP. L’ajout d’ATP dans le milieu de culture sans sérum module également l’expression des membres de la famille des Bcl-2 dont, notamment, mcl-1 qui code pour une protéine anti-apoptotique, et puma et bmf, deux gènes codant pour des protéines pro-apoptotiques. L’ATP inhibe l’activité de la protéine pro-apoptotique Bad en prévenant sa déphosphorylation.Enfin, nous avons montré que les MSC carencées en sérum libèrent de l’ATP dans le milieu extracellulaire à des concentrations 10 fois supérieures à celles mesurées dans des conditions de culture standards (10% FBS). Ceci pourrait représenter un mécanisme intrinsèque de protection contre la mort cellulaire. En conclusion, nous avons montré que le GIP et l’ATP protègent les MSC humaines et les cellules SaOS-2 de la mort cellulaire induite par la privation en sérum. Nous avons déterminé que la voie de l’adénylate cyclase-AMPc est impliquée dans cet effet protecteur. De même, l’ATP préserve l’activité des voies de signalisation MAPK ERK1/2 et p38 MAPK. Le facteur de transcription CREB pourrait être l’élément central de l’action protectrice du GIP et de l’ATP. Enfin, nos résultats suggèrent que, lorsqu’elles sont carencées en sérum, les MSC seraient capables d’activer un processus intrinsèque de survie via la libération de facteurs tels que l’ATP dans le milieu extracellulaire. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les lésions du système nerveux central (SNC) entraînent une perte neuronale associée à des déficits fonctionnels importants. En réponse à une lésion, les capacités de repousse axonale et de régénération spontanée des neurones du SNC sont limitées. Nous avons évalué, dans un modèle de lésion corticale chez la souris adulte, le potentiel des greffes de neurones corticaux embryonnaires à réparer les voies corticales lésées. L'efficacité de cette approche thérapeutique dépend (1) du degré de survie des cellules greffées, (2) de la capacité des cellules greffées à se différencier en type neuronal approprié et (3) de la capacité des neurones greffés à restaurer les voies corticales endommagées de façon spécifiques. Nous avons montré que les neurones embryonnaires corticaux d'origine du cortex moteur transplantés immédiatement après la lésion du cortex moteur adulte se différencient en neurones matures exprimant les mêmes neurotransmetteurs et marqueurs de couches corticales que ceux du cortex normal. De plus, les neurones transplantés développent des projections vers les cibles corticales et sous corticales appropriées. Par ailleurs, nous avons étudié l'influence de la neuroinflammation post-lésionnelle sur la survie des neurones transplantés et, l'influence des neurones transplantés sur la neuroinflammation de l'hôte. / Central nervous system (CNS) lesions leads to a neuronal loss associated with significant functional deficits. In response to injury, the capacity of spontaneous axonal regrowth and regeneration of neurons in the CNS are limited. We evaluated in a model of cortical lesion in adult mice, the potential of embryonic cortical neurons grafts to repair the injured cortical pathways. The efficacy of this therapeutic approach depends on (1) the degree of survival of transplanted cells, (2) the ability of the grafted cells to differentiate into neuronal appropriate type and (3) the ability of the transplanted neurons to restore damaged cortical pathways. We have shown that embryonic cortical neurons transplanted immediately after the injury of the adult motor cortex differentiate into mature neurons expressing the same neurotransmitters and markers of cortical layers that are normally expressed by intact cortex. Furthermore, the transplanted neurons develop projections to the appropriate cortical and sub-cortical targets. Furthermore, we studied the influence of post-traumatic neuroinflammation on the survival of transplanted neurons and the influence of transplanted neurons on host neuroinflammation.

L’infarctus du myocarde est une cause majeure de morbidité et mortalité adulte dans les pays développés. Le manque de perfusion myocardique induit la mort des cardiomyocytes notamment par apoptose. Un remodelage moléculaire et cellulaire s’ensuit et comprend une hypertrophie des cardiomyocytes dans la zone péri-infarcie, de la fibrose, une réactivation des gènes fœtaux et des changements métaboliques. Ce remodelage entraîne à terme une diminution de fonction menant à la défaillance cardiaque. Les traitement médicamenteux améliorent la qualité de vie et la survie mais ne peuvent guérir. La thérapie hybride (cellulaire et génique) est une approche thérapeutique nouvelle et prometteuse pour l’infarctus du myocarde. C’est dans ce contexte que s’inscrivent les travaux de ma thèse. <p>Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont des cellules souches adultes de choix pour la thérapie cellulaire. Plusieurs études ont montré qu’elles participent à la cardioprotection et à la régénération du myocarde en sécrétant une myriade de facteurs de croissance et de cytokines aux effets pro-angiogéniques et anti-apoptotiques.<p>Le « stromal-derived factor-1 » (SDF-1) ou CXCL12 est une chimiokine produite par un grand nombre de cellules dont les CSM et les cardiomyocytes. Il est un ligand pour CXCR4 et CXCR7, 2 récepteurs de la famille des récepteurs liés aux protéines G. CXCL12a est un facteur critique pour la migration, la domiciliation et la survie des cellules souches de la moelle osseuse dans le myocarde infarci et pour la survie des cardiomyocytes. Dans l’infarctus aigu du myocarde, un délai entre la fenêtre temporelle d’activation du ligand et de son récepteur rend cet axe peu efficace. Dans les pathologies ischémiques chroniques, une altération de la signalisation CXCL12a/CXCR4 réduit ses effets bénéfiques.<p>Ces observations ont conduit au développement d’approches thérapeutiques ciblant l'axe CXCL12a/CXCR4. CXCL12a peut être administré seul, sa production peut être stimulée par la transplantation de cellules souches, enfin sa synthèse peut être augmentée dans le myocarde par thérapie génique ou par l’association d’une thérapie cellulaire et génique. La majorité des études montrent une amélioration du remodelage et de la fonction cardiaque associée essentiellement à une néovascularisation et un effet antiapoptotique. Cependant, les effets directs de CXCL12a sur les cardiomyocytes ne sont pas encore complètement élucidés.<p>L’objectif général de ce travail était de contribuer à la compréhension des mécanismes d’action de CXCL12a sur les cardiomyocytes néonataux de rat que celui-ci agisse seul ou dans le cadre d’une thérapie hybride.<p>Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié les effets non génomiques de CXCL12a en nous focalisant sur l’homéostasie calcique et ses conséquences fonctionnelles. Nous avons investigué la modulation des flux calciques par CXCL12a en chargeant le cytoplasme de cardiomyocytes néonataux de rat en culture avec le Fluo-4 acétoxyméthyl ester, indicateur fluorescent du niveau de calcium. CXCL12a augmente le calcium intracytoplasmique. La réponse calcique dépend de la liaison de CXCL12a à CXCR4 et majoritairement de l’ouverture des canaux calciques dépendants de l’inositol triphosphate (IP3Rs). Le flux calcique induit par la caféine (un agoniste des récepteurs à ryanodine) est diminué lorsque les IP3Rs sont bloqués. Ceci peut s’expliquer par une interaction entre ces 2 canaux. L’incubation avec le CXCL12a augmente in vitro la fréquence de battement des cardiomyocytes et cet effet est additif à celui de la forskoline (un activateur de l’adénylate cyclase). In vivo, l’administration intramyocardique de CXCL12a augmente le dP/dt max (indice de contractilité cardiaque) du ventricule gauche. <p>Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié les effets génomiques de CXCL12a; le but de cette étude était double :(1) identifier de nouvelles voies de signalisation contribuant aux effets de CXCL12a sur les cardiomyocytes et (2) comparer les effets de CXCL12a administré seul aux effets du surnageant de CSM surexprimant CXCL12a. Nous avons construit le lentivirus pWXLd-CXCL12a-IRES-GFP pour transduire des CSM en culture. L’expression protéique de CXCL12a dans le surnageant des CSM transduites a été confirmée par ELISA et l’activité du CXCL12a a été vérifiée par le test à l’aequorine. Pour identifier de nouvelles voies de signalisation modulées à l’étage transcriptionnel, nous avons privilégié le microarray, méthodologie qui permet une approche globale sans à priori. Nous avons ensuite confirmé les résultats par une approche ciblée sur certains gènes par la technique de RTQ-PCR. Pour le microarray, les cardiomyocytes ont été incubés pendant 1 heure avec (a) du CXCL12a commercial &61480;&61493;µ&61517;&61481; dilué dans le milieu des cardiomyocytes sans FBS, (b) le milieu des cardiomyocytes sans FBS (échantillon témoin de a), (c) le surnageant de CSM transduites par le virus pWXLd-CXCL12a-IRES-GFP et (d) le surnageant de CSM transduites par le virus pWXLd-GFP (échantillon témoin de c). Un ensemble discret de 218 gènes correspondant à 0,63% du génome du rat étaient régulés. Parmi les 60 gènes communs rapidement modulés dans les deux conditions (a et c), 34 étaient sur-exprimés alors que 26 étaient sous-exprimés. L’analyse avec le logiciel David suggère que le CXCL12a seul à la dose de 5 μM ou présent dans le surnageant de CSM le surexprimant à la concentration d’environ 2 nM module des voies déjà connues comme la voie des MAPkinases et plusieurs voies liées à l’apoptose comme JAK/STAT, p53 et NOD ainsi que 2 nouvelles voies: le voie des adipocytokines et de PPAR. Par RTQ-PCR, nous avons confirmé la modulation positive par CXCL12a de JAK2 et AKT. De plus, CXCL12a réprime l’expression protéique de la LPL, l’expression génique de la FABP et de l’Angptl-4 et l’expression génique et protéique de l’adiponectine, protéines toutes impliquées dans le transfert des acides gras et leur β oxydation. <p>Nous avons ensuite investigué les effets génomiques de CXCL12a dans le cadre d’une thérapie hybride. L’analyse du microarray et l’analyse ciblée de quelques gènes ont permis de conclure que la modulation de l’expression génique dépend non seulement de la concentration en CXCL12a mais également de la présence d’autres facteurs soit issus directement du milieu de culture commercial des CSM soit issus du milieu conditionné des CSM.<p>Ce travail ouvre de nouvelles perspectives pour mieux comprendre le rôle de CXCL12a dans l’homéostasie calcique et le métabolisme des lipides et son impact dans la physiopathologie du cœur. De plus, ce travail appuie le fait que le développement clinique des thérapies hybrides doit être précédé d’une investigation complète des effets génomique et non génomiques de cette thérapie sur les cardiomyocytes. Cependant, il faut rester prudent car, à cause de l’environnement du myocarde sain ou malade, aucune étude fondamentale ne permet de prédire l’ensemble des effets in vivo.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La transplantation cellulaire apparaît aujourd’hui comme une thérapie prometteuse pour certaines formes graves d’insuffisance cardiaque réfractaire aux traitements classiques. Nous avons tenté dans ce travail d’améliorer la thérapie cellulaire en agissant sur deux paramètres : la perte et la survie des cellules. Dans une première étape, nous avons comparé les effets de deux méthodes de couverture épicardique des cellules via des biomatériaux cellularisés (feuilles de cellules et une matrice de gélatine) par rapport à ceux des injections conventionnelles dans le myocarde. Nous avons choisi de transplanter des cellules souches musculaires pour une étude de preuve de concept. Une amélioration de la fonction contractile au bout de 1 mois associée à une amélioration de la rétention cellulaire, une augmentation du nombre de vaisseaux sanguins et une diminution du pourcentage de la fibrose ont été enregistrées dans les groupes de biomatériaux cellularisés par rapport au groupe des injections de cellules. Nous avons tenté de confirmer les bénéfices de la couverture épicardique avec un autre type cellulaire. Nous avons choisi d’utiliser des cellules souches stromales d’origine adipeuse (ADSC pour Adipose Derived Stroma/Stem Cells). Toutefois, et malgré les bénéfices fonctionnels apportés lors des greffes, les feuilles d’ADSC étaient difficilement maniables lors de la chirurgie. De plus, les ADSC ont été incapables de générer de nouveaux cardiomyocytes s’intégrant électriquement et mécaniquement dans le tissu receveur. L’objectif de « régénération » myocardique requiert l’apport de cellules ayant un potentiel de différenciation cardiaque et devrait donc pouvoir être atteint avec des cellules souches embryonnaires (CSE). Nous avons choisi de travailler avec ce type cellulaire en raison de la possibilité de dériver, à partir de ces cellules, de véritables progéniteurs des cardiomyocytes. Pour limiter les conditions hypoxiques de l’environnement ischémique, nous avons co-transplanté les progéniteurs cardiaques dérivés des CSE humaines avec des ADSC afin d’en exploiter les propriétés trophiques, et d’optimiser ainsi la survie du greffon. Les deux populations cellulaires ont été transférées sur le myocarde infarci via, une matrice de gélatine (GELFILM™) qui représente de meilleures propriétés mécaniques. Lors de cette étude, nous avons remarqué une préservation contre le remodelage ventriculaire à court (1mois) et long (6mois) terme chez les animaux greffés avec les patchs co-ensemencés par rapport aux animaux recevant le patch seul et l’étude des patchs composites a montré la présence de cellules humaines in vitro mais pas in vivo, probablement à cause d’une maîtrise insuffisante du rejet. Notre travail a donc consisté en une analyse systématique de plusieurs paramètres fondamentaux de thérapie cellulaire (méthode de transfert des cellules, limitation des conditions de mort cellulaire après greffes, choix du type cellulaire). Les résultats obtenus valident l’emploi des matrices cellularisées déposées sur l’épicarde. Il convient maintenant d’optimiser la nature du biomatériau, les conditions de culture des progéniteurs cardiaques avec des cellules trophiques dans le but d’améliorer la survie du greffon. / Cell transplantation has emerged as a promising therapy for some kind of severe heart failure refractory to conventional treatment. We have attempted in this work to improve cell therapy by acting on two parameters: the loss and cell survival. In a first step, we compared the effects of two methods of epicardial deposition of cells via natural biomaterials (Cell sheet and gelatin matrix) compared to conventional cells injections into the myocardium. We chose to transplant muscle stem cells for a proof of concept study. Improved contractile function after 1 month associated with improved cell retention, an increased number of blood vessels and a decrease in the percentage of fibrosis were recorded in the groups of cellularized biomaterials compared with injections group. We attempted to confirm the benefits of the epicardial cover with another cell type. We chose to use stromal stem cells from adipose origin as ADSC for Adipose Derived Stromal / Stem Cells. However, despite the functional benefits provided after transplantation, ADSC sheets were hardly manipulated during surgery. In addition, ADSC were unable to generate new cardiomyocytes electrically and mechanically integrated into the host tissue. The objective of "regeneration" requires the input of contractile cells with potential of cardiac differentiation that should be achieved with embryonic stem cells (ESC). We chose to work with this cell type because of the possibility of deriving of cardiac progenitor from these cells. To reduce the hypoxic conditions of the ischemic environment, we co-transplanted cardiac progenitor derived from human embryonic stem cells with ADSC in order to develop the trophic properties, and thus optimize the graft survival. Both cell populations were transferred to the infarcted myocardium using a gelatin matrix (GELFILM ™) which represents better mechanical properties than the cell sheet. In this study, we observed a significant functional preservation against negative ventricular remodeling in the short (1 month) and long (6 months) term in animals grafted with co-seeded patches compared to animals receiving only the patch. The study of composite patches showed the presence of human cells in vitro but not in vivo, probably because of inadequate control of rejection. Our work has involved a systematic analysis of several basic parameters of cell therapy (method of cell transfer, reduce of cell death after transplantation, choice of cell type…). The results validate the use of cellularized matrix deposited on the epicardium. In conclusion, to improve graft survival, it is necessary to optimize the nature of the biomaterial, the culture conditions of cardiac progenitor cells.

L’endothélium joue un rôle primordial dans le développement et le maintien des multiples fonctions vasculaires. Il est ainsi largement impliqué dans des situations pathologiques comme les maladies cardio-vasculaires. La description de marqueurs endothéliaux circulants a permis une exploration non invasive de l'endothélium. Notre équipe s’est intéressée principalement aux cellules endothéliales circulantes (CEC), dont le taux reflète la lésion ou l’activation de l’endothélium, et aux progéniteurs endothéliaux circulants (PEC), marqueurs de régénération endothéliale. La découverte en 1997 par Asahara de la présence chez l’adulte de ces PEC, participant à la formation de nouveaux vaisseaux par vasculogenèse, a ouvert de nouvelles perspectives, notamment pour la thérapie cellulaire des pathologies ischémiques. Ce travail a consisté à développer les méthodes d’étude de ces cellules dans plusieurs contextes. Tout d’abord, nous avons exploré l’utilité de ces marqueurs dans la physiopathologie de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Puis nous avons analysé le potentiel de mobilisation des progéniteurs endothéliaux à partir de la paroi vasculaire lors d’une ischémie locale chez des volontaires sains dans le cadre du développement d’un produit de thérapie cellulaire autologue. Une partie de ce projet a été de mettre en place et d’optimiser les techniques d’étude de ces marqueurs. Les CEC ont été quantifiées par immunoséparation magnétique (IMS), technique mise au point en 1992 (Dignat-George 1992) et transférée dans notre laboratoire. La quantification des PEC a été réalisée par cytométrie en flux et par culture cellulaire. En culture, deux types de PEC sont décrits : les PEC précoces, dont l’origine est monocytaire et pour lesquels la culture est déjà standardisée, et les « Endothelial Colony Forming Cells » (ECFC), seules cellules présentant des caractéristiques de cellules endothéliales progénitrices et pouvant être proposées comme produit de thérapie cellulaire. Nous avons optimisé la quantification des ECFC en culture en étudiant l’effet de diverses matrices et de la densité d’ensemencement des cellules mononucléées issues du sang total sur l’obtention de ces cellules et leurs propriétés angiogènes. La dysfonction endothéliale a été décrite comme un élément central dans le développement de l’HTAP dont le diagnostic repose sur la mesure de la pression artérielle pulmonaire par cathétérisme cardiaque droit. En l’absence de marqueur biologique non invasif dans cette maladie, nous avons quantifié les CEC et les progéniteurs circulants dans deux études. Une étude réalisée chez des patients adultes a montré une augmentation spécifique des CEC dans l’HTAP et non dans l’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique. Ainsi les CEC semblent être le reflet des lésions endothéliales pulmonaires et non de la sévérité clinique des patients. L’autre étude a montré l’intérêt de la quantification des CEC dans la prise en charge thérapeutique des enfants souffrant d’HTAP secondaire à une cardiopathie congénitale, dont les formes irréversibles présentaient des taux élevés de CEC. Nous avons ainsi défini un nouveau marqueur non invasif à utilité diagnostique et pronostique. Les PEC sont des cellules rares dans le sang circulant, difficiles à expandre, et dont les essais de mobilisation médullaire se sont révélés insuffisants. L’hypothèse récente d’une réserve vasculaire des progéniteurs endothéliaux nous a conduits à étudier l’effet d’un processus d’ischémie locale sur la mobilisation de ces cellules chez des volontaires sains. Deux groupes d'âge ont été inclus afin d'évaluer l'impact du vieillissement sur la méthode de mobilisation étudiée. Malgré un effet de cette ischémie sur la dilatation endothéliale cette méthode n’a pas permis de mobiliser significativement les PEC issus de la paroi endothéliale, quel que soit l'âge des sujets. A l’inverse, l’hypoxie a eu un effet délétère sur les capacités angiogènes des ECFC. / The endothelium plays a key role in the development and the homeostasis of vascular functions. It is also well involved in pathological situations like cardiovascular diseases. Thanks to the description of circulating endothelial markers, non invasive study of the endothelium is now possible. Our group was particularly interested in circulating endothelial cells (CECs), the level of which reflects an endothelial activation or lesion, and to circulating endothelial progenitors cells (EPCs), markers of endothelial repair. EPC description by Asahara in 1997 in adult blood, involved in new blood vessel formation by vasculogenesis, offered new perspectives, specially for cell therapy in ischemic diseases. This work consisted in the development of methods to study these markers in different contexts. First, we explored the interest of these markers in the physiopathology of pulmonary arterial hypertension (PAH). Then we evaluated endothelial progenitors mobilization from the vascular wall by a local ischemia process in healthy volunteers, in the perspective of an autologous cell therapy product development. One part of this project was the implementation and optimization of the methods to study CEC and EPC. CEC were quantified by magnetic immunoseparation. This technique was developped in 1992 by F. Dignat-George's group and transferred in our laboratory. EPC were quantified by flow cytometry and cell culture. Two types of EPC are described in culture: the early EPC, which originate from monocyte lineage and which culture is standardized, and the « Endothelial Colony Forming Cells » (ECFC), the only cells presenting endothelial progenitor cell properties and which use as a cell therapy product can be considered. ECFC quantification by culture was optimized by assessment of the impact of diverse matrices and seeding concentrations of mononuclear cells isolated from whole blood, on ECFC commitment and their angiogenic properties. Endothelial dysfunction was described as a central element in the development of PAH, which diagnosis is based on the use of right heart catheterization. Due to the lack of noninvasive marker for this disease, CEC and circulating progenitors were quantified in two studies. One of them realized in adult patients showed a specific increase of CEC in PAH and not in post-embolic PH. CEC would then reflect the presence of specific endothelial lesions and not the clinical state of the patients. The other study demonstrated the interest of CEC quantification in the therapeutic care of children with PAH secondary to congenital heart disease, for whom patients in irreversible state had a higher level of CEC. We then defined a new noninvasive biomarker.that can be used for the diagnosis and prognosis of PAH. EPC are rare events in whole blood, difficult to expand and for which, mobilization protocols revealed insufficient. The recent hypothesis of a vascular reservoir for endothelial progenitor led us to study the effect of a local ischemia procedure on the mobilization of these cells in healthy volunteers. Two age groups were included to assess the impact of aging on this procedure. Despite a significant endothelial dilation with the local ischemia, no EPC were mobilized, whatever the age group. Ischemia even altered ECFC angiogenic properties.