O sequenciamento da L. interrogans sorovar Copenhageni e as análises bioinformáticas permitiram a identificação de candidatos vacinais e fatores de virulência. Foram selecionados dois genes, LIC11834 e LIC12253, que foram submetidos a ensaios de presença do DNA genômico e RNA mensageiro em diferentes sorovares de Leptospira. Observamos que o gene LIC12253 foi o mais presente entre os sorovares testados. Os genes foram clonados em vetor de expressão pAE e expressos em E. coli BL21 SI. As proteínas recombinantes foram purificadas e submetidas a ensaio de dicroísmo circular, o qual confirmou que ambas as proteínas estavam estruturadas. Por meio de testes de imunogenicidade em camundongos, ambas as proteínas mostraram-se imunogênicas, apresentando altos títulos de anticorpos, porém não foram capazes de promover resposta imune celular. Em ensaios de localização das proteínas nativas podemos observar a presença destas proteínas na membrana externa de Leptospira. Ensaios de reatividade com soros de pacientes diagnosticados com leptospirose mostraram que há reconhecimento das proteínas por anticorpos presentes nesses soros, sugerindo que as proteínas são expressas durante a infecção. Em ensaios de adesão a componentes de matriz extracelular e componentes do soro e plasma humano, rLIC11834 apresentou ligação à laminina, sendo nomeada de Lsa33, além de ligação ao plasminogênio, ao C4bp e ao fibrinogênio de forma dose-dependente; rLIC12253 apresentou ligação à laminina, sendo chamada de Lsa25, e ao C4bp de forma dose-dependente. Ensaios de desafio demonstraram que as proteínas não apresentam proteção contra infecção letal em hamsters. Assim, acreditamos que estas proteínas multifuncionais possam interagir com proteínas do hospedeiro e ter participação na patogênese da doença. / The genomic sequencing and the advances of bioinformatics analysis allowed the identification of new vaccine candidates and new virulence factors. Therefore, two genes from L. interrogans serovar Copenhageni, LIC11834 and LIC12253 were selected and subjected to assays for the presence of genomic DNA and mRNA in different serovars of Leptospira. These assays found that the gene LIC12253 was the most present among the tested serovars. The genes were then cloned in the expression vector pAE and expressed in E. coli BL21 SI. The recombinant proteins were purified and subjected to circular dichroism, which confirmed that both proteins presented secondary structures. Immunogenicity tests in mice showed that both proteins are immunogenic, with high antibodies titers, but don\'t induce cellular immune response. Localization assays of the native proteins on the leptospiras demonstrated the presence of the proteins on the surface of Leptospira. Reactivity assays with sera of patients diagnosed with leptospirosis showed that the recombinant proteins could be recognized by their antibodies, suggesting that they are expressed during infection. Adhesion assays to the extracellular matrix components, human serum and plasma components, showed that the protein rLIC11834 binds to laminin and was called Lsa33. In addition, Lsa33 interacts to plasminogen, to C4bp and to fibrinogen in a dose-dependent manner. The protein rLIC12253 showed binding to laminina, named Lsa25, and to C4bp in a dose-dependent manner. Challenge assays showed that both recombinant proteins don\'t afford protection against lethal infection in hamsters. Thus, we believe that these multifunctional proteins may interact with host proteins and may play a role in leptospiral pathogenesis.

A leptospirose é uma zoonose mundial causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, que colonizam os túbulos renais de animais domésticos e silvestres e são liberadas ao ambiente externo pela urina. Neste estudo avaliou-se a interação de seis prováveis lipoproteínas de membrana externa de leptospira com as proteínas do hospedeiro: colágeno I, colágeno IV, elastina, fibrinogênio, fibronectina celular e plasmática, laminina e plasminogênio. Os experimentos de adesão demonstraram que as proteínas recombinantes Lp21, Lp22 e Lsa30 apresentaram interação com os componentes do hospedeiro de maneira dose-dependente. Estas aderiram à fibronectina plasmática e laminina, além destes, a Lp21 e a Lp22 interagiram com plasminogênio, a Lp22 e a Lsa30 interagiram com colágeno IV. A Lp22 aderiu à elastina e ao fibrinogênio. No estudo de conservação gênica, os genes que codificam estas proteínas foram observados somente nas Leptospiras patogênicas. Portanto estas proteínas devem contribuir na adesão aos tecidos do hospedeiro na patogênese da Leptospira. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira that colonize the renal tubules of wild and domestic animals and are excreted in the environment by their urine. The aim of this work was to study the interaction of six leptospiral probable outer-membrane lipoproteins with host proteins: collagen I, collagen IV, elastin, fibrinogen, cellular fibronectin, plasma fibronectin, laminin, and plasminogen. The binding experiments demonstrated that the recombinant proteins showed interaction with host components in a dose-dependent manner were Lp21, Lsa30 and Lp22. These proteins adhered to plasma fibronectin and laminin, in addition to these components, Lp21 and Lp22 interacted with plasminogen, Lp22 and Lsa30 interacted with collagen IV. The Lp22 adhered to elastin and fibrinogen. The genes encoding the probable lipoproteins were found only in pathogenic Leptospira. These results demonstrated that these proteins may contribute in the adhesion to host tissues, in the pathogenesis of Leptospira.

Os mecanismos responsáveis pelas manifestações hemorrágicas durante a leptospirose severa ainda são pouco compreendidos. Este trabalho avaliou os efeitos diretos e indiretos das leptospiras sobre moléculas do sistema de coagulação. Foi verificado que leptospiras virulentas são eficientes em bloquear a atividade da enzima trombina por meio do sequestro de seu sítio de ligação ao substrato, gerando uma menor formação do coágulo de fibrina, acarretando em sangramento e consequente disseminação do patógeno para outros sítios de infecção. Foi mostrado também que a inflamação causada pela resposta imune contra as bactérias causa uma ativação da coagulação, muito provavelmente via expressão de Fator Tissular, o que ocasiona um consumo e consequente esgotamento dos fatores e inibidores de coagulação, culminando em hemorragia e formação de trombos, os quais podem levar à falência de órgãos. Estes resultados melhoram o entendimento da patogênese da leptospirose e podem favorecer o desenvolvimento de terapias para as manifestações hemorrágicas. / The mechanisms responsible for the hemorrhagic manifestations during severe leptospirosis are still poorly understood. This work evaluated the direct and indirect effects of leptospires upon molecules of the coagulation system. It has been shown that virulent leptospires are effective in blocking the activity of the enzyme thrombin by sequestration of its substrate binding site, generating less fibrin clot formation, leading to bleeding and consequent dissemination of the pathogen to other sites of infection. It has also been shown that the inflammation caused by the immune response against the bacteria causes an activation of the coagulation, most probably via expression of Tissue Factor, which causes a consumption and consequent depletion of coagulation factors and inhibitors, culminating in hemorrhage and thrombus formation, which can lead to organ failure. These results improve the understanding of the pathogenesis of leptospirosis and may favor the development of therapies for hemorrhagic manifestations.

A leptospirose é a zoonose mais disseminada no mundo e uma das principais causas de perda econômica no agronegócio. O estudo de novos antígenos de superfície de Leptospira interrogans, é intrigante e pode fornecer conhecimento na interação inicial patógeno-hospedeiro. Os genes LIC13059 e LIC10879, escolhidos por bioinformática, com predição de localização na superfície celular, foram clonados e as proteínas recombinantes expressas em E. coli, para avaliar a interação com componentes do hospedeiro. Após purificação, as proteínas encontravam-se estruturadas e foram reconhecidas por soro de indivíduos infectados. As proteínas recombinantes interagem com plasminogênio, fibrinogênio e laminina. rLIC13059, nomeada Lsa25.6, quando ligada ao fibrinogênio é capaz de inibir a formação de coágulo de fibrina e rLIC10879, nomeada Lsa16, interage com e-caderina, sugerido envolvimento na cascata de coagulação e ligação com o hospedeiro, respectivamente. O plasminogênio ligado às proteínas é convertido em plasmina, o que poderia ajudar a penetração bacteriana no hospedeiro. / Leptospirosis is the most widespread zoonosis and also a major cause of economic loss in animal production worldwide. The study of new surface antigens of Leptospira interrogans is intriguing and may shed light into the initial pathogen-host interactions. We set out to study two novel coding sequences LIC13059 and LIC10879 predicted to be located at the cell surface. The genes were cloned and the recombinant proteins were expressed in E. coli. The purified recombinant proteins presented secondary structures, and interacted with plasminogen, fibrinogen and laminin human components. rLIC13059, named Lsa25.6, when bound to fibrinogen was capable of inhibiting the formation of fibrin clot, while rLIC10879, named Lsa16, interacted with e-cadherin, a mammalian cell receptor, suggesting participation in coagulation pathway and host-cell binding, respectively. The plasminogen captured by both recombinant proteins could be converted into plasmin, a mechanism that could help bacterial penetration in the host.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-10-26T14:15:02Z No. of bitstreams: 1 Luciane Amorim Santos. Leptospira... 2015Tese.pdf: 2475098 bytes, checksum: 1cc01b7226dc488ff72bd8c3d6df2c00 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-10-26T14:16:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Luciane Amorim Santos. Leptospira... 2015Tese.pdf: 2475098 bytes, checksum: 1cc01b7226dc488ff72bd8c3d6df2c00 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-26T14:16:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciane Amorim Santos. Leptospira... 2015Tese.pdf: 2475098 bytes, checksum: 1cc01b7226dc488ff72bd8c3d6df2c00 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leptospirose é a zoonose mais disseminada mundialmente por infectar diversas espécies diferentes de animais mamíferos. Apresenta 22 espécies identificadas, sendo dez patogênicas, cinco intermediarias e sete saprofiticas, além de apresentar mais de 250 sorovares diferentes. Em Salvador, Leptospira interrogans sorovar Copenhageni é a causadora da epidemia urbana na cidade e apresenta ratos como seu hospedeiro reservatório. As formas clínicas da leptospirose podem variar de assintomática a formas graves. As manifestações clínicas mais graves envolve o desenvolvimento da síndrome Hemorrágica pulmonar severa, e óbito do paciente. Estudos para entender as diferenças genéticas entre as diferentes espécies e sorovares é de extrema importância para identificar fatores de virulência da bactéria, genes que possam está associado aos diferentes formas clinicas, e sua capacidade de se adaptar aos diferentes ambientes. Neste trabalho foi estudado o genoma de dois importantes serovares de L. interrogans, o sorovar Copenhageni e o serovar Icterohaemorrhagiae, e suas diferenças genéticas e associação com dados clínicos e epidemiológicos. Um total de 141 isolados tiveram seus genomas sequenciados. Foi construindo e validado um pipeline para a o mapeamento e construção dos genomas e a identificação de SNPs e Indels. Os resultados encontrados demostraram um alta similaridade entre os isolados dos dois serovares, de diferentes regiões geográficas e isolados em anos diferentes. As sequências deste estudo se mostram conservadas ao longo do tempo sem apresentar nenhuma mutação associada as diferentes forma clínicas da doença, indicando que outros fatores, tais como os do hospedeiro, podem estar envolvidos na diversidade de sintomatologia. Na comparação do genoma dos isolados de L. interrogans, sorovar Copenhageni e sorovar Icterohaemorrhagiae foi identificado apenas uma mutação que as difere geneticamente. Essa mutação está presente no gene LIC12008 que produz uma proteína hipotética, e que a sua avaliação in silico demostrou estar envolvida na síntese de LPS, justificando assim as diferenças encontradas no teste serológico. Além disto, também foram avaliadas as diferenças entre 20 das 22 espécies de Leptospira, para identificar possíveis fatores de virulência e genes que possam estar envolvidos na patogênese e adaptação da bactéria ao ambiente. Estudos de fatores genéticos da Leptospira pode auxiliar ao manejo da doença, com uma melhor assistência e terapia para os pacientes, desenvolvimento de vacinas e diagnostico desta doença negligenciada. / There are 22 different species of Leptospira spp. in which 10 are pathogenic, 5 intermediate and 7 saprophytic species. In Salvador the Leptospira interrogans sorovar Copenhageni is the main serovar detected, responsible for the urban epidemics, and has rats as their main host. The clinical manifestations of leptospirosis can vary from asymptomatic form to severe disease like pulmonary hemorrhagic syndrome, and death. Studies to understand de genetic differences among the species and serovars are of great importance to identify virulence factors, genes that could be related to the different clinical manifestations and its capacity to adapt in different environments. Here, the genome of two epidemiologically important serovar of the L. interrogans, the serovar Copenhageni and serovar Icterohaemorrhagiae, and their genetic differences and the association of these differences with epidemiological and clinical data were studied. A total of 141 strains were genome sequenced. A pipeline for the genome mapping and variant call were constructed and validated. The results showed a high similarity among the strains from both serovars from different geographic locations and year of isolation. The sequences from this study showed to be very conserved, not presenting any mutation associated with the different clinical outcome, indicating that other factors, like host factors, could be related to the diversity of clinical outcome. Only one genetic mutation was detected in the genome comparison of the strains belonging to the L. interrogans sorovar Copenhageni and sorovar Icterohaemorrhagiae. This mutation was found in the gene LIC12008 that produce a hypothetical protein, in which its in silico analysis reviled that this protein could be related to the LPS synthesis, justifying the serological test differences between the two serovar. Besides that, the differences between 20 of the 22 species of Leptospira identified were evaluated to detect possibly virulence factors and genes that could be involved in the pathogenesis and adaptation. Studies of the Leptospira virulence factors can give support to the disease management, giving a better assistance and treatment to the patients and developing vaccines and better diagnostic for the neglected disease

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-30Bitstream added on 2014-06-13T20:35:29Z : No. of bitstreams: 1 fuverki_rbn_me_jabo.pdf: 380911 bytes, checksum: 1e3cde0d1d852b172186ddec592ea827 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Com a crescente disponibilidade das biotécnicas de reprodução animal, o comércio dos produtos envolvidos com essas práticas também está em expansão, oferecendo a possibilidade de melhoria dos índices zootécnicos às produções de bovinos. Porém deve-se levar em consideração que há riscos sanitários em práticas como a inseminação artificial caso não se realize o controle do material biológico utilizado. Dentre os agentes infecciosos que podem estar presentes no sêmen e passíveis de serem transmitidos por esse estão a leptospirose e a brucelose, enfermidades responsáveis por grandes perdas reprodutivas e econômicas na bovinocultura mundial. Este projeto teve como objetivos detectar molecularmente esses patógenos em amostras de sêmen bovino provenientes de centrais de comercialização brasileiras, utilizando um kit comercial para extração de DNA (“RTP Bacteria DNA Mini Kit” (Invitek®), aperfeiçoá-lo para a extração de DNA bacteriano a partir de sêmen e avaliar sua aplicabilidade à rotina laboratorial. O DNA bacteriano foi extraído e quantificado por eletroforese em gel de agarose. Pretendeu-se também realizar reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os “primers” B4 e B5 para amplificação do DNA de Brucella spp. e os “primers” Lep 1 e Lep 2 para Leptospira spp. O kit de extração foi otimizado com sucesso, e todas as 96 amostras examinadas foram negativas para qualquer DNA bacteriano. Os resultados podem ser úteis para estabelecer alternativas de controle sanitário em touros doadores de sêmen e permitir o fornecimento de material genético livre de patógenos, aumentando o “status” sanitário da reprodução de bovinos no Brasil / With the increasing disponibility of animal reproduction biotechniques, trading of products involved with these activities is also in expansion offering improving possibilities in zootecnic indexes of bovine herds. However, considerations should be taken about sanitary risks in practices like artificial insemination if any control is applied to this biological material. Among infectious agents that could be present and transmitted by semen are leptospirosis and brucellosis, diseases that are responsible for numerous reproductive and economic losses in world’s cattle culture. The goals of this project were to molecularly detect these pathogens in bovine semen samples from Brazilian artificial insemination centers using a commercial kit for DNA extraction (RTP Bacteria DNA Mini Kit (Invitek®), to improve it for extracting bacterial DNA from semen and to analyze its applicability in laboratory routine. Bacterial DNA was extracted and quantified by agarose gel electrophoresis. We also intended to realize polymerase chain reaction (PCR) using primers B4 and B5 for amplification of Brucella spp. DNA and primers Lep 1 e Lep 2 for Leptospira spp. DNA. The extraction kit was successfully optimized and all of 96 examined samples were negative for any bacterial DNA. Results could be useful to establish alternative measures of sanitary control in semen donors and to allow the supplying of genetic material free of pathogens, increasing sanitary status of bovine reproduction in Brazil

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-06Bitstream added on 2014-06-13T20:35:30Z : No. of bitstreams: 1 brich_m_me_jabo.pdf: 460245 bytes, checksum: 3dd3a22b2996a7679b355cb0da04c9d3 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A uveíte em mamíferos tem sido relacionada à infecção por Leptospira spp., e, embora ocorra com maior frequência na espécie equina, já foi observada e relatada em outras espécies mamíferas, inclusive na humana. O objetivo deste trabalho foi investigar a relação entre a infecção por leptospiras e a ocorrência de alterações oculares em cães. Para a obtenção dos dados foram utilizados 32 cães, em idade reprodutiva, recolhidos pelo Centro de Controle de Zoonoses do Município de São José do Rio Preto, que apresentaram reação negativa, em duas provas de soroaglutinação microscópica (SAM) no intervalo de sete dias. Dos 32 cães, 20 foram inoculados com uma cepa patogênica de Leptospira interrogans sorovariedade Canicola e 12 formaram o grupo controle. Com a finalidade de avaliar as possíveis alterações do globo ocular post mortem, oito cães (cinco inoculados e três controles) foram sacrificados nos dias: sete, 15, 30 e 45 após o dia da inoculação. Amostras de humor aquoso, de um dos olhos de cada animal, foram retiradas para realização de PCR e SAM; o outro globo ocular foi retirado para realização de exame histopatológico e para a técnica de coloração de Levaditi. Nos dias zero, três, cinco, sete, 10 e após, a cada cinco dias, inclusive no dia do sacrifício, foram realizadas avaliações do estado físico do animal, do globo ocular e realizadas colheitas de sangue. O soro sanguíneo foi submetido à SAM para estabelecer os títulos obtidos em cada fase da infecção. Embora todos os animais tenham apresentado títulos sorológicos, indicando o sucesso da infecção, nenhum dos testes de detecção resultou positivo em até 45 dias de observação; no exame clínico apenas três animais apresentaram alterações perceptíveis: dois apresentavam irritação ocular, com hiperemia da esclera e um animal apresentava lacrimejamento... / Uveitis in mammals has been related to Leptospira spp. And although it occurs more frequently in the horse has already been observed and reported in other mammalian species, including the human. The aim of this study was to investigate the relationship between leptospira infection and the occurrence of ocular changes in dogs. To obtain the data were used 32 dogs in the reproductive age, collected by the Center for Zoonosis Control in São José do Rio Preto, which showed negative reaction in both tests of microscopic agglutination test (MAT) within seven days. Of the 32 dogs, 20 were inoculated with a pathogenic strain of Leptospira interrogans sorovar Canicola and 12 formed the control group. With the aim of assessing possible changes of the eye post mortem, eight dogs (five inoculated and three controls) were sacrificed on days: seven, 15, 30 and 45 days after inoculation. Samples of aqueous humor of one eye of each animal were removed for PCR, and MAT, and the other eye was removed for histological examination and the staining technique Levaditi. On days zero, three, five, seven, 10 and, thereafter, every five days, including the day of sacrifice, were assessed the physical condition of the animal, the eyeball and blood samples. The serum was subjected to SAM to establish the qualifications obtained at each stage of infection. Although all animals have serologic evidence indicating the success of infection, no detection tests resulted positive in up to 45 days of observation and by clinical examination only three animals showed noticeable changes: two had eye irritation with redness of the sclera and one animal showed tearing. We conclude that 45 days of infection with Leptospira interrogans sorovar Canicola are not enough to cause serious damage to the ocular system of dogs

O sistema complemento (SC) é um importante componente da imunidade inata na eliminação de patógenos. Suas proteínas reguladoras são necessárias para controlar a excessiva ativação sobre células próprias. Porém, alguns patógenos ligam a estas proteínas reguladoras para escapar do SC. A Leptospira spp. - agente etiológico do leptospirose - interage com Fator H e C4BP permitindo a evasão ao SC. As regiões SCR 7 e 8 da C4BP são responsáveis pela interação com proteínas LcpA e LigBC, e os SCRs 4, 7 e 8 são responsáveis pela interação com LigAC e L. interrogans íntegra. Estas interaçôes são dependentes de forças iônicas e inibidas por heparina. Outro importante regulador da via clássica e das lectinas é o inibidor de C1 esterase. Observamos sua a interação com leptospira atenuada, patogênica e não patogênica. Ensaios de sobrevivência de leptospira sugerem sua importância na sobrevida de leptospira atenuada, podendo ser utilizado como mecanismo de escape à via clássica e das lectinas do SC, sendo o primeiro mecanismo deste tipo, investigado em leptospiras. / Leptospirosis is a zoonosis caused by bacteria Leptospira. The Complement System plays a crucial role in the immune response against Leptospira. Non-pathogenic leptospira is eliminated by complement while pathogenic is able to avoid complement activation by the acquisition of host complement inhibitors Factor H and C4BP. We verified that SCR 7 and 8 of C4BP alpha chain are responsible to interaction with outer membrane proteins of L. interrogans LcpA and LigBC while SCR 4, 7 and 8 are responsible to interaction with LigAC and L. interrogans. We characterized this protein-protein interaction and verified that is ionic strength dependent and is inhibited by heparin. C1INH, another important regulator of classical and lectin pathways, interacts with the surface of leptospiras pathogenic, non-patogenic and attenuated and it is still able to regulates the classical pathway. We also performed a killing experiment and verified that C1INH is important to the survival of leptospiras attenuated, been the first complement system evasion mechanisms verified at this strain.

A leptospirose é uma zoonose mundial causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, que colonizam os túbulos renais de animais domésticos e silvestres e são liberadas ao ambiente externo pela urina. Neste estudo avaliou-se a interação de seis prováveis lipoproteínas de membrana externa de leptospira com as proteínas do hospedeiro: colágeno I, colágeno IV, elastina, fibrinogênio, fibronectina celular e plasmática, laminina e plasminogênio. Os experimentos de adesão demonstraram que as proteínas recombinantes Lp21, Lp22 e Lsa30 apresentaram interação com os componentes do hospedeiro de maneira dose-dependente. Estas aderiram à fibronectina plasmática e laminina, além destes, a Lp21 e a Lp22 interagiram com plasminogênio, a Lp22 e a Lsa30 interagiram com colágeno IV. A Lp22 aderiu à elastina e ao fibrinogênio. No estudo de conservação gênica, os genes que codificam estas proteínas foram observados somente nas Leptospiras patogênicas. Portanto estas proteínas devem contribuir na adesão aos tecidos do hospedeiro na patogênese da Leptospira. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira that colonize the renal tubules of wild and domestic animals and are excreted in the environment by their urine. The aim of this work was to study the interaction of six leptospiral probable outer-membrane lipoproteins with host proteins: collagen I, collagen IV, elastin, fibrinogen, cellular fibronectin, plasma fibronectin, laminin, and plasminogen. The binding experiments demonstrated that the recombinant proteins showed interaction with host components in a dose-dependent manner were Lp21, Lsa30 and Lp22. These proteins adhered to plasma fibronectin and laminin, in addition to these components, Lp21 and Lp22 interacted with plasminogen, Lp22 and Lsa30 interacted with collagen IV. The Lp22 adhered to elastin and fibrinogen. The genes encoding the probable lipoproteins were found only in pathogenic Leptospira. These results demonstrated that these proteins may contribute in the adhesion to host tissues, in the pathogenesis of Leptospira.

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial, com maior incidência nas regiões tropicais. As bactérias que causam a doença pertencem ao gênero Leptospira, família Leptospiracea e ordem Spirochaetales. A leptospirose é mantida na natureza pela colonização persistente dos túbulos renais proximais dos animais portadores. Uma estratégia adotada por estas espiroquetas para sobreviver à ação do sistema imune inato do hospedeiro é a capacidade que possuem de interagir com os reguladores do sistema complemento Fator H (FH) e proteína de ligação a C4b (C4BP). O sistema complemento é um componente vital da imunidade inata, uma vez que desempenha um papel crucial na defesa do hospedeiro, particularmente contra bactérias Gram-negativas. Dados recentes gerados por nosso grupo mostraram que C4BP interage com a proteína de superfície LcpA de Leptospira. Com cerca de 20 kDa, essa proteína é capaz de se ligar a C4BP purificado ou solúvel no soro de maneira dose-dependente. Uma vez ligado à proteína, C4BP permanece funcional agindo como cofator de Fator I na clivagem de C4b. O presente estudo teve como principal objetivo avaliar a interação da proteína LcpA com FH humano, principal regulador solúvel da via alternativa do sistema complemento. A proteína LcpA e suas porções N-Terminal, Intermediária e CTerminal recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade a metal a partir da fração insolúvel. A interação dessas proteínas com FH foi avaliada por dois métodos distintos: ELISA e Western blot com overlay. Os resultados indicaram que a porção C-Terminal da proteína LcpA é responsável pela interação com FH. Curiosamente, C4BP também se liga a esse domínio da proteína. Uma vez que esses dois reguladores solúveis do sistema complemento interagem com o mesmo segmento da LcpA, realizaram-se, a seguir, ensaios de competição com o objetivo de avaliar se ambos compartilhariam os mesmos sítios de interação. Os dados mostraram que FH e C4BP devem se ligar a sequências distintas desta proteína. Com o objetivo de se avaliar a funcionalidade de FH ligado à LcpA, realizou-se um ensaio para investigar sua atividade de co-fator de Fator I na clivagem de C3b. Produtos de degradação de 46 kDa e 43 kDa da cadeia α' de C3b foram detectados, indicando que FH permanece funcional. Em se tratando de uma proteína com funções relacionadas ao processo de evasão ao sistema imune inato, decidiu-se realizar ensaios de desafio em modelo de hamster com a finalidade de se avaliar seu potencial imunoprotetor. Os três ensaios realizados indicaram que a proteína não é capaz de conferir proteção. Os ensaios de ELISA visando à avaliação dos títulos de anticorpos mostraram que LcpA não é imunogênica, fato que explica os resultados dos ensaios de desafio observados. Portanto, embora interaja com moléculas do hospedeiro e pareça contribuir para o processo de evasão ao sistema imune inato, essa proteína de membrana não se mostrou promissora como candidato vacinal contra leptospirose. / Leptospirosis is a zoonosis of global distribution, with higher incidence in tropical areas. The bacteria that cause the disease belong to the genus Leptospira, family Leptospiracea and order Spirochaetales. Leptospirosis is maintained in nature by persistent colonization of proximal renal tubules of carrier animals. One strategy adopted by these spirochetes to escape from host´s innate immune system is the ability to interact with the complement regulators Factor H (FH) and C4b Binding Protein (C4BP). The complement system is a vital component of the innate immune system, being crucial for host´s defense, particularly against Gram-negative bacteria. According to our recent published data, C4BP interacts with the leptospiral surface protein LcpA. This 20 kDa outer membrane protein binds both purified and serum C4BP in a dose-dependent manner. Once bound, C4BP remains functional acting as a cofactor for Factor I in the cleavage of C4b. In the present study we evaluated the interaction of LcpA with human FH, the main soluble regulator of the alternative pathway of complement. The intact protein as well as its N-terminal, intermediate and C-terminal portions were purified by metal-affinity chromatography from the insoluble pellet. The interaction of these proteins with FH was evaluated by two distinct methods: ELISA and Western blot overlay. Our results indicate that the C-terminal domain of LcpA mediates interaction with FH, and also with C4BP. Since both complement regulators interact with the same fragment of LcpA, we next performed competition assays to assess if they would share binding sites. According to our data, FH and C4BP have distinct binding sites on LcpA. Cofactor activity of FH bound to immobilized LcpA was confirmed by detecting the C3b α' chain cleavage fragments of 46 and 43 kDa upon incubation with Factor I, thus indicating that it remains functionally active. Given the LcpA´s role in host´s innate immune evasion, we also evaluated its vaccine potential in a hamster model. Data from three challenge assays indicated that the protein can not afford protection. Low ELISA antibody titers of hamsters immunized with LcpA were observed, which strongly suggests that this protein is not immunogenic. In conclusion, LcpA interacts with host´s molecules and seems to contribute to the bacterial immune evasion. Nevertheless, this outer membrane protein is not a promising vaccine candidate against leptospirosis.