Recent evidence suggests that leflunomide, a dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) inhibitor, disrupts neural crest development and melanoma pathogenesis via inhibiting transcription elongation. DHODH is an enzyme in the pyrimidine biosynthetic pathway and inhibition of this enzyme by leflunomide triggers a low nucleotide state. Leflunomide effectively ablates the neural crest lineage in embryonic zebrafish, preventing the formation of mature melanocytes, among other neural crest lineages. This drug also effectively suppresses melanoma and is in a clinical trial, administered in combination with the BRAF inhibitor vemurafenib, for metastatic melanoma. Despite knowing that leflunomide targets transcription elongation, the mechanism by which low nucleotides directly regulates transcription is unknown.

Orbital pseudotumor, also known as idiopathic orbital inflammatory disease (IOID), is an idiopathic inflammatory process within the orbit. The potential for permanent visual impairment makes this disease important to diagnose and treat. While oral corticosteroids are the mainstay of therapy, they can have significant toxicity when used for long periods of time. We present a case of IOID that was successfully treated with leflunomide after methotrexate was discontinued for toxicity-related issues. To our knowledge, use of leflunomide for this condition has not previously been reported in the literature.

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Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine multifaktoriell bedingte Autoimmunerkrankung, die durch entzündlichen Gelenksbefall charakterisiert ist. Unter fehlender oder ungenügender therapeutischer Intervention nimmt die Erkrankung einen progressiven Verlauf, der zu Gelenkdestruktionen und damit zu zunehmender Behinderung, sowie Arbeitsunfähigkeit führt. Neben den Einschränkungen in der Gelenkfunktion können in jedem Krankheitsstadium Allgemeinsymptome und vielfältige extraartikuläre Manifestationen auftreten, sodass die Erkrankung mit einer verkürzten Lebenserwartung bzw. erhöhter Mortalität assoziiert ist. Obwohl in den letzten Jahren deutliche Fortschritte in der Therapie erzielt wurden, ist eine definitive Heilung nicht möglich. Gemäß der EULAR-Guidelines von 2019 ist Methotrexat (MTX) weiterhin als „anchor drug“ in der RA das Erstlinienmedikament der Wahl. Bei Therapieversagen von MTX und dem Fehlen von negativen Prognoseparametern kann als Zweitlinientherapie ein anderes konventionelles DMARD (csDMARD) in Monotherapie oder Kombination eingesetzt werden. Eine der Optionen ist Leflunomid (LEF), das in Studien seine Wirksamkeit als DMARD und seine Überlegenheit gegenüber Placebo bewiesen hat. Es ist aber nach wie vor nicht wirklich geklärt, ob Patienten im klinischen Alltag tatsächlich von einer Therapie mit LEF oder LEF/MTX profitieren, insbesondere nach dem Versagen einer Erstlinientherapie mit MTX. Dazu wurde in der vorliegenden Untersuchung der Alltagseinsatz und Nutzen von LEF sowohl in Monotherapie als auch in Kombination mit MTX analysiert. Es handelt sich um eine historisch prospektive Kohortenstudie mit Patienten der Rheumatologischen Ambulanz des Universitätsklinikums Dresden. Es erfolgte die Einteilung der Studienkohorte (n=158) in zwei Untergruppen. In der erweiterten LEF-Kohorte (eLEF) befanden sich alle Patienten, welche zu einem beliebigen Zeitpunkt zwischen 2007 und 2015 mit LEF (n=103) oder mit LEF/MTX (n=49) behandelt worden waren. In der post MTX-Kohorte (pMTX-Gruppe) befanden sich alle Patienten, die nach dem Versagen einer Erstlinientherapie mit MTX zwischen 2007 und 2015 mit LEF (n=39) oder LEF/MTX (n=16) als Zweitlinientherapie behandelt worden waren. Es wurde das Therapieüberleben mittels Kaplan-Meier-Kurven, sowie der klinische Verlauf im ersten Jahr mittels Scoresystemen (CDAI) erfasst. Zudem wurden Nebenwirkungen, Absetzgründe und radiographischer Progress analysiert. Sowohl in der eLEF-Gruppe als auch in der pMTX-Gruppe lag ein signifikant schlechteres Gesamttherapieüberleben in Kombinationstherapie von LEF/MTX im Vergleich zur Monotherapie mit LEF vor (eLEF p=0,004; pMTX p=0,002; Signifikanzniveau p=0,05). Im klinischen Verlauf zeigten sich keine signifikanten Unterschiede, lediglich der Startscorewert der Kombinationstherapie war signifikant höher als unter Monotherapie. Beide Therapieregime konnten eine durchschnittliche Verbesserung von moderater zu niedriger Krankheitsaktivität, aber nicht bis in Remission erreichen. Insgesamt lag eine hohe Abbrecherzahl innerhalb des ersten Behandlungsjahres unabhängig vom Therapieregime vor. Der wichtigste Absetzgrund war (außer in der pMTX-Gruppe unter LEF/MTX) Wirkversagen, von dem etwa jeder zweite Patient betroffen war. Der andere wesentliche Absetzgrund waren Nebenwirkungen, hier war etwa jeder vierte bis fünfte Patient betroffen. Zudem traten unter Kombinationstherapie mehr Nebenwirkungen als unter Monotherapie auf. Radiographischer Progress spielte in der vorliegenden Kohorte keine relevante Rolle. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie Hinweise, dass die Kombinationstherapie der Monotherapie nicht überlegen ist. Daher wäre durchaus vertretbar, bei einem Therapiewechsel primär eine Monotherapie anzustreben, was sich unter Berücksichtigung des langjährigen Therapiebedarfs und des höheren Patientenalters positiv auf Interaktionen mit anderen Medikamenten, auf Nebenwirkungen und auf die Compliance der Patienten auswirken könnte. Zugleich könnten Kosten gespart werden. Aufgrund des längerfristig nicht überzeugenden Verlaufes, sollte ein Wechsel auf ein zweites csDMARD (oder die Etablierung einer Kombinationstherapie) nach Versagen von MTX entsprechend der Leitlinien der EULAR nur bei Fehlen negativer Prognosefaktoren und in höherem Lebensalter, sowie mit einem engmaschigen Therapiemonitoring (klinisch, laborchemisch, radiologisch) erfolgen. Dennoch ist bei weltweitem Auftreten der Erkrankung die Medikation mit LEF weiterhin eine preisgünstigere Alternative für die Länder, wo zusätzliche Ressourcen knapp sind.:Inhaltsverzeichnis V Abbildungen VIII Tabellen X Glossar XII Akürzungsverzeichnis XIX 1 Einleitung und Fragestellung 1 2 Die Rheumatoide Arthritis (RA) 3 2.1 Epidemiologie 3 2.2 Ätiologie 4 2.2.1 Genetische Veränderungen 4 2.2.2 Epigenetische Veränderungen 5 2.2.3 Nicht genetische Faktoren/Umwelt 5 2.3 Pathophysiologie/Pathogenese 8 2.3.1 Synovium 8 2.3.2 Weitere Antikörper 12 2.3.3 Krankheitsverlauf 12 2.4 Klinisches Bild 14 2.4.1 Gelenkbefall 14 2.4.2 Differentialdiagnosen 16 2.4.3 Extraartikuläre Manifestationen 19 2.4.4 Sonderformen 23 2.5 Diagnostik 23 2.5.1 Labor 24 2.5.2 Bildgebung 25 2.6 Therapie 27 2.6.1 Medikamentöse Basistherapie 27 2.6.2 Weitere Aspekte zum Einsatz von bDMARDs/ tsDMARDs 32 2.6.3 Einschätzung der Krankheitsaktivität 33 2.6.4 Ko-Medikation und begleitende nichtmedikamentöse Therapien 36 2.7 Prognose 37 2.7.1 Komorbiditäten 39 2.7.2 Mortalität 40 3 Leflunomid (LEF) 42 3.1 Wirkmechanismus 42 3.2 Pharmakologische Aspekte 43 3.3 Arzneimittelinteraktionen 44 3.4 Wirksamkeit 45 3.4.1 Klinisch 45 3.4.2 Radiologischer Progress 46 3.4.3 Kombinationstherapien 47 3.5 Nebenwirkungen 48 3.5.1 Spezielle Nebenwirkungen 49 3.6 Praktische Anwendung 55 3.7 Kontraindikationen 56 4 Studienergebnisse 58 4.1 Material und Methoden 58 4.2 Patientenpool und Vergleichsgruppen 59 4.2.1 Weitere Subgruppen 64 4.2.2 Patientencharakteristika 66 4.2.3 Nachverfolgung 67 4.3 Therapieüberleben 68 4.3.1 Ergebnisübersicht: Therapie- und Patientengruppen 68 4.3.2 Ergebnisübersicht möglicher Einflussfaktoren 69 4.4 Therapieverlauf im ersten Jahr 78 4.4.1 Ergebnisübersicht CDAI 78 4.4.2 Ergebnisübersicht SDAI 80 4.4.3 Ergebnisübersicht DAS28 81 4.4.4 Entzündungsparameter 83 4.4.5 Therapiewirksamkeit und Therapieabbruch 87 4.4.6 Vorliegen von Prognosefaktoren 89 4.5 Nebenwirkungen 93 4.5.1 Ergebnisübersicht eLEF-Gruppe 93 4.5.2 Ergebnisübersicht pMTX 96 4.6 Absetzgründe 100 4.6.1 Ergebnisübersicht 100 4.7 Röntgenprogress 103 4.7.1 Ergebnisübersicht 103 5 Interpretation und Diskussion 105 5.1 Therapieüberleben 105 5.2 Therapieverlauf im ersten Jahr 108 5.3 Nebenwirkungen 111 5.4 Therapievergleiche 113 5.5 Röntgenprogress 115 6 Schlussfolgerung 117 7 Anhang 120 7.1 Zusäzliche Abbildungen zu Kapitel 2 120 7.2 Zusäzliche Analysen zu Kapitel 4 122 7.2.1 LEF-Erstlinie 122 7.2.2 Therapieüberleben: Zusätzliche Vergleiche in Abhängigkeit der Therapie 123 7.2.3 Therapieüberleben in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Kombinationstherapie 126 7.2.4 Therapieverlauf im ersten Jahr: Statistische Tests 128 7.2.5 Zusammenhang zwischen CRP bzw. BSG und CDAI für pMTX 133 7.2.6 Nebenwirkungen in Abhängigkeit vom Serostatus 134 7.2.7 pMTX-LM-L-Gruppe 135 7.3 Zusäzliche Analysen zu Kapitel 5 136 7.3.1 LEF und Prednisolon 136 8 Literaturverzeichnis 139 / Rheumatoid arthritis (RA) is a multifactorial autoimmune disease characterized by inflammatory joint involvement. In the absence or inadequacy of therapeutic intervention, the disease takes a progressive course, leading to joint destruction, increasing disability, and incapacity to work. In addition to limitations in joint function, general symptoms and multiple extra-articular manifestations may occur at any stage of the disease, so that the disease is associated with a shortened life expectancy and increased mortality. Although significant advances in therapy have been made in recent years, a definitive cure is not possible. According to the 2019 EULAR guidelines, Methotrexate (MTX) remains the first-line drug of choice as the 'anchor drug' in RA. In case of treatment failure of MTX and the absence of poor prognostic factors, another conventional DMARD (csDMARD) can be used as second-line therapy in monotherapy or combination. One of the options is Leflunomide (LEF), which has demonstrated its efficacy as a DMARD and its superiority to placebo in trials. However, it is still not really clear whether patients actually benefit from therapy with LEF or LEF/MTX in daily clinical practice, especially after failure of first-line therapy with MTX. To this end, the present study analyzed the everyday use and benefit of LEF both in monotherapy and in combination with MTX. It is a historical prospective cohort study with patients of the Rheumatologic Outpatient Clinic of the University Hospital of Dresden. The study cohort (n=158) was divided into two subgroups. The extended LEF cohort (eLEF) included all patients who had been treated with LEF (n=103) or with LEF/MTX (n=49) at any time between 2007 and 2015. The post MTX cohort (pMTX group) included all patients who had been treated with LEF (n=39) or LEF/MTX (n=16) as second-line therapy after failure of first-line MTX between 2007 and 2015. Treatment survival was assessed using Kaplan-Meier curves, and clinical outcome in the first year was assessed using scoring systems (CDAI). In addition, side effects, discontinuation reasons, and radiographic progression were analyzed. In both the eLEF group and the pMTX group, there was a significantly worse overall therapy survival in combination therapy of LEF/MTX compared to monotherapy with LEF (eLEF p=0.004; pMTX p=0.002; significance level p=0.05). There were no significant differences in the clinical course, only the start score of the combination therapy was significantly higher than under monotherapy. Both therapy regimens were able to achieve an average improvement from moderate to low disease activity, but not to remission. Overall, a high dropout rate was present within the first year of treatment regardless of the therapy regimen. The main discontinuation reason (except in the pMTX group on LEF/MTX) was efficacy failure, affecting approximately one in two patients. The other major reason for discontinuation was side effects, affecting approximately one in four to five patients. In addition, more side effects occurred with combination therapy than with monotherapy. Radiographic progression did not play a relevant role in the present cohort. In summary, the present study shows some evidence that combination therapy is not superior to monotherapy. Therefore, it would be quite justifiable to aim primarily for monotherapy when changing therapy, which could have a positive effect on interactions with other drugs, on side effects, and on patient compliance, taking into account the long-term need for therapy and the higher patient age. At the same time, costs could be saved. Due to the unconvincing course in the longer term, a switch to a second csDMARD (or the establishment of a combination therapy) after failure of MTX should, according to the EULAR guidelines, only be made in the absence of poor prognostic factors and at an higher age, as well as with close-meshed therapy monitoring (clinical, laboratory, radiological). Nevertheless, with worldwide occurrence of the disease, medication with LEF continues to be a less expensive alternative for countries where additional resources are scarce.:Inhaltsverzeichnis V Abbildungen VIII Tabellen X Glossar XII Akürzungsverzeichnis XIX 1 Einleitung und Fragestellung 1 2 Die Rheumatoide Arthritis (RA) 3 2.1 Epidemiologie 3 2.2 Ätiologie 4 2.2.1 Genetische Veränderungen 4 2.2.2 Epigenetische Veränderungen 5 2.2.3 Nicht genetische Faktoren/Umwelt 5 2.3 Pathophysiologie/Pathogenese 8 2.3.1 Synovium 8 2.3.2 Weitere Antikörper 12 2.3.3 Krankheitsverlauf 12 2.4 Klinisches Bild 14 2.4.1 Gelenkbefall 14 2.4.2 Differentialdiagnosen 16 2.4.3 Extraartikuläre Manifestationen 19 2.4.4 Sonderformen 23 2.5 Diagnostik 23 2.5.1 Labor 24 2.5.2 Bildgebung 25 2.6 Therapie 27 2.6.1 Medikamentöse Basistherapie 27 2.6.2 Weitere Aspekte zum Einsatz von bDMARDs/ tsDMARDs 32 2.6.3 Einschätzung der Krankheitsaktivität 33 2.6.4 Ko-Medikation und begleitende nichtmedikamentöse Therapien 36 2.7 Prognose 37 2.7.1 Komorbiditäten 39 2.7.2 Mortalität 40 3 Leflunomid (LEF) 42 3.1 Wirkmechanismus 42 3.2 Pharmakologische Aspekte 43 3.3 Arzneimittelinteraktionen 44 3.4 Wirksamkeit 45 3.4.1 Klinisch 45 3.4.2 Radiologischer Progress 46 3.4.3 Kombinationstherapien 47 3.5 Nebenwirkungen 48 3.5.1 Spezielle Nebenwirkungen 49 3.6 Praktische Anwendung 55 3.7 Kontraindikationen 56 4 Studienergebnisse 58 4.1 Material und Methoden 58 4.2 Patientenpool und Vergleichsgruppen 59 4.2.1 Weitere Subgruppen 64 4.2.2 Patientencharakteristika 66 4.2.3 Nachverfolgung 67 4.3 Therapieüberleben 68 4.3.1 Ergebnisübersicht: Therapie- und Patientengruppen 68 4.3.2 Ergebnisübersicht möglicher Einflussfaktoren 69 4.4 Therapieverlauf im ersten Jahr 78 4.4.1 Ergebnisübersicht CDAI 78 4.4.2 Ergebnisübersicht SDAI 80 4.4.3 Ergebnisübersicht DAS28 81 4.4.4 Entzündungsparameter 83 4.4.5 Therapiewirksamkeit und Therapieabbruch 87 4.4.6 Vorliegen von Prognosefaktoren 89 4.5 Nebenwirkungen 93 4.5.1 Ergebnisübersicht eLEF-Gruppe 93 4.5.2 Ergebnisübersicht pMTX 96 4.6 Absetzgründe 100 4.6.1 Ergebnisübersicht 100 4.7 Röntgenprogress 103 4.7.1 Ergebnisübersicht 103 5 Interpretation und Diskussion 105 5.1 Therapieüberleben 105 5.2 Therapieverlauf im ersten Jahr 108 5.3 Nebenwirkungen 111 5.4 Therapievergleiche 113 5.5 Röntgenprogress 115 6 Schlussfolgerung 117 7 Anhang 120 7.1 Zusäzliche Abbildungen zu Kapitel 2 120 7.2 Zusäzliche Analysen zu Kapitel 4 122 7.2.1 LEF-Erstlinie 122 7.2.2 Therapieüberleben: Zusätzliche Vergleiche in Abhängigkeit der Therapie 123 7.2.3 Therapieüberleben in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Kombinationstherapie 126 7.2.4 Therapieverlauf im ersten Jahr: Statistische Tests 128 7.2.5 Zusammenhang zwischen CRP bzw. BSG und CDAI für pMTX 133 7.2.6 Nebenwirkungen in Abhängigkeit vom Serostatus 134 7.2.7 pMTX-LM-L-Gruppe 135 7.3 Zusäzliche Analysen zu Kapitel 5 136 7.3.1 LEF und Prednisolon 136 8 Literaturverzeichnis 139

Leflunomide is widely prescribed for Rheumatoid Arthritis (RA) patients in China. However, a number of RA patients still demonstrated progressive bone erosion (PBE+) after receiving Leflunomide in our clinical data. Moreover, the PBE+ is predicted by high baseline serum CRP level (CRPBH). Further, the changes of serum bone resorption marker (Tartrate-resistant acid phosphatase 5b, TRAP5b) strongly correlated with those of CRP in PBE+ RA patients during Leflunomide treatment. Those were consistently observed in collagen-induced-arthritis (CIA) rats. To precisely address the issue, we screened a series of marketed drugs combined with Leflunomide to inhibit CRP production and CRP-related osteoclastic signaling pathway using bioinformatics analysis. Ligustrazine was postulated as an optimal candidate drug. In vitro studies demonstrated that the combination of Ligustrazine and Leflunomide not only suppressed hepatic CRP production, but also suppressed CRP-related osteoclastic signaling and osteoclast activities. In vivo studies showed that the combination attenuated bone erosion in CIA rats. Further, the randomized parallel controlled clinical trial in 120 CRPBH RA patients showed that the combination therapy reduced serum CRP levels and attenuated bone erosion in those patients (ChiCTR-TRC-10001014). Together, this work presents a precision combination therapy for PBE+ in CRPBH RA patients.

Made available in DSpace on 2016-06-23T12:15:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 13.pdf: 3290087 bytes, checksum: c2534f744ed7289fbdbed582eaabac44 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Made available in DSpace on 2016-07-05T22:38:02Z (GMT). No. of bitstreams: 3 13.pdf.txt: 358391 bytes, checksum: 4a43403217e6829dc1ae5000589499cf (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 13.pdf: 3290087 bytes, checksum: c2534f744ed7289fbdbed582eaabac44 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Fármacos/Farmanguinhos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A leflunomida (LF) é um pró-fármaco antireumático pertencente ao grupo de fármacos modificadores do curso da doença, sendo empregada no tratamento da artrite reumatóide. Encontram-se disponíveis no mercado e medicamentos referência ARAVA produzido pela empresa Sanofi Aventis e as versões genéricas fabricadas pelas indústrias farmacêuticas Aché, Biosintética, Cristália, Marinha do Brasil e Zodiac. Para registro de um produto farmacêutico no Brasil, deve-se seguir as exigências da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, que requer, dentre vários documentos, o estudo de estabilidade do medicamento e questão. Este estudo deve incluir diversos testes, sendo que a determinação do teor do fármaco e suas substâncias relacionadas são fundamentais para se compreender e determinar o prazo de validade de um produto. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analítica de teor e substâncias que permitisse avaliar a estabilidade dos comprimidos de L.F. Foram realizados estudos de degradação forçada no insumo farmacêutico ativo e no protótipo de comprimidos de L.F. proposto pela Fundação Ezequiel Dias (FUNED), empregando a hidrólise ácida, hidrólise alcalina, oxidação, degradação térmica e fotolítica. As amostras degradadas deram subsídio para o desenvolvimento e validação de um método, por cromatografia a líquido de alta eficiência, para determinação do teor e suas substâncias relacionadas. Uma coluna C18 (125x4,0mm, 5µm, a 25° graus Celcius), uma fase móvel em eluição, gradiente de acetato de amônio 10mM:acetonitrila (0 min-70:30; 15min-20:80; 16min-70:30 e 20 min-70:30) e um detector no ultravioleta (261nm) foram empregados para se atingir uma resolução adequada na separação da L.F. e suas substâncias relacionadas. Foram realizados os testes de degradação forçada, sendo que a hidrólise básica gerou apenas um produto de degradação (r=0,33), enquanto a ácida proporcionou o surgimento de dois(r=0,33 e 0,77); onze substâncias surgiram após a oxidação (r=0,16; 0,21; 0,41; 0,48; 0,58; 0,64; 0,67; 0,73; 0,78; 0,82 e 0,86). O método em eluição gradiente foi então validado de acordo com as diretrizes da RE n° 899 de 05/2003 da ANVISA e do DOQ-CGCRE-008 do INMETRO. A linearidade, na faixa de 10-60 µg/mL, foi demonstrada utilizando ANOVA (Fcalculado < Fcrítico). Comprovou-se as precisões intra-corrida (DPR≤3,3%) e intra-corrida (DPR≤5,0%) nas concentrações de 20; 40 e 60 µg/mL aplicando ANOVA. A exatidão variou de 98, 30% a 102,36% e a robustez foi satisfatória em todas as condições avaliadas. Aestabilidade dos comprimidos de LF, nas embalagens blíster de cloreto de polivinilideno e frasco de polietileno, foi então avaliada utilizando o método validado, sendo que em ambas foram quantificados os produtos da hidrólise alcalina (r=0,33) e da hidrólise ácida (r=0,77). Os resultados do estudo de estabilidade da formulação foram insatisfatórios para a LF devido à queda no seu teor superior a 5% no estudo acelerado e de longa duração em ambas embalagens. Pode-se concluir que o método indicativo de estabilidade foi desenvolvido e validado com sucesso para a quantificação do teor e substâncias relacionadas. Portanto, este método pode ser empregado na indústria farmacêutica tanto para o controle de qualidade quanto para avaliação dos estudos de estabilidade de comprimidos de LF. / Leflunomide (LF) is a prodrug of the disease-modifying antirheumatic drug (DMARD) used in rheumatoid arthritis. It is commercially available in tablet presentations of 10, 20 and 100 mg. The reference drug ARAVA reference manufactured by Sanofi Aventis and generic versions manufactured by pharmaceutical companies Aché, Biosintética, Cristália, Brazil's Navy and Zodiac are available in the market. For registration of a pharmaceutical product in Brazil it must follow the requirements of Agência Nacional de Vigilância Sanitária, which demands, among many documents, the stability study of the product concerned. This study should include several tests, and the determination of drug content and its related substances are fundamental to determine the shelf life of a product. The aim of this study was to develop and validate an assay and related substances analytical methodology that allow to evaluating the stability of the LF tablets. Forced degradation were perfomed on active pharmaceutical ingredient and LF tablets prototype proposed by FUNED, employing acid hydrolysis, alkaline hydrolysis, oxidation, photolytic and thermal degradation. The degraded samples allowed the development and validation of a liquid chromatography high efficiency method to determine the drug and its related substances. A C18 column (125x4,0mm, 5μm, 25 ° Celcius), a gradiente mobile phase of 10mM ammonium acetate: acetonitrile (0 min-70: 30; 15 min, 20: 80; 16min-70: 30 and 20 min-70: 30), and a ultraviolet detector (261nm) were used to achieve adequate resolution in the separation of LF and its related substances. Forced degradation test waere performed, which generated only one basic hydrolysis degradation product (r = 0.33), while the acidic gave the rise of two (r = 0.33 and 0.77); eleven substances arose after oxidation (r = 0.16; 0.21; 0.41; 0.48; 0.58; 0.64; 0.67; 0.73; 0.78; 0.82 and 0 , 86). The gradient method was then validated accordance to ANVISA RE No. 899 05/2003 and INMETRO DOQ-CGCRE-008 guidelines. The linearity in the range of 10-60 mg / mL was demonstrated using ANOVA (Fcalculado <Fcrítico). Intra-run precisions (DPR≤3,3%) and intra-run (DPR≤5,0%) at concentrations of 20; 40 and 60 ug / ml were satisfatory by applying ANOVA. The accuracy ranged from 98, 30% to 102.36% and robustness was satisfactory in all conditions evaluated. The stability of LF tablets polyvinylidene chloride blister and polyethylene vial packaging was then assessed using the validated method. Degradation products were found from alkaline hydrolysis (r = 0.33) and acidic hydrolysis (r = 0.77). The stability results of the formulation were unsatisfactory for LF due to its content drop exceeding 5% in both packages on accelerated and long term studies. It can be concluded that stability indicating method has been successfully developed and validated for assay and related substances measurement. Therefore, this method can be used for both quality control and stability studies evaluation of LF tablets in the pharmaceutical industry.

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune caractérisée par une fibrose cutanée et viscérale ainsi que par des anomalies microcirculatoires. Son origine multifactorielle et ses manifestations cliniques variées en font une maladie à la physiopathologie complexe. Cette maladie rare demeure une affection dont l’étiologie est encore inconnue et pour laquelle il n’existe aucun traitement curatif. Notre laboratoire a mis en évidence le rôle des formes réactives de l’oxygène en mettant au point un modèle animal induit par l’acide hypochloreux. Ce modèle nous a permis d’explorer différentes voies de signalisation intracellulaire, impliquées dans la formation de FRO, favorisant la fibrose. Dans ce travail, nous avons choisi d’explorer dans la sclérodermie systémique différentes voies de signalisation impliquées dans l’inflammation à l’aide d’un modèle de réaction du greffon contre l’hôte sclérodermiforme (GVH-Scl) et d’un modèle de sclérodermie induit par les formes réactives de l’oxygène. De plus, nous avons étudié l’impact de molécules ciblant ces voies afin de fournir de nouvelles données permettent d’enrichir l’arsenal thérapeutique de cette maladie, actuellement pauvre. Les souris obtenues à partir du premier modèle présentent une fibrose cutanée et pulmonaire, une alopécie, une diarrhée et une inflammation hépatique. Une quantité importante d’auto-anticorps ainsi qu’une activation du système immunitaire sont retrouvées. Nous avons observés une activation de la voie de l’EGFR, de STAT3, de Wnt/β-caténine, d’AKT, d’ERK1/2 et de Notch dans la GVH-Scl. L’inhibition de la voie de l’EGFR par l’erlotinib a montré une amélioration clinique associée à une réduction de la fibrose cutanée et de l’inflammation cutanée et hépatique. De plus, l’erlotinib agit sur le système immunitaire et restaure la proportion de LT CD4+ naïfs chez les souris malades ainsi que le taux d’auto-anticorps anti-topoisomérase 1. La co-inhibition des voies de signalisation STAT3, Wnt/β-caténine, AKT, ERK1/2 et Notch par le niclosamide améliore les symptômes de la GVH-Scl chez la souris. Nous avons noté une diminution de la fibrose cutanée et pulmonaire, une diminution de l’inflammation cutanée, hépatique et gastro-intestinale et une diminution de la production d’auto-anticorps. La proportion de cellules naïves parmi les LT CD4+ et CD8+ est plus élevée chez les souris malades traitées que chez les malades non traitées. Les souris du second modèle présentent une fibrose cutanée et pulmonaire et une activation du système immunitaire accompagnée d’une production d’autoanticorps anti-topoisomérase. Nous avons retrouvé une activation des voies de signalisation de STAT3, de Wnt/β-caténine et d’AKT chez les souris sclérodermiques. Nous avons également observés une activation de la voie de signalisation de STAT6 et une surexpression de KLF4 chez ces souris malades. La co-inhibition des voies de signalisation STAT3, Wnt/β-caténine et AKT par le niclosamide améliore la fibrose cutanée et pulmonaire chez les souris sclérodermiques. Cette molécule diminue le nombre et l’activation des LB et des LT CD4+ et CD8+ ainsi que la production des auto-anticorps chez les souris malades. Le traitement de souris sclérodermique par le léflunomide, inhibiteur de STAT6, a aussi montré une amélioration de la fibrose cutanée et pulmonaire et des anomalies immunitaires présentées par les souris sclérodermiques. De plus l’inhibition de STAT6 et de KLF4 par le léflunomide inhibe la polarisation des macrophages en macrophages M2. Ainsi nous avons mis en évidence le rôle des voies de signalisation de l’EGFR, de STAT3, de Wnt/β-caténine, d’AKT, de STAT6 et de KLF4 dans la physiopathologie de la sclérodermie systémique. (...) / Systemic sclerosis (SSc) is a connective tissue disorder that results in skin and inner organs fibrosis, microvascular injuries and auto-immunity. This rare disease has a complex physiopathology which is due to its multifactorial origin and its various clinical manifestations. Its etiology remains unknown and no curative treatment exists at present. Our team highlighted the role of reactive oxygen species (ROS) by developing a hypochlorous acid (HOCl)-induced mouse model of SSc. This model allowed the exploration of several intracellular signalizing pathways which were involved in ROS production and promote fibrosis. In this work, we choose to investigate inflammatory signalizing pathways in SSc with a sclerodermatous graft versus host disease (Scl-GVHD) mouse model and a ROS-induced mouse model. Moreover, we studied the effects of drugs targeting these pathways in order to reinforce data providing new therapeutics. Mice from Scl-GVHD model developed a diffuse cutaneous SSc with pulmonary fibrosis, alopecia, diarrhea and liver inflammation. Production of anti-DNA topoisomerase 1 auto-antibodies and immunological activation was also found. We observed an activation of EGFR, STAT3, Wnt/β-catenin, AKT, ERK1/2 and Notch signaling pathways in Scl-GVHD. Inhibition of EGFR by Erlotinib showed clinical amelioration with a decreased skin fibrosis and decreased skin and liver inflammation. Moreover, Erlotinib decreased production of activated/memory CD4+ T cells and of auto-antibody anti-topoisomerase1. Co-inhibition of STAT3, Wnt/β-catenin, AKT, ERK1/2 and Notch pathways by Niclosamide reversed clinical symptoms of Scl-GVHD in mice. We observed an improvement of skin and lung fibrosis, of cutaneous, hepatic and intestinal inflammation, and a reduced production of auto-antibodies. The ratio of CD4 and CD8 naive T cells was higher in Niclosamide-treated GVHD mice than in untreated GVHD mice. Mice from HOCl-model present skin and lung fibrosis and an immune activation along with the production of auto-antibodies anti-topoisomerase. We found an activation of STAT3, Wnt/β-catenin and AKT signaling pathways in HOCl-mice. We also observed an activation of STAT6 signaling pathway and an overexpression of KLF4 in these sicked mice. Co-inhibition of STAT3, Wnt/β-catenin and AKT pathways by Niclosamide improves skin and lung fibrosis in HOCl-mice. This drug decreased number and activation of B cells and CD4+ and CD8+ T cells and auto-antibodies production in mice. Treatment of HOCl-mice with Leflunomide, STAT6 inhibitor, also showed an improvement of skin and lung fibrosis and of immunological abnormalities in HOCl-mice. Moreover, inhibition of STAT6 and KLF4 by Leflunomide inhibits M2 polarization of macrophages. Thus, we highlighted the role of EGFR, STAT3, Wnt/β-catenin, AKT, STAT6 and KLF4 signaling pathways in physiopathology of SSc. Use of inhibitors of these pathways such as Etrlotinib, Niclosamide and Leflunomide, indicate a clinical and biological efficacity in mouse. These drugs allow the control of the 3 characteristic features of SSc reproduced in these animal models: fibrosis, inflammation and autoimmunity and could thus be effective in fighting the development of clinical-biological abnormalities of SSc.