Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-05-02T23:09:42Z No. of bitstreams: 1 VitorTroccoliRibeiro_DISSERT.pdf: 3222596 bytes, checksum: 3c00f5a502043e131a9b815409cc4fc9 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-05-07T23:08:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 VitorTroccoliRibeiro_DISSERT.pdf: 3222596 bytes, checksum: 3c00f5a502043e131a9b815409cc4fc9 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-07T23:08:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VitorTroccoliRibeiro_DISSERT.pdf: 3222596 bytes, checksum: 3c00f5a502043e131a9b815409cc4fc9 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / A leishmaniose visceral é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania, podendo ser letal quando não há tratamento adequado. Estima-se que existem 12 milhões de pessoas infectadas pela doença, mas infelizmente não há nenhuma vacina capaz de prevenir a doença. Ademais, o tratamento da doença apresenta alto custo e elevada toxicidade. Diante disso, deve-se destacar a pesquisa de componentes antigênicos purificados que possam ser utilizados como ferramenta para obtenção de vacinas ou testes para diagnóstico específico. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar a influência da concentração de IPTG durante a indução e a influência da temperatura de cultivo na expressão do antígeno 503 e na estabilidade do plasmídeo pQE-30 em Escherichia coli. Todos os ensaios foram realizados em incubador rotativo e feitos em duplicata. Primeiramente foram realizados cultivos induzidos com IPTG nas concentrações de: 0,01 mM; 0,1 mM; 0,5 mM; 1,0 mM e 1,5 mM na temperatura de 37 °C. A concentração de indutor não afetou a estabilidade do plasmídeo e quando induzido com 1,0 mM, a expressão de antígeno 503 máxima foi de 0,101 ± 0,004 g/L. Foi possível verificar que a menor concentração de IPTG utilizada foi o suficiente para conseguir a expressão da proteína recombinante. Em seguida, a concentração de IPTG foi fixada em 1,0 mM e avaliadas as temperaturas de cultivo de 27, 32 e 42 °C. Estes ensaios foram comparados com o ensaio realizado anterior a 37 °C. A temperatura influenciou a estabilidade do plasmídeo, sendo que quanto menor a temperatura de cultivo, maior estabilidade. De acordo com os resultados, foi possível verificar que a temperatura de 37 °C obteve maior expressão do antígeno 503, sendo considerada portanto, as condições ótimas para produção de antígeno 503 em incubador rotativo. / Visceral leishmaniasis is an infectious-parasitic disease caused by protozoa of the genus Leishmania, which can be lethal when there is no adequate treatment. It is estimated that there are 12 million people infected by the disease, but unfortunately there is no vaccine capable of preventing the disease. In addition, the treatment of the disease presents high cost and high toxicity. Therefore, we must highlight the research of purified antigenic components that can be used as a tool to obtain vaccines or tests for specific diagnosis. In this context, the present work aims to evaluate the influence of the concentration of IPTG during the induction and the influence of culture temperature on 503 antigen expression and on the stability of plasmid pQE-30 in Escherichia coli. All assays were performed in a rotary incubator and made in duplicate. First, IPTG induced cultures were carried out at concentrations of: 0.01 mM; 0.1 mM; 0.5 mM; 1.0 mM and 1.5 mM at 37 °C. The concentration of the inducer did not affect the stability of the plasmid and when induced with 1.0 mM, the 503 antigen expression was maximal 0.101 ± 0.004 g / L. It was possible to verify that the lowest concentration of IPTG used was enough to achieve expression of the recombinant protein. Thereafter, the concentration of IPTG was fixed at 1.0 mM and the cultivation temperatures of 27, 32 and 42 °C were evaluated. These assays were compared with the previous assay performed at 37 °C. Temperature influenced the stability of the plasmid, and the lower the culture temperature, the greater the stability. According to the results, the temperature of 37 °C obtained the highest expression of 503 antigen, being considered therefore, the optimal conditions for 503 antigen production in a rotary incubator.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T16:16:48Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertação-LarissaNascimento.pdf: 5009861 bytes, checksum: e41e4e6a4cc83034688c263b000766c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T16:16:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertação-LarissaNascimento.pdf: 5009861 bytes, checksum: e41e4e6a4cc83034688c263b000766c1 (MD5) Previous issue date: 2012-03-13 / O gênero Leishmania compreende 30 espécies de protozoários flagelados pertencentes a famíla Trypanosomatidae, donde 20 são patogênicas ao homem. Esses organismos apresentam ciclos de vida complexos e peculiaridades moleculares frente à maioria dos eucariontes, como a ausência de regulação transcricional. Desse modo, a regulação da expressão gênica nesses parasitas é efetuada em etapas pós-transcricionais, dentre essas a mais importante é o processo de iniciação da tradução dos mRNAs, onde diferentes fatores denominados eIFs (eukariotic initiation factors) estão envolvidos. Dentre esses fatores se destaca o complexo eIF4F com função de promover o reconhecimento e ligação de RNAs maduros aos ribossomos. Tal complexo é composto de três sub-unidades: eIF4A (RNA helicase); eIF4E (proteína de ligação ao cap); e eIF4G (proteína multidomínio estruturadora do complexo eIF4F). Em tripanossomatídeos se sabe da existência de cinco homólogos da sub-unidade eIF4G distintos (EIF4G1 ao G5), contudo, pouco se sabe sobre a ocorrência e funções celulares desses homólogos. Portanto o objetio do presente trabalho foi avaliar a expressão dos diferentes homólogos do eIF4G durante o ciclo de vida de Leishmania amazonensis, caracterizando as possíveis modificações pós-traducionais por fosforilação que possam estar agindo sobre tais fatores, uma vez que em eucariotos superiores mecanismos de regulação global da tradução por fosforilação dos eIFs via MAP quinases já são conhecidos. Para tal, foram realizadas culturas de L. amazonensis nas formas promastigota e amastigota-axênicas, e os extratos protéicos provenientes de diferentes fases do crescimento foram analisados através de Western blot. Foi observado que os homólogos de eIF4G estão presentes durante todo o ciclo de vida de L. amazonensis. Podendo ser observado que os EIF4G1, G4 e G5 apresentaram mais de uma isoforma proteica sugestiva de possíveis modificações pós-traducionais desses homólogos. Em conseguinte, a expressão de EIF4G3 e EIF4G4 foi analisada em condições especiais de cultivo na presença de seis inibidores diferentes, contudo nenhuma dessas condições alterou a expressão desses fatores, revelando que essas proteínas são bastante estáveis e possuem tempo de meia-vida prolongado. Posteriormente, o mapeamento in silico de sítios de fosforilação por MAP quinases nos EIF4Gs de Leishmania spp. demonstra a existência de sítios de fosforilação específicos em todos os homólogos E a purificação de fosfoproteínas confirma a existência de mecanismos de fosforilação agindo nos EIF4G3 e EIF4G4. Esses resultados auxiliam no esclarecimento dos mecanismos moleculares, até então obscuros, envolvidos na regulação da expressão gênica pós-transcricional característica desses organismos. / The genus Leishmania comprises 30 species of flagellated protozoa from the family Tripanosomatidae, of which 20 are pathogenic to humans. These organisms have complex life cycles and molecular particularities not observed in most eukaryotes, like absence of transcriptional regulation. Thus, the regulation of gene expression occurs in post-transcriptional steps, with the initiation of mRNA translation representing the most important event. Different factors called eIFs (eukariotic initiation factors) are involved, with emphasis in eIF4Fcomplex, which promotes mRNA recognition and its ribosome interaction. This eIF4F complex consists of three subunits: eIF4A (RNA helicase), eIF4E (cap binding protein) and eIF4G (scaffold protein, for eIF4F complex maintenance). In trypanosomatids, five eIF4G homologous (EIF4G1 to G5) was described, however, little is known about the specific cellular functions of these homologous. In this manner, we evaluated the expression and characterized post-translational modifications of the eIF4G homologous during the Leishmania amazonensis life cycle, especially phosphorylation, considering the translational regulation by phosphorylation of eIF ́s via MAP kinases observed in higher eukaryote. For this reason, cultures were performed with the L. amazonensis promastigote and amastigote axenic forms, and the protein extract, collected from different growth phases, were analyzed by Western blotting. These results demonstrated the detection of all eIF4G homologues during the life cycle of L. amazonensis, while more than one protein isoform were observed for the EIF4G1, G4 and G5 homologues, suggesting possible post-translational modifications. Posteriorly, the EIF4G3 and EIF4G4 gene expression were investigated under differential growth conditions using six distinct inhibitors, however no change was observed in the expression pattern, which suggests that these proteins are quite stable and have long half-life extending. Finally, In silico analysis shows specifics MAP kinase-dependent phosphorylation sites presents in all eIFG homologues and further analysis with EIF4G3 and EIF4G4 confirmed the existence of phosphorylation mechanisms acting on these factors.These present data help to clarify the molecular mechanisms involved in post-transcriptional regulation of gene expression characteristic of these organisms.