Universiẗat, Diss., 2006--Frankfurt (Main).

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 14 mai 2007). Bibliogr.

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2005. / Title from first page of PDF file. Includes bibliographical references.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-12-16T14:12:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1662524 bytes, checksum: 8a034e9afef2acfa219982f1ffbd98e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-16T14:12:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1662524 bytes, checksum: 8a034e9afef2acfa219982f1ffbd98e9 (MD5) Previous issue date: 2012-09-10 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O queijo Minas frescal é um dos produtos mais populares do Brasil e suas características nutricionais não são limitantes para o crescimento de micro-organismos deterioradores e patogênicos. Surtos de intoxicação alimentar envolvendo queijos Minas frescal contaminados com Staphylococcus aureus são frequentes e, por esse motivo, torna-se necessário o desenvolvimento de novas estratégias que controlem o crescimento desse patógeno no produto. Em razão disso, o objetivo desse trabalho foi o de avaliar o efeito das bacteriocinas bovicina HC5, nisina e de bactérias lácticas sobre o crescimento e produção de enterotoxinas por S. aureus. O crescimento das estirpes de S. aureus ATCC 6538, EMBRAPA 4018 e FRI 722 foi acompanhado em caldo tripticase e soja (TSB) e em leite em pó desnatado reconstituído a 10 % (LDR 10%), a 37 oC, em presença de bovicina HC5 e, ou nisina e Lactococcus lactis ATCC 19435. Amostras de queijo Minas frescal produzido com cultura starter (Lactococcus lactis subsp. lactis e L. lactis subsp. cremoris) foram inoculadas com, aproximadamente, 106 UFC.g-1 das estirpes de S. aureus e adicionadas de 1200 UA.g-1 das bacteriocinas. A presença das bacteriocinas aumentou a fase lag e este efeito foi mais acentuado na presença de nisina. Embora as bacteriocinas tenham apresentado efeito inibidor inicial, S. aureus reassumiu o crescimento e alcançou população final similar ao do tratamento controle, sem bacteriocinas, após 24 h de incubação. A produção de enterotoxina pelas estirpes de S. aureus avaliadas neste estudo foi detectada no meio TSB tanto na ausência como na v presença de bacteriocinas adicionadas ao meio de cultura. O cocultivo de S. aureus e L. lactis não interferiu no crescimento do patógeno, porém foi suficiente para inibir a produção de enterotoxinas. Em LDR 10 %, as bacteriocinas combinadas a 1200 UA.mL- exerceram efeito bactericida sobre as estirpes avaliadas de S. aureus e não foi possível recuperar sobreviventes pela técnica de contagem em placas após 96 h de incubação. A adição das bacteriocinas combinadas em queijo Minas frescal reduziu a população inicial de S. aureus, bactérias starter e da microbiota contaminante do queijo. A presença de enterotoxinas não foi detectada nos queijos produzidos com culturas starter, adicionados ou não das bacteriocinas nisina e bovicina HC5. / The Minas fresh cheese is one of Brazil's most popular products and their nutritional characteristics are not limiting to the growth of pathogenic and spoilage microorganisms. Outbreaks of food poisoning involving Minas fresh cheese contaminated with Staphylococcus aureus are frequent and, therefore, it becomes necessary to develop new strategies to control the growth of this pathogen in the product. For this reason, the aim of this study was to evaluate the effect of bovicin HC5, nisin and lactic bacteria on the growth and production of enterotoxins by S. aureus. The growth of strains of S. aureus ATCC 6538, EMBRAPA 4018, FRI 722 was conducted in tryptic soy broth (TSB) and reconstituted skimmed milk powder 10% (RSM 10%), at 37 °C, in the presence of bovicin HC5 and, or nisin and Lactococcus lactis ATCC 19435. Minas fresh cheese samples produced with starter culture (Lactococcus lactis subsp. lactis and L. lactis subsp. Cremoris) were inoculated with approximately 106 UFC.g-1 of strains of S. aureus and were containing added of 1200 UA.g-1 of bacteriocins. The presence of bacteriocins increased lag phase and nisin showed this effect more pronounced. Although the bacteriocins have shown initial inhibitory effect, S. aureus started to grow again and achieved the final population similar to the control treatment, without bacteriocins, after 24 h incubation. The enterotoxin production by strains of S. aureus evaluated in this study was detected in TSB medium both in the vii absence or presence of bacteriocins added to the culture medium. The coculture of S. aureus and L. lactis did not affect the growth of the pathogen, but it was sufficient to inhibit the production of enterotoxins. In RSM 10%, bacteriocins combined to 1200 UA.mL-1 exerted bactericidal effect on the strains of S. aureus and it was not possible to recover survivors by plate count technique after 96 h incubation. The addition of bacteriocins combined in Minas fresh cheese reduced the initial population of S. aureus, starter bacteria and contaminant microbiota of the cheese. The presence of enterotoxins was not detected in cheeses produced with starter cultures, added or not of bacteriocins nisin and bovicin HC5. / Não foi encontrado o cpf do autor.

La conception de nouveaux produits laitiers fermentés fonctionnalisés avec les peptides bioactifs est l'une des stratégies prometteuses pour le développement d'aliments fonctionnels. L'objectif de cette thèse s'inscrit ainsi dans une démarche de production d'un lait fermenté contenant un peptide anxiolytique, l'alpha-casozépine (alpha-CZP ; f91-100 de la CN-alpha s1 bovine) ou du fragment plus court (f91-97). Dans un premier temps, nous avons étudié la stabilité des peptides bioactifs vis-à-vis des souches ayant le phénotype PrtS+ (LMD-9) et PrtS- (CNRZ1066) de S. thermophilus. Il s'est avéré que les deux souches sont capables d'hydrolyser le peptide en fragments plus courts par l'activité peptidasique de surface. Il a été vérifié que l'hydrolyse n'est due ni aux peptidases intracellulaires issues d'une éventuelle lyse cellulaire ni à la protéase chaperonne HtrA. Les activités de type amino-, X-prolyl dipeptidyl-, carboxy-peptidases et peptidyl dipeptidase de surface ont été mises en évidence. L'ajout de peptides bioactifs dans des laits fermentés nécessite donc la caractérisation préalable du potentiel protéolytique des bactéries lactiques. Afin de n'ajouter qu'un type de peptides et non pas une fraction peptidique, nous avons exprimé de manière hétérologue l'alpha-CZP sous forme multimérique chez L. lactis en utilisant le système d'induction NICE. Il a été révélé par le test ELISA qu'une petite quantité d'alpha-CZP multimérique a été produite par les cellules induites mais également non induites par la nisine. Le ralentissement important de la croissance des cellules de L. lactis recombinante induites par la nisine suggère que le multimère peptidique a des effets toxiques sur les cellules / The designing of novel fermented milk products functionalized with bioactive peptides is one of the promising strategies to develop functional foods. The objective of the thesis is thus the development of fermented milks comprising of an anxiolytic peptide, alpha-casozepine (f91-100 of bovine alpha s1 CN) or its shorter fragment (f91 97). Firstly, we studied the stability of different bioactive peptides towards two strains, with PrtS+ (LMD¬9) and PrtS- (CNRZ1066) phenotypes, of S. thermophilus, a starter bacterium widely used for the manufacture of yogurt. It was revealed that both strains hydrolysed the peptides into shorter fragments by surface peptidases. The hydrolysis was neither due to intracellular peptidases eventually released from cell lysis nor to extracellular chaperone protease HtrA, since mutant LMD-9-deltahtrA also showed the same type of hydrolysis. Aminopeptidase, X-prolyl dipeptidyl peptidase, peptidyl dipeptidase and carboxypeptidase activities associated to the cell-surface of both strains were observed. Therefore, addition of bioactive peptides in fermented milks requires well prior characterization of the proteolytic potential of lactic acid bacteria. Finally, in order to add only one type of peptides instead of a peptide fraction, we expressed heterologously alpha-CZP in multimeric form in L. lactis using NICE system. It was revealed by ELISA test that a small quantity of recombinant alpha-CZP multimer was produced by both nisin-induced as well as non-induced cells. The significant decrease in the growth of nisin-induced recombinant L. lactis suggests that the peptide multimer has toxic effects on the cells

Les résultats obtenus dans ce travail ont permis de démontrer que chez les deux bactéries lactiques modèles, L. lactis subsp. cremoris et O. oeni, la transcription du gène cfa, codant pour la Cfa synthase, est stimulée lorsque les cellules entrent en phase stationnaire de croissance ou lorque que les cellules sont cultivées en conditions de stress (milieu acide ou présence d’éthanol dans le milieu). Le rôle des CFA a pû être appréhendé par l’analyse physiologique comparative de la souche parentale L. lactis subsp. cremoris et du mutant Δcfa généré chez cette souche. Les forts pourcentages de survie obtenus chez les souches cultivées à pH 5,0, puis subissant un stress acide (pH 3,0), prouvent que la cyclopropanation des acides gras insaturés n’est pas indispensable à la survie de L. lactis subsp. cremoris en conditions de stress acide. En outre, les données d'anisotropie de fluorescence démontrent que la présence de CFAs membranaires ne permet pas de réguler le niveau de fluidité membranaire, en particulier avec les souches cultivées en présence d’éthanol, où une fluidification membranaire est observée dans tous les cas. L'hypothèse d'un équilibre entre les acides palmitoléique / cis-vaccénique / lactobacillique pour réguler la fluidité membranaire chez L. lactis subsp. cremoris est avancée. L’étude du rôle physiologique des CFA chez O. oeni nécessite l’expression du gène cfa de la bactérie en système hétérologue. Les résultats obtenus confirment la fonctionnalité du gène chez la bactérie hôte L. lactis subsp. cremoris, cependant la cyclisation du précurseur acide cis-vaccénique, reste partielle chez la souche mutante complémentée. Un travail de caractérisation biochimique in vitro de l’enzyme Cfa synthase de O. oeni a donc été entrepris afin d’expliquer la faible efficacité de l’enzyme de O. oeni chez la bactérie hôte. Les travaux réalisés ont permis la surproduction et la purification de l’enzyme. Une technique de mesure d’activité in vitro a été également développée. Une stratégie d’expression du gène cfa de O. oeni en système hétérologue dans la bactérie hôte E. coli BL21 Star a permis la surpoduction d’une protéine d’environ 45 kDa, en accord avec la masse moléculaire théorique de la Cfa synthase de O. oeni. A partir de l’extrait protéique, une purification a été réalisée par chromatographie d’affinité sur colonne d’agarose nickel. Les tests d’activité enzymatique in vitro ont pu été réalisés. La température optimale de l’enzyme est de 35,8°C. Son pH optimal est de 5,6. Même en se plaçant dans les conditions physico-chimiques optimales de l’enzyme, nous constatons que la cyclisation in vitro de l’acide cis-vaccénique issu des phospholipides membranaires du mutant L. lactis subsp. cremoris Δcfa reste partielle. Ceci induit une détermination expérimentale de valeurs de KM et Vmax largement supérieures aux données citées dans la littérature. La différence, entre les deux bactéries modèles, de nature et de répartition des phospholipides membranaires pourrait expliquer l’action partielle de la Cfa synthase de O. oeni. / The results obtained in this work have shown that in both lactic acid bacteria models, L. lactis subsp. cremoris and O. oeni, transcription of the cfa gene, encoding the Cfa synthase is stimulated when cells enter stationary phase of growth or when the cells are grown under stress conditions (acidic or presence of ethanol in the medium). The role of the CFAs has been apprehended by the comparative physiological analysis of the parental strain L. lactis subsp. cremoris and a Δcfa mutant generated in this strain. The high percentages of survival obtained in strains grown at pH 5.0 and undergoing acid stress (pH 3.0) prove that the cyclopropanation of unsaturated fatty acids is not essential to the survival of L. lactis subsp. cremoris under conditions of acid stress. In addition, fluorescence anisotropy data show that the presence of membrane CFA does not regulate the level of membrane fluidity, especially with strains grown in the presence of ethanol. The assumption of a balance between palmitoleic acid / cis-vaccenic acid / lactobacillic acid in membrane fluidity regulation in L. lactis subsp. cremoris is advanced. The study of the physiological role of CFA in O. oeni requires cfa gene expression of the bacterium in a heterologous system. The results confirm the functionality of the gene in the host bacterium L. lactis subsp. cremoris. However, the cyclopropanation of the precursor cis-vaccenic acid remains partial in the mutant strain complemented. Biochemical characterization in vitro of the enzyme CFA synthase from O. oeni was therefore undertaken in order to explain the low efficiency of the enzyme of O. oeni in the host bacterium. The work led to the overproduction and purification of the enzyme. A technique for measuring the activity in vitro has also been developed. A strategy of O. oeni cfa gene expression in the heterologous host bacterium E. coli BL21 Star has permitted the surpoduction of a protein of approximately 45 kDa. This data is in agreement with the theoretical molecular weight of the CFA synthase from O. oeni. Protein purification was performed by affinity chromatography on nickel-agarose column. Enzymatic activity assays in vitro have been made. The optimum temperature for the enzyme is 35.8 ° C. Its optimum pH is 5.6. However, we find that the in vitro cyclopropanation of cis-vaccenic acid from membrane phospholipids of the mutant L. lactis subsp. cremoris Δcfa remains partial. This leads to an experimental determination of KM and Vmax values much higher than the data cited in the literature. The difference between the nature and the distribution of membrane phospholipids in the two model bacteria may explain the partial activity of Cfa synthase from O. oeni.

[EN] This thesis deals with the development of a living biointerface between synthetic substrates and living cells to engineer cell-material interactions for tissue engineering purposes. This living biointerface is made of Lactococcus lactis, a non-pathogenic lactic bacteria widely used as starter in the dairy industry and, recently, in the expression of heterologous proteins in applications such as oral vaccine delivery or membrane-bound expression of proteins. L. lactis has been engineered to display the III 7-10 fragment of the fibronectin fused to GFP as reporter protein. Fibronectin is a ubiquitous protein present in the extracellular matrix, a complex mesh of structural and adhesive proteins which serve as mechanical support and development niche for cells of a wide variety of tissues. This fragment contains two important sequences, RGD and PHSRN. RGD is an adhesive sequence that interacts with a wide range of integrins, membrane-bound receptors that play a role in cellular processes such as adhesion, migration, proliferation and differentiation. On the other hand, PHSRN binds synergistically with RGD to some integrins such as alpha-5-beta-1 and others, increasing the specificity of this interaction. Genetically engineered L. lactis has been thoroughly characterized to test its capabilities as a living interface. This strain was found to express the FNIII 7-10-GFP fragment covalently linked to the cell wall and biological activity and expression levels of this fragment was assessed with techniques such as Western blot, ELISA and immunofluorescence. Moreover, this strain still holds the ability to develop biofilms, communities of sessile, attached bacteria to abiotic surfaces which helps greatly in the generation of a stable monolayer of bacteria between synthetic substrates and mammalian cells. Mammalian cell behaviour in response to the expressed fibronectin fragment on L. lactis membrane was also assessed. Several cell lines were tested, such as Fn-/Fn- and NIH3T3 fibroblasts, C2C12 myoblasts and human bone-marrow derived mesenchymal cells. This living biointerface was found to trigger cell adhesion and FAK phosphorylation, a marker for intracellular integrin-mediated signalling in all of the tested cell lines. It also triggered myoblast-to-myotube differentiation on C2C12 cells. In hMSCs, the cell-wall exposed fibronectin fragment was found to enhance the phosphorylation of ERK1/2, a kinase involved in the MAPK pathway, which is deeply involved in a multitude of cellular processes related to differentiation, proliferation and migration. Nevertheless, this thesis is a proof of concept that this novel system can be further exploited to express almost any desired protein or small molecule to help in the development of new tissues from progenitor cells. These molecules can be either secreted in the medium or displayed in the membrane, and can also be constitutively expressed or in-demand, due to the great flexibility of L. lactis and the wide variety of expression systems available. This interface based on living bacteria establishes a new paradigm in surface functionalization for biomedical engineering applications. / [ES] Esta tesis aborda el desarrollo de una biointerfase viviente entre materiales sintéticos y células vivas con el objetivo de dirigir la interacción célula-material en aplicaciones de ingeniería tisular. Esta biointerfase está compuesta de Lactococcus lactis, una bacteria láctica no patógena, ampliamente usada en la industria láctea como inóculo, y, recientemente, en la expresión heteróloga de proteínas para su uso como vacunas de administración oral o su expresión en membrana. L. lactis ha sido genéticamente modificado para expresar el fragmento III 7-10 de la fibronectina, unida a GFP como reporter. La fibronectina es una proteína presente de forma ubicua en la matriz extracelular, una compleja red de proteínas adhesivas y estructurales cuyo propósito es servir como soporte estructural y como nicho de desarrollo para diversos tejidos. Este fragmento contiene dos secuencias importantes, RGD y PHSRN. RGD es una secuencia adhesiva de unión que interacciona con una amplia variedad de integrinas, receptores de membrana que juegan muchos e importantes papeles en diferentes procesos celulares, como adhesión, proliferación, migración o diferenciación. Por otra parte, PHSRN se une a las integrinas de forma sinérgica con RGD facilitando aún más estos procesos y aumentando la especificidad de esta interacción. Esta cepa de L. lactis modificada ha sido ampliamente caracterizada para estudiar su idoneidad como interfaz funcional viviente. Se ha demostrado que L. lactis es capaz de expresar el fragmento FNIII7-10-GFP covalentemente anclado a la pared celular bacteriana, habiéndose caracterizado también su actividad biológica con técnicas como Western blot, ELISA e inmunofluorescencia. Esta cepa mantiene la capacidad de desarrollo de biofilms presente en la gran mayoría de microorganismos. Los biofilms son comunidades de bacterias sésiles adheridas a un sustrato que pueden ser usadas como interfase física entre células de mamífero y sustratos abióticos. También se ha estudiado la respuesta celular a la fibronectina expuesta en la membrana de L. lactis. Se estudiaron varias líneas celulares, como fibroblastos Fn-/Fn- y NIH3T3, mioblastos C2C12 y células mesenquimales humanas derivadas de médula ósea. Esta interfase viviente fue capaz de provocar respuesta celular en forma de adhesión en todas las líneas estudiadas, además de inducir diferenciación de mioblastos a miotubos en C2C12 y de provocar la fosforilación de FAK, un marcador de señalización celular mediada por integrinas. En células mesenquimales humanas se demostró la capacidad del fragmento de fibronectina expuesto para fosforilar ERK1/2, una kinasa perteneciente a la ruta de señalización MAPK, ruta que forma parte de muchos procesos celulares importantes como diferenciación, proliferación y migración. Pese a todo, esta tesis es sólo una prueba de concepto de un sistema que puede ser utilizado para expresar casi cualquier proteína o molécula pequeña deseada, que puede ser muy útil en el desarrollo de nuevos tejidos a partir de sus células progenitoras. Estas moléculas pueden ser secretadas en el medio o ancladas en la pared celular, de forma constitutiva o bajo demanda, debido a la flexibilidad y amplia variedad de sistemas de expresión disponibles para L. lactis. Esta biointerfase basada en bacterias vivas establece un nuevo paradigma en el campo de la funcionalización de superficies para aplicaciones de ingeniería biomédica. / [CAT] Aquesta tesi aborda el desenvolupament d'una interfase viva entre materials sintètics i cèl·lules vives amb l'objectiu de dirigir la interacció cèl·lula-material, per al seu ús en aplicacions d'enginyeria tissular. Aquesta interfase està composta de Lactococcus lactis, un bacteri làctic, no patogènic i àmpliament utilitzat en l'industria làctica com a inòcul, i, recentment, en l'expressió heteròloga de proteïnes per al seu ús com vacunes d'administració oral o per a la seva expressió en membrana. L. lactis ha sigut genèticament modificada per a expressar el fragment III7-10 de la fibronectina, unida a GFP com a reporter. La fibronectina és una proteïna present de forma ubiqua en la matriu extracel·lular, una complexa xarxa de proteïnes adhesives i estructurals que s'utilitzen com a suport estructural i com a nínxol de desenvolupament per a diversos teixits. Aquest fragment conté dos seqüències importants, RGD i PHSRN. RGD és una seqüència adhesiva d'unió a integrines, receptors de membrana que juguen molts i molt importants papers en diferents processos cel·lulars, com poden ser adhesió, proliferació, migració o diferenciació. Per altra banda, PHSRN s'uneix a les integrines de forma sinèrgica amb RGD facilitant encara més aquests processos i augmentant l'especificitat d'aquesta interacció. Aquesta modificació genètica de L. lactis ha estat àmpliament caracteritzada per provar les seves característiques com a interfase funcional vivent. S'ha demostrat que L. lactis és capaç d'expressar el fragment FNIII 7-10-GFP covalentment ancorat a la paret cel·lular bacteriana, havent-se caracteritzat també la seva activitat biològica amb tècniques com Western blot, ELISA i immunofluorescència. A més, aquest cep manté la capacitat de desenvolupament de biofilms, comunitats de bacteris sèssils adherits a un substrat que poden ser utilitzades com a interfase física entre cèl·lules de mamífer i substrats abiòtics. També s'ha estudiat la resposta cel·lular a la fibronectina expressada en la paret cel·lular de L. lactis. El estudi es va fer utilitzant diverses línies cel·lulars, com fibroblasts Fn-/Fn- i NIH3T3, mioblasts C2C12 i cèl·lules mesenquimals humanes derivades de medul·la òssia. Aquesta interfase vivent va ser capaç de provocar resposta cel·lular en forma d'adhesió a totes les línies estudiades, a més d'induir diferenciació de mioblasts a miotubs en C2C12 i de provocar la fosforilació de FAK, un marcador de senyalització cel·lular mediat per integrines, en les línies assajades. En cèl·lules mesenquimals humanes es va demostrar la capacitat del fragment de fibronectina exposat per fosforilar ERK1/2, una kinasa pertanyent a la ruta de senyalització MAPK, ruta que forma part de molts processos cel·lulars importants com diferenciació, proliferació i migració. Malgrat tot, aquesta tesi mostra només una prova de concepte d'un sistema que pot ser utilitzat per expressar gairebé qualsevol proteïna o molècula petita desitjada, que pot ser molt útil en el desenvolupament de nous teixits a partir de les seves cèl·lules progenitores. Aquestes molècules poden ser secretades en el medi o ancorades a la paret cel·lular, de manera constitutiva o sota demanda, a causa de la flexibilitat i àmplia varietat de sistemes d'expressió disponibles per L. lactis Aquesta biointerfase basada en bacteris vius estableix un nou paradigma en el camp de la funcionalització de superfícies per a aplicacions d'enginyería biomèdica. / Rodrigo Navarro, A. (2015). Functional living biointerfaces to direct cell-material interaction [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/51461 / TESIS

This study investigated the effect of cold, heat, or osmotic shock treatment on the resistance of L. lactis subsp. cremoris MM160 and MM310 and Lactococcus lactis subsp. lactis MM210 and FG2 cheese starter bacteria to freezing and freeze-drying. The ability to withstand freezing at -60°C for 24 h was variable among lactococci, but resistance to this treatment was significantly improved (P < 0.05) in most strains by a 2-h cold shock at l0°C or a 25-min heat shock at 39°C (L. lactis subsp. cremoris) or 42°C (L. lactis subsp. lactis). Stress treatments that improved lactococcal freeze resistance were also found to significantly (P < 0.05) enhance the resistance of most strains to lyophilization. Increased resistance to freezing or lyophilization was not detected when stress treatments were performed in broth that contained erythromycin, which indicated stress-inducible proteins were involved in cell protection. Membrane fatty acid analysis of stress-treated cells suggested that enhanced resistance to freezing and lyophilization may be related to heat or cold shock-induced changes in cell membrane composition. Heat-shocked cells had a higher 19:0 cyclopropane fatty acid content than did control cells, and cold-shocked cells contained a lower ratio of saturated to unsaturated fatty acids. Other factors must also be involved in cell protection, however, because similar changes in membrane composition were also detected in strains whose resistance to freezing and lyophilization was not improved by heat or cold shock.

La fabrication du Cheddar repose sur plusieurs facteurs, le choix du ferment est l’un des plus déterminants pour la formation du caillé. Les ferments utilisés peuvent être des mélanges de souches, qui n’ont pas toutes les mêmes performances, ce qui entrainent une grande variation dans la qualité du fromage obtenu. L’objectif de cette étude est d’examiner chez 19 souches de Lactococcus lactis ssp. cremoris, certaines caractéristiques d’intérêt technologique tel que l’acidification, la protéolyse et l’autolyse afin d’évaluer leur potentiel pour un éventuel usage dans des ferments dans le but d’optimiser la qualité du fromage avec des caractéristiques constantes. Le test de Pearce est utilisé pour se rapprocher le plus des conditions fromagères. À la suite de ce test, les activités enzymatiques (protéolytique et autolytique) ont été mesurées. L’activité autolytique varie de 424 mU/ml pour la souche 73 à 47 mU/ml pour la souche 83. Pour l’activité protéolytique, on a utilisé deux substrats, MS-Arg et S-Glu. Deux souches (SK11 et E2) se sont distinguées par une activité S-Glu (2,81 et 4,40 mU/ml) plus élevée que Ms-Arg (0 et 0,55mU/ml) dans un tampon sans le NaCl, alors que pour les autres souches, l’activité d’hydrolyse de Ms-Arg était supérieure. La souche E2 a la meilleure activité PepN (14,43 mU/ml) alors que ce sont les souches 83 et E2 qui ont la plus forte activité PepX (40,01 et 20,29 mU/ml). En se basant sur ces résultats, 12 ferments constitués de 3 souches ont été formulés. Les paramètres recherchés pour avoir un ferment considéré comme idéal sont une production d'acide lactique rapide, une activité peptidasique sans génération d'amertume et une capacité d'autolyse dans le fromage. Dans cette étude, une méthode simple et rapide est utilisèe pour caractériser les activités enzymatiques des souches, qui pourrait être utilisée par l’industrie et les résultats obtenus pourraient servir à l’élaboration de nouveaux ferments. / The manufacture of Cheddar is based on several factors; the choice of the ferment is one of the most determining factors for the formation of the curd. The ferments used may be mixtures of strains, which do not all have the same performance, which results in a large variation in the quality of the cheese obtained. The objective of this study was to examine 19 strains of Lactococcus lactis ssp. cremoris, certain characteristics of technological interest such as acidification, proteolysis and autolysis in order to evaluate their potential for eventual use in ferments in order to optimize the quality of the cheese with constant characteristics. The Pearce test is used to get closer to cheese conditions by following a temperature diagram specific to the manufacture of Cheddar. Following this test, enzymatic activities (proteolytic and autolytic) were measured. Autolytic activity varies from 424 mU / ml for strain 73 to 47 mU / ml for strain 83. For proteolytic activity, two substrates, MS-Arg and S-Glu, were used. Two strains (SK11 and E2) were distinguished by higher S-Glu activity (2.81 and 4.40 mU / ml) than Ms-Arg (0 and 0.55 mU / ml) in buffer without NaCl, whereas for the other strains the Ms-Arg hydrolysis activity was greater. The E2 strain has the best PepN activity (14.43 mU / ml) whereas strains 83 and E2 have the highest PepX activity (40.01 and 20.29 mU / ml). Based on these results, 12 ferments consisting of 3 strains were formulated. The desired parameters for a ferment considered as ideal are a rapid lactic acid production, a peptidase activity without generation of bitterness and an autolysis capacity in the cheese. In this study, a simple and rapid method was used to characterize the enzymatic activities of the strains, which could be used by the industry and the results obtained, could be used to develop new ferments.

Les bactéries lactiques contribuent à la qualité des produits laitiers fermentes par leurs activités enzymatiques. Cette activité est reflétée en partie par le transcriptome, qui représente l'ensemble des gènes exprimés en ARN. Le but de cette recherche est donc d'estimer l'activité de Lactococcus lactis ssp. cremoris par suivi de l'expression des gènes lors de l'étape de la fermentation du lait de fromagerie. Pour étudier les transcriptomes, une technique de RAP-PCR fluorescente a été développée puis appliquée à un ferment mixte composé de trois souches de lactocoques. Les résultats de cette technique montrent que le lait UHT présente un bon compromis entre hygiène et altération thermique des constituants. Dans le lait entier, le CO2 interagit avec les ferments en changeant leur profil de transcription, cette influence n'apparait pas dans le lait écrémé pasteurisé. Comparativement à l'ajout d'une base, l'agitation du lait carboné est une bonne méthode pour réduire l'influence du CO2 sur le ferment. Lors d'une fermentation de type Cheddar, le profil de transcription d'un ferment mixte est très influencé par un excès de NaCl et par un manque d'activité de la présure. La RAP-PCR fluorescente peut identifier les souches par leurs profils d'ARN et analyser les particularités d'une association bactérienne. Selon les conditions observées, le ferment mixte composé par trois souches de Lactococcus lactis ssp. cremoris (LL074, LL225 et LL390) est formé d'une association stable de deux souches : LL225 avec LL390 alors que la souche LL074 est éliminée. La souche LL225 apparait la plus réactive en réagissant identiquement par la modulation de certains gènes en présence des souches LL074 ou LL390. Une modulation de la transcription de certains gène de la souche de LL390 apparait en présence de la souche LL225 mais aucune en présence de LL074, LL390 ne faisant que dominer cette souche. L'association des souches LL225 avec LL390 se fait en rapport égal et induit une modulation de leurs gènes aussitôt que les souches sont en présence. Les données ont été validées en analysant la transcription de gènes par RT-PCR en temps réel et par di-sondes FRET adjacentes et sont en adéquation avec les incompatibilités entre souches dues aux types de proteinases de membrane. L'activité d'un ferment mixte lors d'une fabrication de type Cheddar est donc influencée par le type de lait utilisé et par une dynamique d'association entre les souches.