Dans le tractus gastro-intestinal, l'adhésion des bactéries commensales à l’épithélium permet leur maintien, ce qui aide à contrôler l’implantation de germes indésirables par des mécanismes de concurrence (effets nutritionnels, sites spécifiques d'adhésion ...). Bien que le rôle de la couche du mucus (principalement composée de glycoprotéines à haut poids moléculaire, appelées mucines) recouvrant la muqueuse soit connu et décrit depuis de nombreuses années, notamment pour sa fonction de barrière protectrice, l'intérêt pour décrypter les mécanismes précis d’interaction(s) avec le microbiote (bactéries commensales, pathogènes ou probiotiques) n’a que récemment émergé. Dans ce cadre, l'objectif de cette thèse, menée en collaboration entre le Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés de Toulouse et le Laboratoire d’Analyse et d’Architecture des Systèmes de Toulouse, est de caractériser in vitro le comportement muco-adhésif de Lactococcus lactis, le modèle des bactéries lactiques, en utilisant des approches de quantification multi-échelles (du niveau moléculaire à l’échelle multicellulaire) sur un large panel de souches naturelles et recombinantes. Une attention particulière est accordée au rôle des mucines, en utilisant le modèle PGM (mucine gastrique de porc ou « Pig Gastric Mucin »).La première partie du travail a porté sur la quantification à l'échelle de la cellule unique des interactions entre L. lactis et une surface abiotique (polystyrène) recouverte de PGM, en utilisant la microscopie à force atomique (AFM). La faisabilité de la méthode a tout d'abord été démontrée sur la souche modèle L. lactis ssp. cremoris MG1820. La couche de PGM a été caractérisée en utilisant des méthodes analytiques complémentaires (AFM, XPS - spectroscopie de photoélectrons induits par rayons X, QCM-D - Microbalance à Quartz à mesure de Dissipation...). En parallèle, les bactéries L. lactis ont été immobilisées sur la pointe AFM et utilisées comme « sonde de force », en considérant la souche naturelle IBB477 (L. lactis ssp. cremoris), d’origine laitière et présentant une forte persistance dans le tractus digestif du rat lors d’essais réalisés in vivo (collaboration avec l’Institut de Biochimie et de Biophysique de Varsovie, Pologne). Comparé aux conditions contrôle (i.e., surface de polystyrène sans PGM), les niveaux de force d'adhésion enregistrés entre L. lactis et PGM sont inférieurs, ceci en raison des répulsions électrostatiques, hydrophiles et stériques s’établissant entre la couche de PGM et la paroi cellulaire. La forme des courbes représentant l’évolution de la force au retrait en fonction de la distance est également différente. Une analyse détaillée souligne la contribution, conjointe et différente selon les souches testées, d’événements (i) non adhésifs, (ii) adhésifs non spécifiques (interactions électrostatiques, hydrophobes, de van der Waals) et (iii) adhésifs spécifiques (liaison de type ligand/récepteur). La contribution spécifique a ensuite été explorée plus finement en termes de constantes cinétiques d’association et de dissociation. Nous avons, par ailleurs, poursuivi notre exploitation de la biodiversité naturelle chez les lactocoques en étudiant la souche TIL448 (L. lactis ssp. lactis) d’origine végétale, en collaboration avec l’Institut MICALIS de Jouy-en-Josas. Nous avons ainsi démontré, pour la première fois chez L. lactis, le rôle combiné des protéines à domaine(s) MUB (« Mucus-Binding ») et des pili, à travers l'analyse approfondie des données AFM (force d'adhésion, répartition des événements adhésifs spécifiques/non spécifiques, distances d'interaction...). Le rôle des pili a été confirmé sur des souches recombinantes piliées (L. lactis ssp. lactis IL1403), toujours en partenariat avec l’Institut MICALIS de Jouy-en-Josas. En parallèle, en collaboration avec l’Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle de Villeneuve d'Ascq, nous avons cherché à identifier les O-glycannes de PGM (fractions neutre et acide), impliqués dans le processus d'interaction avec la surface bactérienne. Pour confirmer l’ensemble des résultats obtenus à l'échelle de la cellule unique et en mode statique par AFM (effet anti-adhésif de PGM, comportement muco-adhésif différent selon les souches de L. lactis), la deuxième partie du travail a été consacrée à des expérimentations à l’échelle de l’ensemble de la population bactérienne, en conditions dynamiques (QCM-D, chambre à écoulement cisaillé). Nous avons évalué par QCM-D chez les souches IBB477 et MG1820 les propriétés viscoélastiques des dépôts bactériens, en relation avec le comportement bio-adhésif vis-à-vis de la couche de PGM. Les données obtenues par AFM et chambre à écoulement cisaillé sur ces mêmes souches ont été confrontées pour accéder plus finement au mode d’interaction avec PGM (densité de liaisons sur la surface bactérienne). Enfin, nous avons évalué chez IL1403 l’effet des pili sur la dynamique de détachement et d’orientation sous cisaillement contrôlé.En conclusion, la combinaison des échelles d'observation et d’analyse, aussi bien au niveau de la cellule unique qu’à celui de l’ensemble de la population bactérienne, nous permet désormais de disposer de nouvelles connaissances sur les mécanismes diversifiés d'interaction entre L. lactis et PGM, visant à une meilleure compréhension des fonctionnalités de cette bactérie au niveau du tractus gastro-intestinal / In the gastrointestinal tract, adhesion of commensal bacteria to epithelial cells allows their retention, which helps to control the implementation of unwanted germs through mechanisms of competition (nutritional effects, specific sites of adhesion ...). Indeed, bacterial adhesion to the intestinal epithelium seems to be important for the balance of intestinal microbiota. Although the role of the mucus layer lining the mucosa, which is mainly composed of large glycoproteins termed mucins, is known and described for many years, particularly for its protective barrier function, the interest for unraveling precise mechanisms of interaction with bacteria (commensal, pathogens or probiotics) has just recently emerged. In this framework, the aim of the PhD thesis was to characterize in vitro muco-adhesive behavior of Lactococcus lactis, the model of Lactic Acid Bacteria, using multi-scale approaches (from molecular to multicellular levels) on a large set of natural and recombinant strains. A particular attention was paid to the role of mucins, using the PGM model (Pig Gastric Mucin).The first part of the work was focused on the quantification at nanoscale of interactions between L. lactis and adsorbed PGM, using AFM. The feasibility of the method was first demonstrated on the reference strain MG1820. PGM coating was characterized using a complementary set of analytical methods (AFM, XPS, quartz crystal microbalance with dissipation monitoring…). In parallel, L. lactis cells were immobilized onto the AFM tip and used as a living force probe, considering the natural strain IBB477 (L. lactis subsp. cremoris), isolated from Polish artisanal dairy products and previously shown to display in vivo retention in the rat gut (collaboration with the Institute of Biochemistry and Biophysics of Warsaw, Poland). Compared to control conditions (i.e., no PGM coating), adhesion force levels recorded for PGM were lower, due to the interplay of electrostatic, hydrophilic and steric repulsions. The shape of retraction force-distance curves for L. lactis/PGM interactions was also different. The detailed analysis of curve shape highlighted the contribution of non-adhesive, non-specific (electrostatic, hydrophobic, van der Waals interactions) and specific adhesive events (ligand/receptor bonding), depending on the strain under study. Specific forces were analyzed in terms of dissociation/association kinetic constants.We then explored the natural biodiversity among lactococci by studying the natural strain of L. lactis (subsp. lactis) TIL448 from plant origin, in collaboration with MICALIS (Jouy-en-Josas). We demonstrated, for the first time for L. lactis, the combined role played by “MUB-like” domain-containing protein and pili, through the thorough analysis of AFM data (adhesion force, repartition of specific/non-specific adhesive events and distances of interaction…). The role of pili was also confirmed with recombinant piliated strains (L. lactis subsp. lactis IL1403), in partnership with MICALIS (Jouy-en-Josas). In parallel, in collaboration with the “Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle de Villeneuve d'Ascq”, a first attempt was done to identify the O-glycans of PGM (neutral and acid fractions), involved in interactions with the bacterial surface.To confirm these results achieved at single-cell scale and under static mode by AFM (anti-adhesive of PGM, different muco-adhesive properties among several strains of L. lactis), the second part of the work was devoted to experiments at multicellular scale under dynamic conditions (quartz crystal microbalance with dissipation monitoring – QCM-D, shear stress flow chamber). We evaluated by QCM-D, for MG1820 and IBB477 strains, the viscoelastic properties of the cell layers, in relation with the bio-adhesive behavior towards PGM. The data obtained by AFM and shear stress flow chamber were combined to access more precisely to the interaction mode with PGM (density of bonds over the cell surface). Finally, using the recombinant piliated strain (IL1403), we focused on the effect of pili on detachment and re-orientation dynamics under shear flow

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin sont caractérisées par une inflammation anormale et récurrente du tractus digestif. De nombreuses études ont démontré des effets bénéfiques de souches probiotiques anti-inflammatoires recombinantes ou non. La première partie de cette thèse décrit différentes stratégies d'optimisation de souches de bactéries lactiques en tant que vecteurs de protéines d'intérêt santé. Nous avons ainsi démontré qu'une modification du peptidoglycane de la paroie de Lactococcus lactis influençant la lyse bactérienne ne permettait pas de moduler l'immunogénicité de l'antigène E7 délivré par L. lactis. Nous avons également démontré que la nature du vecteur bactérien était un paramètre essentiel dans la vectorisation de la protéine délivrée : ainsi l'espèce Bifidobacterium infantis induit une réponse immunitaire spécifique à l'antigène E7 supérieure à celle obtenue avec les vecteurs L. lactis et Lactobacillus plantarum. La deuxième partie de cette thèse porte sur l'étude des effets anti-inflammatoires de bactéries recombinantes ou non. Nous avons ainsi démontré que la souche Lb. casei BL23 produisant une superoxyde dismutase à manganèse permettait de diminuer significativement des colites murines induites par administration de dextran sodium sulfate. Enfin, nous avons mis en évidence des propriétés anti-inflammatoires sur divers modèles d'inflammation in vitro / in vivo de Faecalibacterium prausnitzii, première bactérie commensale anti-inflammatoire identifiée sur la base de données cliniques humaines.

Today, recombinant expression of proteins is used for a variety of purposes. One of these is the production of allergens, which are vital components in allergy diagnostics. However, traditional expression systems such as ​Escherichia coli​ and ​Pichia pastoris​ might not have the capacity to express all proteins of interest. Thermo Fisher, which is a leading producer of allergy tests, has requested an evaluation of different microorganisms and their capacity for heterologous protein expression in order to expand their existing toolbox of expression systems. This summary was made through a literature study, where twelve organisms were evaluated. Six eukaryotic and six prokaryotic expression systems are compared based on their ability to properly glycosylate protein, need for specific culture conditions, safety, protease activity, duration, protein yield and protein solubility. The prokaryotic systems – Corynebacterium glutamicum​ , ​Lactococcus lactis​ , ​Pseudomonas fluorescens​ , Pseudoalteromonas haloplanktis​ , ​Ralstonia eutropha​ and ​Streptomyces lividans​ – are characterized by being easy to cultivate, operating in different temperature ranges and providing relatively high yields of recombinant protein. The eukaryotic systems – ​Aspergillus fungi, the green algae ​Chlamydomonas reinhardtii​ , the yeast ​Hansenula polymorpha​ , the parasite ​Leishmania tarentolae​ , the moss ​Physcomitrella patens​ and suspension-based plant cells – all have very different morphology and properties. In comparison with the prokaryotic systems, it can be concluded that they are generally better at folding and providing the correct glycosylation patterns for mammalian and plant proteins. However, they require more time and effort to establish a competent cell line. Furthermore, the resulting protein yield is usually less than for the prokaryotic systems. The conclusion can be drawn that no expression system is perfect. The solution is a toolbox, containing various expression systems and vector systems, providing the basis for successful expression of all kinds of complex proteins. Based on the evaluation of expression systems in this review, such toolbox can be obtained.

Une recherche de souches bactériennes lactiques productrices de bactériocine a été entreprise à partir daliments traditionnels dorigine sénégalaise et les souches les plus actives ont été mises en uvre comme barrière en supplément du sel (NaCl) contre la croissance de la flore contaminante de différents poissons maigre [sompat (Pomadasys jubelini)], moyennement gras [capitaine (Polydactylus quadrifilis)], et gras [mâchoiron (Arius heudeloti)] de production artisanale au Sénégal. La prévalence des bactéries lactiques a été déterminée à 109 UFC/(g ou ml) dans les produits fermentés traditionnels à base de céréale et de lait, et 103 UFC/g dans les produits de la pêche fermentés. Douze souches bactériennes à activité inhibitrice de type bactériocine ont été détectées au sein de 220 souches de bactéries lactiques isolées de 32 échantillons de ces différents types de produits. Les 11 souches ont été caractérisées (API 50 CH, 16S rDNA) comme étant des souches de Lactococcus lactis subsp. lactis qui portent le gène codant pour la nisine, la souche restante est une souche dEnterococcus faecium et possède le gène codant pour lEntérocine B. Les deux souches, Lactococcus lactis subsp. lactis CWBI-B1410, isolée de farine de mil fermentée et productrice de nisine, et la souche Lactobacillus curvatus CWBI-B28 provenant de la collection du CWBI de la FUSAGx, produisant trois bactériocines de type curvalicine 28a, b et c, ont été mises en uvre en combinaison avec du sel comme barrière contre la croissance de la flore contaminante dans les poissons. La flore totale dans les poissons de production artisanale atteingnait 5,70 log UFC/g. La transformation des poissons par fermentation naturelle à 30°C (sans traitement préalable : procédé traditionnel), entraîne une prolifération de bactéries Gram-négatives comme Proteus sp, Shewanella putrefaciens et des souches de Bacillus sp qui atteignent 109-10 UFC/g en moins de 24 h dans les produits. Lutilisation de CWBI-B1410 (107 UFC/g) comme ferment avec ajout de glucose (1% m/m) dans les filets, entraîne une production in situ de substances antagonistes (acides organiques et bactériocine). Il en résulte une réduction du niveau de la flore contaminante entérique de 2 (P. quadrifilis) et de 4 (P. jubelini) log UFC/g par rapport aux poissons préparés traditionnellement. Lajout de sel dans des produits ainsi fermentés réduit la flore entérique. Laddition des surnageants de culture neutralisés (pH 6) bactéricides issus de CWBI-B1410 ou de CWBI-B28 en combinaison avec du chlorure de sodium (0,14 g/ml) sur les filets crus (100 ml/100 g) incubés à 10°C réduit le niveau de la contamination bactérienne de 1,5 log UFC/g et retarde laugmentation de la flore qui reste à un niveau < 106 UFC/g pendant 13 à 18 jours dincubation à 10°C selon le type de poisson, alors que pour les filets contrôles, traités avec des surnageants de culture neutralisés de souches non productrices de bactériocines (Lactobacillus curvatus LMG 21688 et Lactococcus lactis LMG 6890) salés (NaCl 0,14 g/ml), la flore contaminante dépasse 106 UFC/g au bout de 3 à 7 jours. Les effets antibactériens des surnageants de cultures neutralisés bactéricides et salés (NaCl 0,14 g/ml), sont par ailleurs, plus importants que ceux dune solution salée (NaCl 0,14 g/ml) supplémentée de sels de benzoate et de sorbate en concentration de 0,5 mg/ml chacun sur les poissons riches en lipides. Ces résultats suggèrent que, la combinaison des effets antibactériens des bactéries lactiques productrices de bactériocines et du sel, plus particulièrement lutilisation de SCN salés, comme préservatifs, peut constituer un moyen approprié damélioration de la conservation et de la qualité microbiologique des produits de la pêche artisanale au Sénégal. Le traitement des poissons selon lune ou lautre des stratégies décrites précédemment, combiné à un système de séchage devrait permettre de produire des produits halieutiques traditionnels de meilleures qualités microbiologiques et de durée de conservation plus longue, justifiant limportance de continuer cette étude sur lamélioration de la productivité de bactériocine par CWBI-B1410, et les impacts des nouveaux traitements sur les qualités organoleptiques et nutritionelles des produits. A screening of bacteriocin-producing lactic acid bacteria from Senegalese traditional food products was undertaken and the most active strains were tested in combination with sodium chloride as barrier to control spoilage bacteria growth on different artisanal fish products [lean sumpat grunt (Pomadasys jubelini), moderarely fat giant African threadfin (Polydactylus quadrifilis) and fat smoothmouth sea catfish (Arius heudeloti)] in Senegal. The prevalence of lactic acid bacteria was determined at 109 CFU/(g or ml) in traditional fermented cereals and fermented milk products, and 103 CFU/g in fermented seafood products. Twelve bacteriocin-producing strains were detected of 220 lactic acid bacteria strains randomly selected from such products. The eleven were characterized (API 50CH and 16S rDNA) as Lactococcus lactis subsp lactis strains and contain gene encoding nisin, and the remaining one an Enterococcus faecium strain which contains gene encoding Enterocin B. Two strains, Lactococcus lactis subsp. lactis CWBI-B1410, a nisin producer isolated from fermented millet flour from Senegal, and Lactobacillus curvatus CWBI B28 which produces three bacteriocins (Curvalicin 28a, b et c) from CWBI collection, were tested in combination with sodium chloride as barrier to control spoilage bacteria growth on fish from artisanal production. The total bacterial counts of fishes reached 5.7 log CFU/g. The processing of such products by natural fermentation at 30°C (without any preliminary treatment as in traditional process) result in proliferation of Gram-negative bacteria such as Proteus sp and Shewanella putrefaciens, and some Bacillus sp strains, which reached 109-10 CFU/g in products within less than 24 h of incubation. When using CWBI-B1410 living culture (107 CFU/g) with glucose (1% wt/wt) supplementation as barrier against bacterial growth in fishes, a depression of the pH as well as a bacteriocin-like activity were noted, resulting in a decrease of the Gram negative strains counts of 4 log CFU/g (P. jubelini) and 2 log CFU/g (P. quadrifilis) in comparison to fishes prepared in using traditional process. The addition of salt in such fermented products reinforced the antimicrobial effect by CWBI-B1410 strain. The addition of neutralized (pH 6) culture supernatants of CWBI-B1410 or CWBI-B28 strains in combination with sodium chloride (0.14 g/ml) as preservatives on fishes (100 ml/100 g) incubated at 10°C, declined the level of total bacterial counts of 1.5 log CFU/g within 48 h, and delayed the increase of bacteria number in fishes: bacterial counts remained under 106 CFU/g for 13 to 18 days of storage at 10°C following the fish, whereas they were over 106 CFU/g after 3 to 7 days fish storage at 10°C in controls, treated with salted (NaCl 0.14 g/ml) neutralized (pH 6) culture supernatants of non-bacteriocin producers (Lactococcus lactis LMG 6890 and Lactobacillus curvatus LMG 216888). The antimicrobial effects by salted neutralized culture supernatants of the bacteriocin producers were higher to those of salted solution (NaCl 0.14 g/ml) supplemented with benzoate and sorbate acid salts each at concentration of 0.5 mg/ml on the moderate and fat fishes. These data suggest that the use of bacteriocin-producing lactic acid bacteria in combination with sodium chloride as described above, particularly the use of salted bactericidal culture supernatant, as preservatives, can be a suitable strategy to enhance the storage and the bacterial quality of traditional fish products in Senegal. The treatment of fishes in using one of the strategies as described above combined with a drying process could permit production of seafood commodities with higher bacterial quality and time of storage, justifying to continue this investigation on the enhancement of the bacteriocin-productivity by CWBI-B1410, and the evaluation of the effects of the new treatments on the organaoleptic and nutritional quality of products.