Submitted by Éder Freyre (ederfreyre@icict.fiocruz.br) on 2013-12-09T16:58:26Z No. of bitstreams: 1 Doutorado_Joao_Sores_Moreira.pdf: 1252428 bytes, checksum: d2d5a3f0a0354c9fe3d2c250c315377d (MD5) / Submitted by Éder Freyre (ederfreyre@icict.fiocruz.br) on 2013-12-09T17:10:36Z No. of bitstreams: 1 Doutorado_Joao_Sores_Moreira.pdf: 1252428 bytes, checksum: d2d5a3f0a0354c9fe3d2c250c315377d (MD5) / Approved for entry into archive by Paulo Marques(pmarques@fiocruz.br) on 2013-12-09T17:11:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Doutorado_Joao_Sores_Moreira.pdf: 1252428 bytes, checksum: d2d5a3f0a0354c9fe3d2c250c315377d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-09T17:12:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Doutorado_Joao_Sores_Moreira.pdf: 1252428 bytes, checksum: d2d5a3f0a0354c9fe3d2c250c315377d (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os antimoniais pentavalentesem doses de 10 a 20mg Sb 5+ /kg/dia continuam sendo o tratamento de escolha para a leishmaniose tegumentar americana (LTA), apesar dos relatos de baixa efetividade e de elevado número de efeitos adversos, inclusive óbito. Este estudo teve como objetivo descrever a efetividade e a segurança do antimoniato de meglumina 5mg Sb 5+ /Kg/dia no tratamento de pacientes com a forma mucosa ou mucocutânea (LM/LMC) da LTA, ao longo de dezesseis anos, no Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC), Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil. Foi realizado um estudo descritivo e retrospectivo, tipo série de casos acompanhados longitudinalmente. Os dadosforam obtidos dos prontuários dos pacientes com LM/LMC atendidos no Serviço de Otorrinolaringologia do IPEC entre 1º de janeiro de 1989 e 31 de dezembro de 2004 e tratados com baixa dose de antimoniato de meglumina, de forma contínua ou intermitente (em séries com intervalos de descanso). Dos 1667 pacientes com LTA tratados nesse período, 148 (8,9%) apresentavam LM/LMC. Destes, 98 (66,2%) tratados com antimoniato de meglumina 5mg Sb 5+ /Kg/dia foram incluídos neste estudo. A maioria dos pacientes eram homens que desempenhavam atividades de risco para LTA na região Sudeste do Brasil. A apresentação clínica mais frequente foi a forma mucosa tardia com acometimento nasal. Os pacientes submetidos ao tratamento em séries eram na maioria mais velhos e, possivelmente, com mais co-morbidades. Ambos os esquemas terapêuticos apresentaram boa efetividade com reduzido número de efeitos adversos. Mesmo nos pacientes com necessidade de retratamento, estes esquemas se mantiveram bem tolerados e eficazes. Os pacientes que foram tratados com anfotericina B ou alta dose de antimoniato de meglumina após o tratamento com baixa dose, responderam adequadamente. O tratamento com antimoniato de meglumina 5mg Sb 5+ /Kg/dia se mostrou efetivo e bem tolerado no tratamento da LM/LMC, com 91,7% de cura, mesmo que tendo sido necessário mais de um tratamento. / Pentavalent antimonials in 10 to 20mg Sb 5+ /kg/day doses are still the first drug of choice for American tegumentary leishmanisis (ATL) treatment despite reports of low efficiency and high number of adverse effects,including death. This study aims at describing the efficiency and safety of 5mg Sb 5+ /Kg/day of meglumine antimoniate in treating patients with mucous or mucocutaneous (ML/MCL) ATL over sixteen years at the Evandro Chagas Clinical Research Institute (IPEC), Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brasil. A retrospective and descriptive studywas conducted with a longitudinal surveillance of a series of cases. Datawere obtained from medical records of patients with ML/ MCL treated at IPEC Otorhinolaringology Department between January 1 st, 1989 and December 31, 2004 with low doses of meglumine antimoniate applied continuously or intermittently (in series with rest intervals). From a total of 1667 patients with ATL treated over that period, 148 (8.9%) presented ML/MCL. From those, 98 (66.2%) treated with 5mg Sb 5+ /Kg/day of meglumine antimoniate were included in the present study. Most patients were men who performed activitieswith risk for ATL in Southeastern Brazil. The most frequent clinical presentation was late mucousal impairment with nasal involvement. Patients undergoing serial treatment were mostly older and possibly with more co-morbidities.Both therapeutic plans presented good efficiency with few adverse effects. Even in patients needing retreatment, these therapeutic plans were well tolerated and efficient. Patients treated with anphotericin B or high dose of meglumine antimoniate,after treatment with low dose, presented an adequate response. Treatment of ML/MCL with 5mg Sb 5+ /Kg/day meglumine antimoniate was effective and well tolerated, with 91.7% healing, even when more than one treatment was needed.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-28T18:06:05Z No. of bitstreams: 1 giselle_af_silva_ioc_bp_0017_2010.pdf: 1838288 bytes, checksum: 8de949a35ec6e17274c973a923f9e69e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-28T18:06:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 giselle_af_silva_ioc_bp_0017_2010.pdf: 1838288 bytes, checksum: 8de949a35ec6e17274c973a923f9e69e (MD5) Previous issue date: 2010 / CNPq / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O perfil de citocinas tipo 1, tipo 2 e reguladoras parece ser determinante para a cura clínica da leishmaniose tegumentar americana. No entanto, pouco se sabe sobre a resposta imune (RI) duradoura responsável pelo controle da infecção por Leishmania em indivíduos curados de leishmaniose cutânea (LC). É provável que o perfil da RI efetora e/ou reguladora desencadeada nesses indivíduos contribua para o desenvolvimento de estratégias vacinais promissoras. O T-bet, GATA-3 e Foxp3 são fatores transcricionais (FT), envolvidos na diferenciação de células T, apontados como moduladores da expressão de genes que codificam citocinas efetoras e reguladoras. Baseado nisso, nosso objetivo foi avaliar se os níveis de expressão gênica de citocinas do tipo 1 (IFNG, IL12A, IL18), tipo 2 (IL4, IL5), reguladoras (IL10) e, respectivamente, dos FT TBET, GATA3 e FOXP3, em resposta aos antígenos de Leishmania estavam associados ao tempo de cura clínica da LC. Foram estudados: pacientes de LC curados há menos de dois anos (LCC<2a; n=11), curados há mais de dois anos (LCC>2a; n=10), ou que evoluíram para a cura espontânea (CE; n=05). O grupo controle foi constituído de indivíduos saudáveis, sem histórico de leishmaniose (IS; n=08). O RNAm foi extraído das células mononucleares de sangue periférico (CMSP) estimuladas in vitro com antígenos de L. braziliensis. Para a amplificação gênica, foram utilizadas placas de 96 poços contendo simultaneamente todos os iniciadores dos genes alvo, além dos genes constitutivos. O número de cópias de genes foi quantificado pela da técnica de PCR em tempo real. Os resultados demonstraram que não houve alteração nos níveis de expressão de TBET, GATA3, FOXP3 nos grupos de LCC estudados, mas os CE apresentaram níveis significativamente mais elevados para todos os FT analisados. Os LCC>2a tiveram redução na expressão de IL12A em comparação aos LCC<2a (p<0,01), mas não houve alteração em relação ao IFNG. Embora o número de cópias de IL18, IL4 e IL10 fosse mais baixo nos LCC>2a em relação aos LCC<2a, esta diferença não foi significativa. Além dos FT, os CE apresentaram expressão estatisticamente mais elevada de IFNG, IL12A, IL4, IL5, e IL10. Os resultados acima sugerem que os pacientes que curaram espontaneamente apresentaram uma maior capacidade de expressar citocinas do tipo 1, tipo 2 e reguladoras comparadas aos curados que receberam o tratamento. A redução da expressão de genes de citocinas efetoras e inibitórias com o aumento do tempo de cura sugere que este padrão esteja associado com uma resposta protetora bem modulada. / The profile of Type 1 and Type 2 cytokines in addition to the expression of transcriptional regulators are determinant for the clinical cure of American tegumentary leishmaniasis (ATL). Despite of all investigation in the field, little is known about the progression of the immune response (RI) after the clinical cure (CL), when the parasite burden and excess inflammation is kept in check by a well regulated immune response. It is probable that the RI profile involving the expression of effector and regulatory molecules contributes to ensure the successful strategy for the immune response against the parasite. T-bet, GATA-3 and Foxp3 are transcriptional factors (TF), involved in differentiation of T cells, these molecules are modulators of gene expression that control effector and regulatory cytokines. Based on that, our aim was to associate the levels of cytokines gene expression of type 1 (IFNG, IL12A, IL18), type 2 ( IL4, IL5) and regulatory molecules (IL10, TBET, GATA3 and FOXP3) in response to Leishmania antigen, to clinical time of cure in CL. Were investigated patients of CL with less than two years of cure (CCL<2y; n=11), more than two years of cure (CCL>2y; n=10), or that evolved to spontaneous healing without intervention (SH; n=05). The control group was composed by healthy individuals, with no history of leishmaniasis (HI; n=08). Total RNA was extracted from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated in vitro with L. braziliensis antigens. The extracted RNA was used to quantify specific gene expression by Real Time PCR using customized assay kits. The experiments showed that there is no change in transcription for TBET, GATA3 or FOXP3 at studied CCL groups, however SH patients have significantly higher gene copy number for all analyzed TF. LCC>2a patients showed reduced expression of IL12A in comparison with LCC<2a (p<0,01), but yet the expression of IFNG was identical in both groups. There is a trend for lower gene copy numbers of IL18, IL4 e IL10 in LCC>2a in comparison with LCC<2a patients, but this difference was not statistically relevant. Besides increased expression of transcriptional regulators, CE patients showed significant increase in gene copy numbers for IFNG, IL12A, IL4, IL5, e IL10. Taken together, our results suggest that patients with spontaneous cure of leishmaniases present a stronger Type 1, Type 2 and regulatory responses when compared to patients that developed progressive disease and received treatment. With increased time of cure, we observed a reduction on gene expression of effector and inhibitory cytokines. This phenomena may represent a pattern of well modulated protective immune response against the parasite.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-15T17:46:51Z No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-15T17:46:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As Leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania, que afetam indivíduos em aproximadamente 88 países. Atualmente, a medida de controle da doença mais aceita é o desenvolvimento de uma vacina profilática; porém, para que uma vacina efetiva seja alcançada, torna-se necessário a compreensão dos fatores que regulam e participam na proteção durante e após a infecção natural. São comuns trabalhos em que a resposta imune do tipo Th1 é medida exclusivamente pela produção in vitro de IFN-γ, porém a avaliação de um só parâmetro nem sempre é suficiente para predizer proteção. O presente trabalho visou estudar a qualidade de resposta Th1 induzida por diferentes antígenos de Leishmania em pacientes com a forma cutânea de leishmaniose tegumentar americana (LTA) provenientes do RJ. Utilizando-se ensaios de citometria de fluxo multiparamétrica para marcadores de superfície, e para as citocinas IL-2, TNF-α e IFN-γ, bem como ELISA para IFN-γ, foram feitas comparações da resposta induzida pelos extratos totais de promastigotas de fase estacionária de L. (V.) braziliensis (LbT) e L. (L.) amazonensis (PH8T), assim como frações enriquecidas em componentes subcelulares de L. (L.) amazonensis, em células mononucleares de sangue periférico de pacientes com LTA, antes e 140 dias após o tratamento, e indivíduos controles sadios. A análise das subpopulações de linfócitos T por citometria de fluxo não identificou alterações significativas nos percentuais de células CD8 +, CD4+ e CD25+ induzidas pelos diferentes estímulos, dentro de um mesmo grupo, nem entre os grupos de pacientes e controles. A avaliação individual da MFI integrada (frequência de células produtoras de uma citocina multiplicada pela intensidade média de fluorescência) para cada citocina estudada, não evidenciou nenhuma diferença marcante na resposta imune do tipo Th1 induzida pelos diferentes estímulos; porém, através da avaliação da contribuição dos fenótipos CD4+ produtores de 3, 2 ou 1 única citocina na resposta imune do tipo Th1 total, observamos diferenças qualitativas bem distintas entre as respostas obtidas antes e após o tratamento, e entre os antígenos estudados. Todos os estímulos apresentaram aumento da porporção de células multifuncionais nos pacientes PT, em relação aos AT. Após o tratamento, LbT foi o estímulo que induziu maior proporção de células multifuncionais (produtoras de IL-2, TNF-α e IFN-γ, simultaneamente; 28%), seguido da fração de membrana de L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), enquanto que, PH8T induziu a menor proporção de células multifuncionais (10%), e a maior proporção de células simples produtoras de IFN-γ (38%). Corroborando alguns outros relatos da literatura, observamos que as células multifuncionais são as que possuem a maior intensidade média de fluorescência para as 3 citocinas estudadas. A avaliação quantitativa da produção de IFN-γ por ELISA, demonstrou que LbT foi o estímulo que induziu significativamente a maior produção desta citocina, em comparação aos demais estímulos, tanto antes como após o tratamento. Este último resultado parece se correlacionar com os dados de citometria já mencionados, em que este mesmo estímulo foi capaz de induzir o maior percentual de células T multifuncionais, células essas com a capacidade de produzir uma quantidade maior de citocinas, do que os outros fenótipos estudados, como evidenciado nos resultados de MFI. Nossos resultados levam a discussão sobre a importância da avaliação da qualidade de uma resposta imune do tipo Th1 medida por mais de um parâmetro, a nível de uma única célula, e sugerem que a avaliação das células multifuncionais é importante para correlacionar com a cura da doença. / Leishmaniasis is a group of disease caused by different species of protozoan parasites from the genus Leishmania, that affects 88 countries around the world. Currently, the most accepted approach to control the disease is a prophylactic vaccine. However, to develop such a vaccine, it becomes necessary to understand the factors that regulate and participate in the healing process as well as protection during and after natural infection. It is well established that Th1-immune response is important for the protection against intracellular parasites. Many studies evaluate this response only by the in vitro IFN-γ production, but the evaluation of this single parameter not always is sufficient to predict protection. The present work assessed the quality of the Th1-immune response induced by different Leishmania antigens in patients affected with the cutaneous form of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) from Rio de Janeiro, Brazil. Using multiparametric flow cytometry to access surface markers and cytokines, such as IL-2, TNF-α and IFN-γ, as well as ELISA to measure IFN-γ in culture supernatants, we evaluated the immune responses induced by total antigens of stationary phase promastigotes of L. (V.) braziliensis (LbT) and L. (L.) amazonensis (PH8T), as well as subcellular components, composed of enriched fractions of L. (L.) amazonensis promastigotes, in peripheral blood mononuclear cells of ATL patients, before and 140 days after antimonial therapy, and healthy controls. Analysis of the T lymphocytes subpopulations by flow cytometry did not show significant variations in the percentage of CD4+, CD8+ and CD25+ cells induced by all different stimuli within the same group, or among the three studied groups. The individual evaluation of integrated MFI (frequency x MFI) for each cytokine assessed did not show any marked difference in the Th1-immune response induced by the different stimuli; however, by assessing the contribution of the CD4+ phenotypes producing 3, 2, or a single cytokine in the total Th1-immune response, we were able to identify very interesting differences. In the group of patients analyzed after treatment, LbT induced the highest proportion of multifunctional CD4+ T cells (producing IL-2, TNF-α and IFN-γ, simultaneously; 28%), followed by the membrane fraction of L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), whereas PH8T induced the lowest proportion of multifunctional CD4+ T cells (10%) and the highest proportion of single positive-cells for IFN-γ (38%). Corroborating previously published data, our results also showed that multifunctional CD4+T cells are those with the highest mean fluorescence intensity for the three cytokines studied. The quantitative evaluation of IFN-γ by ELISA showed that LbT significantly induced the higher production of this cytokine, in comparison to the other stimuli, both before and after treatment. This last result appears to show a relationship with our flow cytometry data, in which the same antigen was able to induce the highest percentage of multifunctional T cells, coincidently the cells that produced the larger amounts of cytokines, in comparison to the other CD4+ T cells phenotypes, as observed by the MFI values. Our results support the actual discussion about the importance of evaluating not only the quantity, but also the quality of a Th1-immune response by more than one parameter at a single-cell level, and indicate the importance of studying multifunctional CD4+ T cells in the cure of of ATL lesions.

La leishmaniose viscérale (LV) à Leishmania infantum est une zoonose qui sévit notamment autour du bassin méditerranéen. Elle atteint principalement le chien, qui représente le réservoir de l’infection. Chez l’homme, si la forme patente est rare, il existe de nombreux sujets porteurs asymptomatiques dans les zones d’endémies. Au cours de ce travail, nous avons abordé 3 problématiques importantes concernant la LV. La première problématique à porté sur l’importance du portage asymptotique humain à L. infantum au niveau mondial et de ses conséquences. Notre étude montre que la fréquence de porteurs asymptomatiques dépend des tests de détection utilisés et des populations étudiées et qu'elle peut atteindre jusqu'à 70% dans certaines zones d’endémies. Elle montre également que la transmission du parasite par don de sang est peu probable et que le rôle du portage asymptomatique comme réservoir n’est pas encore démontré. Elle souligne également la nécessité de détecter le portage asymptotique chez le donneur et le receveur de greffe et le risque de développement de la forme patente chez l’asymptomatique déprimé. La deuxième problématique porte sur le développement de procédés vaccinaux contre L. infantum par voie endonasale chez la souris BALB/c. Nos résultats montrent que la vaccination par voie nasale induit de manière reproductible une immunité systémique, cellulaire et humorale et que la protection dépend de paramètres tels que la nature et la dose des antigènes utilisées et la présence d’adjuvant tels que le CNF et le MPL. Enfin, la sélection d’une infection intradermique permet d’améliorer significativement la protection.La troisième partie porte sur la mise au point de modèles expérimentaux d’infection basés sur l’utilisation de parasites recombinants exprimant le gène de la luciférase. Nos travaux montrent que l’utilisation de tels outils permet de suivre l’infection à L. infantum in vitro, ex vivo et in vivo chez la souris BALB/c et de ce fait sont utiles pour le criblage de médicaments comme la miltéfosine et potentiellement pour tester des préparations vaccinales. Cet outil nous a permis en outre de révéler un nouveau site de prolifération parasitaire. / Visceral leishmaniasis (VL) caused by L. infantum is a zoonotic disease present in the Mediterranean basin (LVM). Dogs represent the reservoir and the main victim of the disease. In man, besides a limited number of cases of patent VL, a great number of infection remains asymptomatic. In this report, three different aspects of VL have been studied.First, the prevalence and the consequences of asymptomatic carriers of L. infantum was evaluated worldwide. The prevalence of asymptomatic carriers depends on the selected detection tests and the studied population and can reach 70% in some endemic zones. Our study also shows that the role of asymptomatic carriers as reservoirs remains to be established. However, in immunocompromised asymptomatic carriers such as HIV positive individuals, infection can be reactivated.Second, we developed vaccine trials against L. infantum in the BALB/c mouse model using the nasal route. Nasal immunization with Leishmania antigens induces cellular and humoral systemic immunity. Protection depends on various parameters including the nature of antigens, the dose and the presence of adjuvants such as CNF or MPL. Protection was improved when mice were challenged by ID route.Third, we set up experimental models of infection based on the use of recombinant parasites expressing the luciferase gene. These tools allow us to trace the infection in vitro, ex vivo and in vivo and therefore are useful to evaluate the efficiency of drugs and potentially to assess vaccine preparations. Bioluminescence imaging was also useful to evidence a new potential site of parasite proliferation.

As enzimas desempenham papéis essenciais no metabolismo celular. A ausência ou inativação delas podem trazer sérios prejuízos para o desempenho fisiológico de um organismo. Algumas enzimas são comuns a todos os organismos, outras, por sua vez, podem estar ausentes em determinados grupos biológicos, o que pode representar um excelente ponto de partida para estudos bioquímicos que objetivam o desenvolvimento de fármacos mais efetivos. Nesse sentido, é destacado neste trabalho um grupo de enzimas conhecidas como Old Yellow Enzyme (OYE), que são comumente encontradas em bactérias, leveduras, plantas, protozoários, mas estão ausentes em mamíferos. Conhecer a relação estrutura-função dessas proteínas pode trazer alternativas para tratamentos de doenças nas quais o agente etiológico depende da funcionalidade de uma OYE. Dessa forma, doenças negligenciadas, como as leishmanioses e doença de Chagas tornam-se um alvo interessante para o estudo dessas proteínas. Já foi demonstrado o papel que a OYE de Trypanosoma cruzi (TcOYE) desempenha no metabolismo das prostaglandinas, contudo, os dados sobre o comportamento dessas enzimas frente a vários compostos descritos como substratos e a descrição do papel fisiológico dessas proteínas não é completamente compreendido. Além disso, não há informações estruturais e funcionais sobre a OYE de Leishmania braziliensis (LbOYE) na literatura. Assim, um dos principais objetivos desse trabalho de doutorado foi determinar parâmetros estruturais e funcionais das proteínas LbOYE e TcOYE e analisá-los de forma comparativa. Os resultados apresentados sugerem que a LbOYE foi obtida em sua forma enovelada e que a mesma apresenta uma forma sutilmente mais alongada que sua ortóloga TcOYE. Adicionalmente, os resultados também mostram que a proteína LbOYE apresenta menor estabilidade estrutural e maior flexibilidade comparada à TcOYE. Os ensaios de prospecção de ligantes apresentados nesse trabalho mostraram que as enzimas foram obtidas em sua forma funcional e que o composto menadiona foi o que apresentou menor afinidade de interação dentre os compostos avaliados. Além disso, testes de atividade enzimática em baixa pressão de oxigênio com a proteína TcOYE se mostraram efetivos para determinação de moduladores da atividade funcional da proteína. Este trabalho é pioneiro na caracterização estrutural e funcional da LbOYE. / Enzymes play key roles in cellular metabolism. The absence or inactivation of them can cause serious damage to the physiological performance of an organism. Some enzymes are common to all organisms; others, in turn, may be absent in certain biological groups, which may represent an excellent starting point for biochemical studies aiming at the development of more effective drugs. In this sense, it is highlighted in this work a group of enzymes known as Old Yellow Enzyme (OYE), which are commonly found in bacteria, yeasts, plants, protozoa, but are absent in mammals. Knowing the structure-function relationship of these proteins may provide alternatives for treatments of diseases in which the etiological agent depends on the functionality of an OYE. Thus, neglected diseases such as leishmaniasis and Chagas\' disease become an interesting target for the study of these proteins. However, the role that Trypanosoma cruzi OYE (TcOYE) plays in the metabolism of prostaglandins has been demonstrated, however, data on the behavior of these enzymes against various compounds described as substrates and description of the physiological role of these proteins is not fully understood. In addition, there is no structural and functional information on the OEE of Leishmania braziliensis (LbOYE) in the literature. Thus, one of the main objectives of this doctoral project was to determine structural and functional parameters of LbOYE and TcOYE proteins and to analyze them in a comparative way. The presented results suggest that the LbOYE was obtained in its endovelada form and that it presents a subtly more elongated form than its ortholog TcOYE. In addition, the results also show that the LbOYE protein presents lower structural stability and greater flexibility compared to TcOYE. The ligand prospecting trials presented in this study showed that the enzymes were obtained in their functional form and that the menadione compound had the lowest interaction affinity among the evaluated compounds. In addition, low oxygen pressure enzymatic activity tests with the TcOYE protein proved to be effective for the determination of modulators of the functional activity of the protein. This work is a pioneer in the structural and functional characterization of LbOYE.

Orientadora: Marcia Aparecida Silva Graminha / Banca: Jean Leandro dos Santos / Banca: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Sergio de Albuquerque / Banca: André Luiz Pedrosa / Resumo: As leishmanioses são doenças causadas pelo protozoário parasito do gênero Leishmania e transmitidas pela picada do insetor vetor, o flebotomíneo. As leishmanioses apresentam diferentes manifestações clínicas, sendo elas leishmaniose cutânea, mucocutânea, cutânea difusa e visceral. Os fármacos atualmente disponíveis para o tratamento das leishmanioses apresentam diversos efeitos colaterais, além de problemas associados às vias de administração e surgimento de cepas resistentes. Os furoxanos e benzofuroxanos são compostos heterocíclicos contendo a função N-óxido com múltiplas atividades, incluindo anti-T. cruzi e anti-Leishmania. Neste trabalho, uma série de derivados de furoxano (compostos 3, 4a-b, 13a-b, e 14a-f) e benzofuroxano (7 e 8a-c) foram avaliados em ensaios in vitro frente as espécies L. (L.) amazonensis, L. (L.) mexicana e L. (L.) infantum. Os compostos foram também avaliados quanto à citotoxicidade em macrófagos murinos e quanto à sua capacidade de produção de óxido nítrico in vitro e em macrófagos infectados com o parasito. A atividade leishmanicida (EC50) dos derivados em estudo variou de 2,0 a 96,0 µM, enquanto que a citotoxicidade de 5,0 a 250,0 µM. A molécula doadora de óxido nítrico 14e revelou ser a mais promissora dentre os derivados analisados, exibindo ação pH-dependente. Adicionalmente, o derivado 14e mostrou ser capaz de inibir a enzima cisteíno protease de Leishmania, importante fator de virulência deste parasito. Estes ensaios mostraram que 14e inibe ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leishmaniases are diseases caused by the protozoan parasite of Leishmania genus and transmitted by the bite of insect vetor, phlebotomine. Leishmaniases present different clinical manifestations, including cutaneous, mucocutaneous, diffuse cutaneous and visceral leishmaniasis. The currently available drugs for leishmaniasis treatment show several side effects, besides problems associated with the administration routes and the emergence of resistant strains. Furoxan and benzofuroxan are heterocyclic compounds containing the N-oxide function showing several activities, including anti-T. cruzi and antiLeishmania. In this work, a series of furoxan (compounds 3, 4a-b, 13a-b, and 14a-f) and benzofuroxan (7 and 8a-c) derivatives were tested against the species L. (L.) amazonensis, L. (L.) mexicana e L. (L.) infantum. The compounds were also evaluated for cytotoxicity against murine macrophages and as to its ability to produce nitric oxide in vitro and in macrophages infected with the parasite. The antileishmanial activity (EC50) of the derivatives studied ranged from 2.0 to 96.0 μM, whereas the cytotoxicity of 5.0 to 250.0 μM. The nitric oxide donor molecule 14e revealed to be the most promising of the analyzed derivatives, exhibiting a pH-dependent action. Futhermore, the derivative 14e was shown to be capable of inhibiting the cysteine protease enzyme of Leishmania, an important virulence factor of this parasite. These assays showed that 14e inhibits the cysteine protease B 2.8 re... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A Leishmaniose é uma infecção causada pelo protozoário do gênero Leishmania e transmitida pela picada de insetos. Os tratamentos atuais são caros e demorados, envolvendo compostos baseados em Sb(V), anfotericina B lipídica e miltefosina. Estudos recentes sugerem que a enzima tripanotiona redutase (TR) poderia ser um alvo específico no desenvolvimento de novos fármacos, pois ela é essencial e exclusiva dos tripanossomatídeos. Desta forma, este trabalho apresenta a síntese de novos compostos derivados da iminodibenzila com estrutura similar à clomipramina, um conhecido inibidor da TR. Tais compostos são conjugados de iminodibenzila com etilenodiamina, etanolamina e dietilenotriamina através de epicloridrina (dado-en, dado-ea e dado-dien , respectivamente). Foram obtidos com rendimentos superiores a 94% e caracterizados através de LC_MS e espectroscopia no infravermelho. Também se fez a avaliação da afinidade relativa dos novos ligantes por cobre através do teste de recuperação da fluorescência da calceína, concluindo-se que o ligante dado-dien possui uma afinidade maior com Cu (II) quando comparado com os outros ligantes sintetizados. Foram formados complexos metálicos através da adição de sulfato de cobre (II), acompanhando-se através de espectroscopia ultravioleta-visível para se obter uma estimativa da relação metal: ligante, concluindo-se que os complexos formados eram [Cu(dado-ea)]2+, [Cu(dado-en)2]2+ e [Cu(dado-dien)2]2+. A lipofolicidade foi estimada através de simulação computacional, constatando-se que os complexos formados são todos muito lipofílicos, sendo que o logP descreve na seguinte: [Cu(dado-en)2]2+ > [Cu(dado-dien)2]2+ > [Cu(dado-ea)]2+. Ensaios de atividade pró-oxidante através da oxidação da sonda fluorimétrica DHR revelaram que o complexo [Cu(dado-ea)]2+ apresentou a maior taxa de atividade pró-oxidante, sendo independente da concentração de peróxido de hidrogênio no meio reacional e alcançando seu limiar quando presente em concentração aproximada de 10 µM. Por fim, os compostos sintetizados foram testados quando à suas citotoxidades frente a promastigotas L. amazonenses e com macrófagos RAW 264,7. Quando o protozoário foi exposto a concentrações variadas dos compostos deste estudo, observou-se que os ligantes ea, en e dien tiveram os menores valores de IC50 (todos < 3µM), porém eles são muito tóxicos para serem utilizados como fármacos, Dentre os ligantes sintetizados, somente o dado-en apresentou um resultado numa faixa viável (IC50 19,9 ± 2,2 µM). Contra macrófagos RAW 264,7, dado-en apresentou IC50 > 50µM, ou seja, ele é mais tóxico para o protozoário do que para os macrófagos. A complexação com cobre não representou um aumento interessante na citotoxicidade dos compostos. O conjunto de resultados apresentados neste indica um potencial uso do composto dado-en no combate à leishmaniose. / Leishmaniasis is an infection caused by protozoa of the genus Leishmania. and transmitted by insects. Current treatments are expensive and time-consuming, involving Sb(V)-based compounds, lipossomal amphotericin B and miltefosine. Recent studies suggest that inhibition of trypanothione reductase (TR) could be a specific target in the development of new drugs, because it is essential and exclusive to trypanosomes. Thus, this work presents the synthesis of new compounds derived from iminodibenzyl with structures related to clomipramine, a known inhibitor of TR. These compounds were conjugates of iminodibenzyl with ethylenediamine, ethanolamine and diethylenetriamine, linked by epichlorohydrin. They were obtained with yields higher than 94% and their structures were confirmed by LC-MS and infrared spectroscopy. The relative affinity for copper of the new chelators was assessed by the recovery of calcein fluorescence, which showed that dado-dien has the highest affinity for Cu(II) among the new ligands. Metal complexes were synthesized by addition of copper(II) sulphate and studied by ultraviolet-visible spectroscopy, showing that the stoichiometries were [Cu(dadoea)]2+, [Cu(dado-en)2]2+ and [Cu(dado-dien)2]2+. Lipophilicity was assessed by computational methods, indicating that the complexes were all very lipophilic, with logP decreasing in the following order: [Cu(dado-en)2]2+ > [Cu(dado-dien)2]2+ > [Cu(dado-ea)]2+. Pro-oxidant activity assays by oxidation of DHR fluorimetric probe showed that [Cu(dado-ea)]2+ has the highest rate of oxidation, independent of hydrogen peroxide concentration, reaching its highest value when at ~ 10 &#181;M. Finally, the compounds were tested for citotoxicity to L. amazonensis promastigotes and RAW 264,7 macrophages. When the protozoa was exposed to varying concentrations of the compounds, it was observed that chelators ea, en and dien had the lowest values of IC50 (< 3 &#181;M). but they are too citotoxic to be used as drugs. Among the synthesized chelators, only dado-en presented a result in a pharmaceutically interesting range (IC50 19.9 ± 2.2 &#181;M). Against RAW 264,7 macrophages dado-en IC50 > 50 &#181;M. Complexation to copper did not enhance the citotoxicity of the compounds. Overall, the results in this study indicate a potential use of dado-en in combating leishmaniasis.

A leshmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença de ampla distribuição no continente, constituindo importante problema de saúde pública na América Latina. No Brasil, são notificados cerca de 35 mil casos novos a cada ano, com maior distribuição nas regiões Centro-Oeste, Norte e Nordeste. A doença têm uma forte associação com desmatamentos e o estabelecimento de contingentes populacionais em áreas recentemente desbravadas. A região Centro-Oeste do País, notadamente o estado do Mato Grosso, sofreu nas últimas décadas um intenso processo de ocupação desordenada do seu território, passando a mostrar um número progressivamente elevado de casos de LTA. Este trabalho objetivou descrever a evolução da moléstia no Mato Grosso durante o período 1994 a 1999, utilizando dados secundários produzidos na rotina das atividades da Fundação Nacional de Saúde (Funasa) relativos às 4 áreas distritais em que o Estado era dividido: Distritos 1 (Cáceres), 2 (Nortelândia), 3 (Rondonópolis) e 4 (Sinop). Excluindo-se o ano de 1998, em que problemas operacionais relacionados à distribuição de medicamentos reduziram a notificação de casos, os coeficientes de incidência (10 mil) variaram de 16,5 (em 1997) a 20,6 (em 1999). A LTA mostrou-se crescente no Estado, com todos os municípios apresentando casos em 1999. Em todos os distritos e ao longo de todo o período do estudo, as maiores incidências foram observadas em homens acima de 20 anos de idade. Verificou-se uma distribuição diferenciada da LTA segundo as áreas distritais, com Cáceres mostrando os valores mais reduzidos (5,0 a 5,6 por 10 mil), Rondonópolis com valores intermediários (12,7 a 14,5 por 10 mil) e Nortelândia e Sinop com valores elevados (32,6 a 44,5 e 29,2 a 55,2 por 10 mil, respectivamente). Os baixos valores em Cáceres devem-se, provavelmente, ao fato de corresponder a uma população mais estabilizada. Em contrapartida, os distritos de Nortelândia e, especialmente, Sinop, compreendem áreas que sofreram intenso processo de colonização em anos recentes, com desmatamento para expansão da fronteira agrícola, construção de rodovias e grande afluxo populacional, fatores que explicam os elevados coeficientes de incidência. Os resultados do trabalho mostram que a LTA é uma endemia de grande relevância no Mato Grosso, com transmissão ocorrendo em todo o seu território e de maneira ascendente nos últimos anos da série estudada. A evolução progressiva da doença se fez de modo mais intenso na área do Distrito 4 (Sinop), onde, em 1999, 12 municípios apresentavam coeficientes de incidência acima de 100 casos por 10 mil habitantes. / American tegumentary leishmaniasis (ATL) is widely distributed in the continent, being a relevant public health problem in Latin America. In Brazil, it is more present in the Center-West, North and Northeast regions, with about 35 thousand reported cases every year. The disease is strongly associated with the entrance of large amount of people into recently deforested areas. The Center-West region of Brazil, mainly the State of Mato Grosso, experienced a very disorganized process of colonization in the recent decades, showing a marked increase in the number of cases of ATL. This investigation was designed to describe the evolution of the disease in Mato Grosso from 1994 to 1999, using secondary data provided by the routine activities of National Health Foundation (Funasa), corresponding to the 4 districts in which the State was divided: 1 (Cáceres), 2 (Nortelândia), 3 (Rondonópolis) and 4 (Sinop). Excluding the year 1998, in which operational problems related to the distribution of medicines to treat ATL caused reduction in reporting cases of the disease, the incidences rates (per 10000) varied from 16.5 (in 1997) to 20.6 (in 1999). ATL showed increasing rates along the period, with every municipality reporting cases in 1999. Males above 20 years of age showed the highest rates in all districts and during the whole period under study. The disease had a different distribution according to the district: Cáceres had the lowest rates (5.0 to 5.6 per 10000); Rondonópolis, intermediate rates (12.7 to 14.5 per 10000); Nortelândia and Sinop, high rates (32.6 to 44.5 and 29.2 to 55.2, respectively). The low incidence in Cáceres is probably due to the fact that this area has a more stable population. On the other hand, the district of Nortelândia, and, especially Sinop, encompasses areas which experienced an aggressive colonization process in recent years, with intense deforestation intended to expand the agriculture frontier, construction of highways and enormous population movement into the area, which explains the rise of the rates along the period. The results of this investigation show that ATL has a great sanitary relevance in Mato Grosso, with transmission occurring in its whole territory and showing an increasing trend along the last years of the studied period. The progression of the disease is more evident in the area of District 4 (Sinop), where 12 municipalities showed incidence rates above 100 cases per 10000 inhabitants in 1999.

As chaperonas moleculares são ativas em muitos processos celulares envolvendo o enovelamento e a homeostase de proteínas. Essas características fazem das chaperonas alvos potenciais para o tratamento de diversas doenças. As Hsp70 e as Hsp90, em especial, são proteínas ubíquas altamente conservadas biologicamente que atuam no enovelamento de proteínas nascentes, prevenção da agregação proteica, recuperação de proteínas de agregados, sinalização e crescimento celular, dentre outros. Contudo, para que essas proteínas cumpram eficientemente suas funções, elas devem ser moduladas por co-chaperonas moleculares. A SGT é uma co-chaperona que pode ser dividida em três regiões: domínio N-terminal, domínio TPR e domínio C-terminal, sendo que a região do domínio TPR é a responsável pela interação com o motivo EEVD no C-terminal das Hsp90 e Hsp70 citoplasmáticas. A SGT é encontrada em vários organismos, dentre eles os protozoários do gênero Leishmania spp.. Estes organismos são responsáveis pela leishmaniose, uma doença negligenciada que afeta milhares de pessoas todos os anos, principalmente em países subdesenvolvidos. Evidências indicam que a SGT em protozoários é essencial para o crescimento e viabilidade da forma promastigota. Diante disso, nesse trabalho foi feito o estudo estrutural e funcional da co-chaperona SGT de Leishmania braziliensis (LbSGT). A LbSGT recombinante foi produzida e purificada. A caracterização estrutural indica que a LbSGT é uma proteína rica em estrutura secundária do tipo hélice &alpha; que se comporta como um dímero alongado em solução. Dados de estabilidade térmica e química indicam que a LbSGT é uma proteína formada por domínios com diferentes estabilidades. A LbSGT foi identificada in vivo e o western blotting indicou sua presença cognata nas formas promastigotas do protozoário. Os ensaios de interação indicam que as interações entre a LbSGT e a Hsp90 de L. braziliensis (LbHsp90) e a LbSGT e Hsp70-1A humana (usada como proteína modelo) são diferentes da interação da LbSGT com o peptídeo MEEVD. Sendo assim, esses dados sugerem que a interação da LbSGT com a Hsp70-1A e LbHsp90 envolvem mais regiões das proteínas do que somente o motivo de interação da Hsp70-1A e da LbHsp90 com o domínio TPR da LbSGT. Em conjunto, as propriedades estruturais e funcionais da LbSGT observadas estão de acordo com a possível função da SGT como proteína adaptadora entre os sistemas Hsp70 e Hsp90 no foldossoma. / The molecular chaperones are active in many cellular processes involving protein folding and homeostasis. These characteristics make the chaperones potential targets to the treatment of many diseases. Hsp70 and Hsp90, in special, are highly conserved ubiquitous proteins that act in the folding of nascent proteins, protein aggregation prevention, aggregate recovering, signaling and cellular growth, among others. However, for these proteins to effectively fulfill their function, they must be modulated by molecular co-chaperones. SGT is a co-chaperone that can be divided into three domains: a N-terminal domain, a TPR domain and a C-terminal domain, being the TPR domain responsible for the interaction with the EEVD motif at the C-terminus of cytoplasmic Hsp90 and Hsp70. SGT is found in various organisms; among they are the protozoans of Leishmania spp.. These organisms are responsible for leishmaniasis, a neglected disease that affects thousands people every year, mainly at underdeveloped countries. Evidences indicate that SGT in protozoans are essential to the growth and viability of promastigote form. Therefore, the structural and functional study of the Leishmania braziliensis SGT (LbSGT) is presented. Recombinant LbSGT was produced and purified. The structural characterization points that LbSGT is rich in &alpha;-helix secondary structure and behaves as an elongated dimer in solution. Chemical and thermal stability data suggest that LbSGT is formed by domains of different stabilities. LbSGT was identified in vivo and the western blotting indicates its cognate presence in the protozoan promastigote forms. The interaction assays show that the interaction between LbSGT and Hsp90 of L. braziliensis (LbHsp90) or human Hsp70-1A (used as model protein) were different from the interaction between LbSGT with MEEVD peptide. Moreover, these data suggests that the interaction between LbSGT and Hsp70-1A and LbHsp90 involves additional protein regions besides the Hsp70-1A and LbHsp90 interaction motif. Altogether, the observed functional and structural proprieties of LbSGT accord to the SGT possible function as an adapter protein between the Hsp70 and Hsp90 systems in the foldossome.

A leishmaniose visceral (LV) é um problema de saúde pública, que tem incidência elevada em crianças. No ano de 2009 a cidade de Araguaína - Tocantins foi a cidade com maior número de casos de LV. Este estudo tem como objetivo identificar a expansão geográfica da LV no município de Araguaína, identificar o perfil epidemiológico dos casos de LV atendidos no Hospital de Doenças Tropicais (HDT) de Araguaína, principalmente de crianças e pessoas maiores de 60 anos, que representam população de risco para a gravidade da doença. A partir do número de casos notificados de 2004 a 2009, foram elaborados mapas sobre a evolução da distribuição geográfica da LV nos bairros de Araguaína, também foi realizado estudo epidemiológico, laboratorial e evolutivo dos casos de LV em crianças e pessoas acima de 60 anos atendidas no HDT. Dentre as crianças, nas menores de um ano, também foi avaliado o quadro clínico. Foram utilizados os dados do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) dos casos notificados no HDT, nos anos de 2004 a 2009. Foram registrados 983 casos, sendo 391 de crianças (39,8%) de zero a cinco anos e destas 71 notificações de menores de um ano (18%). Neste mesmo período foram notificados 22 casos de LV em maiores de 60 anos (2,2%). A maioria das notificações foi da cidade de Araguaína (62,5%). Os casos de LV ocorreram na maioria dos bairros de Araguaína, iniciaram nos bairros centrais e depois se expandiram para a periferia, onde fizeram o maior número de casos. Com relação ao sexo dos pacientes, houve uma discreta incidência no sexo masculino, principalmente na faixa etária dos maiores de 60 anos. O diagnóstico de LV teve confirmação laboratorial na maioria dos casos, porém o exame utilizado foi na maioria das vezes o exame sorológico, que não é o melhor método diagnóstico. O tratamento inicial da maioria dos pacientes foi com o antimoniato pentavalente. A maioria dos pacientes evoluiu para a cura. Este trabalho demonstra a expansão geográfica da LV no município de Araguaína, atingindo principalmente crianças. / Visceral leishmaniasis is a public health problem, have enlarged incidence in children. In 2009 Araguaína city Tocantins was the city with the biggest cases VL. This study aimed to identify the geographical expansion of the VL in Araguaína, identify the epidemiological profile of cases of VL treated at the Hospital for Tropical Diseases (HDT) in Araguaína, especially in children and people over 60 years old, which represent a risk population for disease severity. From the number of reported cases from 2004 to 2009, maps were drawn about the evolution of geographical distribution of VL in the neighborhoods of Araguaína, was also carried out epidemiological study, laboratory and rolling of VL cases in children and people over 60 years attended in the HDT. Among children, with less than a year,was also evaluated the clinical date. The study used data from the Brazilian Information System for Notifiable Diseases (SINAN) cases reported in HDT, in the years 2004 to 2009. 983cases were notified, of which 391 children (39,8%) from zero to five years and of these 71 reports of children under one years (18%). In the same period were reported 22 cases of VL in adults over 60 years (2.2%). Most reports were from the Araguaína city (62,5%). VL cases occurred in most neighborhoods in Araguaína, started in central districts and then expanded into the suburbs, where they made the largest number of cases. With regard to sex of patients, the was a low incidence in males, mainly aged over 60 years. The diagnosis of VL was confirmed by laboratory tests in the most cases, but was obtained the serological diagnosis, that isnt the best diagnostic method. Initial treatment of most patients was with pentavalent antimoniate. Most of patients progressed to healing. This study demonstrates the geographical spread of VL in Araguaína, affecting mainly children.