Le microenvironnement, composé de différents éléments cellulaires et de la matrice extracellulaire, joue un rôle primordial dans le développement tumoral et la dissémination métastatique. Ainsi, l'étude de ces interactions cellulaires est importante pour que des thérapies ciblées luttent contre la chimiorésistance des cellules tumorales. Ce travail de thèse a pour but d'étudier le rôle du facteur de croissance IGF-I dans la chimiorésistance des cellules du cancer de l'ovaire et des leucémies myéloïdes présente au sein du microenvironnement.Dans un premier temps, nous avons mis en évidence que la chimiorésistance des cellules du cancer de l'ovaire, acquise grâce aux cellules hôtes (hospicells), est liée à la sécrétion de IGF-I par ces cellules. Nous avons également montré que IGF-I est impliqué dans la régulation de certains gènes ABC (MDR-1, MRP1, MRP2, et BCRP) via les voies de STAT3, Jak2, PI3K et ERK.Dans les leucémies myéloïdes, nous avons montré que IGF-I a un effet sur la prolifération des cellules tumorales. Il induit l'expression de la protéine P-gp ainsi que la chimiorésistance des cellules sensibles à la chimiothérapie. Nous avons également déterminé le rôle de IGF-I dans la résistance des cellules leucémiques en présence des hospicells. Ces dernières ont une activité hyperangiogénique in vivo, lié à l'HIF-1 et au VEGF, et inhibent les réponses immunes des lymphocytes T par production de NO.Nous avons déterminé le rôle crucial de MMP-9 dans la migration des cellules résistantes du cancer du sein exprimant la protéine P-gp et dans la formation d'un réseau tubulaire, suggérant un lien existant entre l'expression de P-gp et de MMP-9.

Le rôle de l'environnement dans l'étiologie des leucémies aigües de l'enfant (LA) fait aujourd'hui l'objet de recherches intenses. Dans ce contexte, le présent travail a pour objectif d'étudier la relation entre l'incidence de LA et la proximité des centrales nucléaires de production d'électricité (CNPE) et des lignes à haute tension (LHT). Avant cette analyse fine, un premier travail a consisté à étudier les variations départementales de l'incidence de LA.Les cas inclus dans ces études sont toutes les LA du Registre National des Hémopathies malignes de l'Enfant sur la période étudiée : 1990-2004 pour l'étude de l'incidence départementale et 2002-2007 pour les études de l'association avec les facteurs d'exposition environnementale. Dans l'approche cas-témoins principalement utilisée pour ces dernières, les 30 000 sujets témoins constitue un échantillon représentatif de la population pédiatrique française sur la période d''intérêt. D'autre part, la géolocalisation des adresses des sujets et des sources d'exposition permet de définir des critères de proximité en relation avec la probabilité et/ou l'intensité d'exposition aux facteurs d'intérêt. * L'étude des LA par département n'a pas mis en évidence de tendance ni de structure spatiale dans l'incidence à ce niveau géographique : que ce soit globalement, par classe d'âge, par sexe ou par sous-type de leucémie. * Sur la période 2002-2007 contrairement aux périodes précédentes, un quasi-doublement de l'incidence des LA à moins de 5 km des CNPE a été mis en évidence, avec une approche cas-témoin comme avec l'étude d'incidence. Ce résultat n'était pas spécifique d'une CNPE ou d'un type de CNPE et non lié à la cartographie des émissions aériennes de radioactivité par les CNPE. * L'association trouvée entre l'incidence de LA et la proximité aux LHT de plus de 225 kV (<50 m) semble restreinte aux enfants de moins de 5 ans ou n'habitant en milieu urbain ; aucune association n'a été trouvée avec la proximité aux LHT de moins de 150 kV.

La leucémie myéloïde aigue (LMA), cancer du sang causé par une prolifération excessive des précurseurs myéloïdes à un stade précoce de maturation, est associée à une survie variant entre 20 et 30% à cinq ans en dépit des traitements de chimiothérapie les plus intensifs. L’antigène CD33 est exprimé chez les cellules malignes dans 90% des LMA ce qui en fait une cible de choix pour le développement d’immunoconjugué (IC). Trois IC composés d’un anticorps monoclonal anti-CD33 couplé à la maytansine, une toxine s’attaquant aux fuseaux mitotiques, ont été créés. Nous avons étudié l’effet de ces IC sur des cellules primaires et des lignées cellulaires LMA et étudier les mécanismes pouvant expliquer différents niveaux de sensibilité. Les études effectuées ont permis de déterminer que le niveau d’expression du CD33 n’explique pas la variation de sensibilité face aux IC. Il a été démontré que les IC anti-CD33 sont internalisés rapidement par la cellule et que le conjugué est retrouvé au niveau de l’endosome en premier lieu. Il a été confirmé que le lysosome est essentiel à l’effet anti-mitotique induit par le conjugué. Aussi, il est proposé que la protéine SOCS3 pourrait jouer un rôle dans la résistance aux IC anti-CD33 en dirigeant le complexe IC-CD33-SOCS3 vers le protéasome et ainsi empêcher la libération du composé toxique par le lysosome. Nous avons aussi conclu que les variations d’agent de liaison et l’augmentation du nombre de molécules toxiques entre les 3 IC n’ont pas été suffisantes pour augmenter leur efficacité à éliminer les cellules LMA. L’évaluation de ces IC ainsi que l’identification des mécanismes de résistance permettra de cibler les patients les plus susceptibles de bénéficier de ce type de traitement et potentiellement d’identifier de nouvelles voies pour améliorer l’efficacité des traitements. / Acute myeloid leukemia (AML), a cancer where hematopoietic precursors are arrested in an early stage of development, is associated with a poor survival rate of 20 to 30% over five years, despite intensive chemotherapy treatments. In approximately 90% of AML cases the malignant cells express CD33 antigen, which makes it a target of choice for development of immunotoxin based therapy. Three immunoconjugates (IC) composed of anti-CD33 monoclonal antibody coupled with maytansine derivative, which prevent tubulin polymerization and thus formation of mitotic spindle, were designed. These three IC were tested for their activity against several AML cell lines and primary AML patient cells and we investigate mechanisms responsible for variation in sensitivity to IC treatment. In this report, we show that differences in number of CD33 molecules on AML cell surface does not explain the observed differences in IC sensitivity. We demonstrate that binding of huMy9-6 antibody to CD33 induces rapid internalization and that it is first process through endosome. We confirm that lysosomal processing is essential for the antimitotic effect induced by IC treatment. Also, we provide evidence that SOCS3 protein may play a role in resistance of AML cells to anti-CD33 therapy by directing IC-CD33-SOCS3 complex to the proteasome and therefore affecting lysosomal decoupling of IC-CD33 and intracellular release of maytansine derivatives. Finally, the linkers and maytansine derivative modifications were not sufficient to increase sufficiently the efficacy of conjugates to eliminate higher numbers of AML cells. The identification of mechanisms responsible for increased resistance of AML cell lines and primary AMLs may allow us to identify IC responsive AML cells and also identify strategies to improve the efficacy of IC treatment.

Les longs ARN non codants (lncRNAs) sont définis comme des transcrits de plus de 200nt et n'ayant pas de potentiel codant. Des études récentes ont démontré que les lncRNAs pouvaient être impliqués dans la régulation de la transcription, de la traduction, de la différenciation cellulaire, de l'expression génique, du cycle cellulaire et des modifications de la chromatine. De plus, il a été montré un impact fonctionnel de certains lncRNAs dans le processus de cancérogenèse mais nos connaissances actuelles sur ces molécules dans le cancer, et plus particulièrement dans la leucémie, restent extrêmement limitées. Au cours de cette étude, nous avons analysé l'expression des lncRNAs par RNA-sequencing sur 40 patients atteints de leucémie aiguë myéloblastique (LAM) à caryotype normal. Parmi les 11065 lncRNAs exprimés dans nos échantillons, nous avons identifié une signature de lncRNAs associée à la mutation de NPM1. Afin de mettre en évidence les fonctions putatives des lncRNAs sélectionnés, nous avons utilisé un algorithme de prédiction d'interaction protéine/ARN. De manière intéressante, plus de la moitié des lncRNAs présentent des sites d'interactions potentiels à SUZ12, une sous unité du complexe PRC2 (Polycomb repressive complex 2), connu pour être recruté par des lncRNAs pour la régulation épigénétique de gènes cibles. Par RNA immunoprécipitation (RIP) de SUZ12, nous avons pu démontrer que le lncRNA XLOC_087120 interagissait avec SUZ12. De plus, son expression est anti-corrélée avec celle des gènes voisins codants des histones, suggérant un rôle dans la régulation négative des histones par ce lncRNA. L'impact de la dérégulation de XLOC_087120 sur les histones a été confirmé par des expériences de surexpression et d'inhibition de ce lncRNA dans des lignées de LAM. De plus, même si la mutation NPM1 ne semble pas affecter directement l'expression de ce lncRNA, des expériences d'infection de la forme mutée de NPM1 dans une lignée LAM ont montré que NPM1 pourrait réguler la localisation nucléaire/cytoplasmique de XLOC_087120 et moduler sa fonction de répresseur. En conclusion, ces données suggèrent que les lncRNAs sont des facteurs clés dans la pathogenèse des LAMs. / Long noncoding RNAs (lncRNAs) are defined as RNA transcripts that are larger than 200 nt but do not appear to have protein- coding potential. Recent studies have demonstrated that lncRNAs regulate many processes such as transcription, translation, cellular differentiation, gene expression regulation, cell cycle regulation, and chromatin modification. Cumulative evidence points towards an important role of lncRNAs in cancer initiation, development, and progression. However, our overall knowledge of lncRNAs in cancer, including leukemia, remains extremely limited. In this study, we investigated lncRNA expression by RNA-sequencing in 40 acute myeloid leukemia (AML) patients with normal karyotype. Among 11065 lncRNA expressed in our samples, we identified specific lncRNA signature associated with the presence of NPM1 mutation. To go further into the putative function of these lncRNAs, we used catRAPID Omics algorithm to predict potential protein partners. Interestingly, the majority of the selected lncRNAs contains putative SUZ12 binding sites, a PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) component known to be linked to lncRNAs and to epigenetically regulates target genes. By using SUZ12 RNA Immunoprecipitation, we identify one lncRNA named XLOC_087120 linked to SUZ12. XLOC_087120 is located in a region enriched in histone genes. Pearson correlation showed a significative anti-correlation between XLOC_087120 and histone neighboring coding gene expression suggesting a role of this lncRNA in the regulation of histone genes. The impact on histone genes expression was confirmed by overexpression and inhibition of XLOC_087120 in AML cell lines. Overexpression of NPM1 mutant in an AML cell line showed that NPM1 modulates the nuclear/cytoplasmic localization of XLOC_087120 and consequently its repressive function. Altogether, these data suggest that lncRNAs should be considered as key players in the pathogenesis of acute myeloid leukemias.

Les dérivés de la cytosine sont d’importantes modifications épigénétiques dont le rôle dans l’évolution de la leucémie lymphoïde chronique (LLC) n’est pas totalement exploré. Dans ce contexte, notre première étude vise à examiner le niveau global de la 5-methylcytosine (5-mCyt), 5-hydroxymethylcytosine (5-hmCyt), 5-carboxylcytosine (5-CaCyt) et 5-hydroxymethyluridine (5-hmU) dans des lymphocytes B purifiés de patients LLC (n=56) et d’individus sains (n=17). Les principaux acteurs de la régulation épigénétique (DNMT1/3A/3B, MBD2/4, TET1/2/3, SAT1) ont été évalués par PCR quantitative en temps réel. L’analyse a permis de mettre en exergue trois groupes de patients. En premier lieu, un groupe de patients stables (délai médian de progression [PFS] et délai au premier traitement [TFT] >120 mois), avec un profil épigénétique similaire au groupe contrôle. Deuxièmement, un groupe intermédiaire (PFS=84; TFT=120 mois) qui présente une augmentation de la déméthylation de l’ADN expliquée par l'induction SAT1 / TET2 pendant la progression de la maladie. Troisièmement, un groupe de patients avec une forme active de la maladie (PFS=52; TFT=112 mois) qui présentent une hyperlymphocytose, une réduction du temps de doublement des lymphocytes et des modifications épigénétiques majeures. Au sein de ce groupe, une réduction est observée pour la 5-mCyt, 5-hmCyt, 5-CaCyt et serait associée à une diminution des DNMTs, TETs et MBDs au cours de la progression de la maladie. Les profils épigénétiques mis en évidence sont indépendants du statut mutationnel IGHV mais sont associés avec les anomalies cytogénétiques. Nous nous sommes également intéressés à cette association et nous avons montré dans la deuxième étude que les modifications des dérivées de la cytosine peuvent affiner le pouvoir pronostic des anomalies cytogénétiques. En conclusion, nos résultats suggèrent que les variations de la méthylation ainsi que des intermédiaires de la déméthylation de l’ADN sont impliqués dans la progression de la LLC. / Cytosine derivatives are important epigenetic modifications whose role in the pathogenesis and evolution of chronic lymphocytic leukemia (CLL) is not fully explored. In this context, our first study aims to examine the global DNA level of 5-methylcytosine (5-mCyt), 5-hydroxymethylcytosine (5-hmCyt), 5-carboxylcytosine (5-CaCyt) and 5-hydroxymethyluridine (5-hmU) in purified B lymphocytes of CLL patients (n = 56) and healthy individuals (n = 17). The main actors in epigenetic regulation (DNMT1 / 3A / 3B, MBD2 / 4, TET1 / 2/3, SAT1) were evaluated by quantitative real time PCR. The analysis highlighted three groups of patients. First, a group of patients with stable disease (median time to progression [PFS] and time to first treatment [TFT]> 120 months), with an epigenetic profile similar to the control group. Secondly, an intermediate group (PFS = 84, TFT = 120 months) which shows an increase in DNA demethylation explained by SAT1 / TET2 induction during disease progression. Third, a group of patients with an active form of the disease (PFS = 52, TFT = 112 months) who have hyperlymphocytosis, a short lymphocyte doubling time, and major epigenetic changes. Within this group, a reduction is observed for 5-mCyt, 5-hmCyt, 5-CaCyt which is associated with a decrease in DNMTs, TETs and MBDs during disease progression. The identified epigenetic profiles are independent of IGHV mutational status but are associated with cytogenetic abnormalities. We were also interested in this association and we showed in the second study that modifications of cytosine derivatives levels can refine the prognostic power of cytogenetic abnormalities.In conclusion, our results suggest that methylation variations as well as DNA demethylation intermediates are involved in the progression of CLL.

La duplication interne en tandem au sein du gène du Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) est l’une des mutations les plus fréquemment observées dans les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM). Elle est corrélée à un mauvais pronostic. Des inhibiteurs de tyrosine kinase anti-FLT3 (FLT3-ITK) sont en cours de développement mais les premiers essais cliniques ont été décevants. Les rémissions sont de courte durée, et si une clairance leucémique sanguine est observée, la LAM persiste au sein de la moelle osseuse. Dans ce travail, nous avons démontré que les cytokines activatrices de STAT5, telles que l’interleukine-3 et la thrombopoïétine, et les basses pressions en oxygène, telles que celles observées au sein de la niche hématopoïétique augmentent l’expression et l’activité du récepteur tyrosine kinase AXL qui protège les cellules de LAM FLT3-ITD de l’apoptose induite par le FLT3-ITK quizartinib (AC220). Nous avons démontré dans un modèle murin que les cellules de LAM FLT3-ITD « knock-down » pour AXL sont plus sensibles au quizartinib, et que cette différence se révèle spécifiquement dans un modèle de prise de greffe hématopoïétique. La combinaison de stratégies inhibitrices du FLT3-ITD et d’AXL permettra d’améliorer l’efficacité des FLT3-ITK en atteignant la fraction de cellules responsable des rechutes, nichée dans son microenvironnement. A l’issue, nous avons démontré que le gilteritinib (ASP2215), double FLT3/AXL-ITK est plus efficace que le quizartinib pour atteindre ces cellules leucémiques médullaires. Enfin, nous avons démontré que la combinaison d’un anticorps monoclonal anti-AXL avec un FLT3-ITK ou de la cytarabine était une stratégie thérapeutique prometteuse dans les LAM FLT3-ITD ou sauvage. / Internal tandem duplication in Fms-like tyrosine kinase 3 gene (FLT3-ITD) is the most frequent mutation observed in acute myeloid leukemia (AML), and correlates with poor prognosis. FLT3 tyrosine kinase inhibitors (FLT3-TKI) have been promising for therapeutic strategies but clinical trials have revealed rarely long-lasting remission with persistent leukemic cells present in the bone marrow. In this work, we show that the hematopoietic niche microenvironment protects FLT3-ITD AML cells from FLT3-TKI quizartinib (AC220) through convergent up-regulation of AXL expression and activity. Cytokine-dependent activation of STAT5 enhances AXL gene transcription and expression, while low O2 concentration up-regulates AXL protein levels. Moreover, cytokines such as thrombopoietin or interleukin-3 directly activate AXL. RNA interference-based inhibition of AXL expression in FLT3-ITD AML cells allowed a selective purge of leukemic cells within their microenvironment when combined with FLT3-TKI in immuno-compromised mice. Altogether, our data support a strategy combining FLT3-TKI and anti-AXL therapy to eradicate FLT3-ITD AML cells, including those protected by the hematopoietic niche. In such a setting, we performed a study to test the efficacy of gilteritinib (ASP2215) and we showed in vitro and in vivo that this dual FLT3/AXL-TKI is more efficient to eradicate leukemic cells in their microenvironment than quizartinib which is a more specific FLT3-TKI. Finally, we also studied an anti-AXL monoclonal antibody on primary AML cells and showed that its efficacy could be interesting with FLT3-TKI and cytarabine in both FLT3-wild type and FLT3-ITD AML.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) constitue l'hémopathie maligne la plus fréquente dans les pays occidentaux et résulte d’une accumulation de lymphocytes B (LB) monoclonaux matures porteurs de la glycoprotéine CD5. Les LB de LLC sont également caractérisées par une altération de l'homéostasie du calcium avec, d'une part, la mise en évidence de facteurs de survie contrôlés par le calcium tels que phospho-ERK, NFAT-2 et IL-10, et d'autre part par une progression de la maladie qui est associée à la réponse au calcium. Tout d'abord, afin de mieux comprendre l'impact de la molécule CD5 sur les dérégulations du calcium, il a été montré que l'introduction d'un plasmide d'expression pour CD5 dans les lignées de cellules B humaines s'accompagnait d'une entrée calcique à l’état basale. Ensuite, cette entrée, appelée entrée constitutive, a été recherchée dans les LB de LLC pour montrer qu'elle caractérisait les patients non traités en phase d'évolution. Comme pour les lignées de cellules B CD5, cette nouvelle voie d'entrée du calcium est autonome et indépendante de la voie classique de signalisation du LB de LLC : BCR-IP3R. L'étude des protéines responsables de cet influx a permis de mettre en évidence, premièrement trois partenaires STIM1, Orai1 et TRPC1, et deuxièmement l'importance de la fraction membranaire de STIM1 (STIMPM) puisque l'utilisation d'un anticorps monoclonal anti-STIM1 (Acm) est capable d’inhiber l'entrée constitutive du calcium qui à son tour agit sur la survie des LB, pour les patients STIMPM positifs, lorsque l'Acm anti-STIM1 est utilisé en association avec le rituximab, un Acm thérapeutique anti-CD20. Enfin, la modélisation de la partie Cterminale de STIM1 permet d'envisager plusieurs cibles potentielles pour le développement de nouveaux Acm anti-STIM1. En conclusion, la mise en place, par le clone malin de LLC, d'une entrée constitutive du calcium favorise son agressivité et constitue donc une nouvelle voie thérapeutique contrôlable par l'utilisation d’Acm anti-STIM1 ce qui ouvre de nouvelles perspectives comme outils diagnostiques et thérapeutiques. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common hematological malignancy in Western countries and is a result of the accumulation of mature monoclonal B lymphocytes (B-CLL) carrying the CD5 glycoprotein. The B-CLL are also characterized by an alteration of calcium homeostasis with, on the one hand, the demonstration of calcium-controlled survival factors such as phospho-ERK, NFAT- 2 and IL-10, and on the other hand by a progression of the disease which is associated with the response to calcium. Initially, in order to better understand the impact of the CD5 molecule on calcium deregulations, it has been shown that the introduction of an expression plasmid for CD5 into human B cell lines was accompanied by a calcium entry in the basal state. Then, this entry, called constitutive entry, was sought in the B-CLL to show that it characterized untreated patients in the evolution phase.As with CD5 B cell lines, this new calcium entry pathway is autonomous and independent of the classical B-CLL signaling pathway: BCR-IP3R. The study of the proteins responsible for this influx made it possible to highlight, firstly three partners (STIM1, Orai1 and TRPC1), and secondly the importance of the membrane fraction of STIM1 (STIMPM) since the use of a human monoclonal antibody (mAb) anti-STIM1 is able to inhibit the constitutive entry of calcium which in turn acts on the survival of B-CLL, for STIMPM positive patients, when the anti-STIM1 mAb was used in combination with rituximab, a therapeutic anti-CD20 mAb. Finally, the modeling of the C-terminal part of STIM1 makes it possible to envisage several potential targets for the development of new anti-STIM1 mAbs. In conclusion, the introduction by the CLL malignant clone of a constitutive entry of calcium favors its aggressiveness and thus constitutes a new therapeutic pathway controllable by the use of anti-STIM1 mAb, which opens new perspectives like diagnostic and therapeutic tools.

Les leucémies aigues myéloïdes (LAM) dérivent de progéniteurs hématopoïétiques dans lesquels se sont accumulés des événements génétiques conduisant à leur transformation. En établissant la hiérarchie clonale de multiples lésions récurrentes, nous démontrons que les événements impliquant les régulateurs de l'épigénétique sont les premiers événements dans le clone. A l'inverse, les mutations régulant la prolifération se produisent tardivement. Les événements précoces sont quasi constamment détectables en rémission complète. Les clones qui persistent servent de réservoir pour les rechutes, avec une variation qui augmente avec la durée de la rémission. Après xénogreffe, les échantillons de patients porteurs de lésions épigénétiques sont capables de repopulation hématopoïétique, ce qui est la signature fonctionnelle des événements pré-leucémiques. Cette hiérarchie est observée chez la majorité des patients. Cependant dans 1/3 des cas, il n'est pas retrouvé d'événement épigénétique, et on observe notamment des prédispositions germinales aux LAM, ou des mutations acquises de TP53. Chez 3 patients avec des LAM de novo, les mutations de TP53 sont associées à des mutations de DNMT3A dans un même clone. Cela suggère que les mutations de DNMT3A et de TP53 sont complémentaires pour obtenir une dominance clonale pré leucémique. En conclusion, dans la majorité des LAM, des hiérarchie clonales récurrentes, initiées par des lésions pré-leucémiques variées vont promouvoir l'expansion ou la variation clonale, jusqu'à l'émergence de la maladie. Ces données sont essentielles pour le développement de nouvelles stratégies personnalisées de suivi de la maladie résiduelle. / Acute myeloid leukaemia (AML) emerge from haematopoietic stem/progenitor cells that acquiregenomic or chromosomal aberrations, some being considered as pre-leukemic lesions. Here, byestablishing the chronological hierarchy of multiple driver lesions in AML, we show that most eventsaffecting epigenetic regulators - DNMT3A, TET2, ASXL1 mutations, as well as MLL and chromosome20q rearrangements - are the first lesions in the clone. In contrast to late mutations involving signallingpathways such as FLT3 or RAS, these early lesions are frequently detectable in complete remissionsample. By studying late relapses, we show that persistent clones behave as long-term relapsereservoirs, and variegate increasingly with delay to relapse. Cells from patients with early epigeneticdefects can repopulate bone marrow of xenotransplanted NOD/SCID/IL-2Rgc-null (NSG) mice withleukemic or non leukemic engraftment, a functional signature of pre-leukemic events. This genetichierarchy is observed in most patients but in one third of them lesions in epigenetic regulators are notthe first events. Some of these patients have genetic predisposition, or somatic mutations in TP53. Inthree de novo AMLs, but not in three secondary or therapy-related AMLs, these TP53 mutations wereaccompanied by DNMT3A mutations in a unique clone. This suggests that DNMT3A mutations maycomplement TP53 mutations to generate a dominant pre-leukemic clone. We conclude that in mostAMLs recurrent genetic hierarchies, initiated by distinct pre-leukemic lesions, promote progressiveclonal expansion or variegation, leading to the development of a full blown disease. These data areessential for the development of new personalised strategies for MRD evaluation.

La Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) est une maladie clonale caractérisée par la présence du chromosome Philadelphie codant pour Bcr-Abl, une tyrosine kinase constitutivement active responsable de la leucémogenèse. Bien que très efficaces, les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITKs) restent cependant inactifs sur les cellules souches leucémiques. Ce travail de thèse montre que la signalisation calcique, connue pour réguler de nombreux processus dans les cellules saines et cancéreuses, est importante dans la signalisation cellulaire au décours de la LMC. Le rôle des entrées calciques dépendantes des stocks (SOCEs) médiées par STIM1 (STromal Interaction Molecule 1) et les canaux Orai1 et TRPC1 ainsi que des entrées calciques induites par la thrombine a été étudié dans la leucémogenèse. Nous avons observé une diminution de ces entrées dans les cellules exprimant Bcr-Abl pouvant être expliquée par le changement de stœchiométrie Orai1/STIM1. Ceci entraîne la diminution de l'activation de NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells) ainsi que des conséquences sur la prolifération et la migration cellulaire mais pas sur l'apoptose. De plus, les SOCEs sont restaurées dans les cellules cancéreuses après traitement à l'Imatinib, le principal ITK. Nous proposons alors que l'expression de Bcr-Abl joue un rôle sur l'homéostasie calcique en entraînant une dérégulation générale des fonctions cellulaires dans les cellules leucémiques notamment via la voie PKC (Protein Kinase C). Ainsi, ces résultats montrent une dérégulation des entrées calciques dans les cellules exprimant Bcr-Abl, suggérant que la signalisation calcique puisse être une cible thérapeutique en parallèle avec les ITKs. / Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a clonal disease characterized by the presence of the Philadelphia chromosome encoding for Bcr-Abl, a constitutively active tyrosine kinase responsible for leukemogenesis. Although Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitors (TKIs) have revolutionized the therapy of Ph+ leukemia, the complete eradication of CML is limited by the emergence of resistance in hematopoietic stem cells. This thesis proposes that calcium (Ca2+) signaling pathways, known to govern a large number of functions in normal and cancer cells, may be important in CML cell signaling. Therefore, we studied the role of Store Operated-Calcium entry (SOCE) (i.e. STromal Interaction Molecule 1 (STIM1), Orai1 and TRPC1 channels) and thrombin induced Ca2+ entry in leukemogenesis. We found a decrease in both calcium entries in Bcr-Abl-expressing cells compared to normal cells. The reduced SOCE seems related to a change in stoichiometry of Orai1/STIM1. This leads to a reduction of the Nuclear Factor of Activated T-cells (NFAT) translocation and functional consequences on cell proliferation and migration but not on apoptosis. Moreover, we showed that SOCE is restored in malignant cells after treatment with Imatinib, the main TKI. We proposed that Bcr-Abl expression could impact on Ca2+ homeostasis enhancing a general disorganization of cell functions in leukemia cells notably via Protein Kinase C (PKC) pathway. Altogether this work shows a deregulation of Ca2+ entry in Bcr-Abl-expressing cells, suggesting that the Ca2+ signaling pathway could be a therapeutic target in parallel with TKIs.

Des lésions de l’ADN sont impliquées dans les mécanismes de l’oncogenèse. De plus, la prolifération incontrôlée des cellules tumorales induit l’accumulation d’aberrations géniques. En réponse à ce stress génotoxique, les cellules en transformation expriment les ligands NKG2D MICA et MICB, molécules du CMH de classe I non conventionnelles qui activent une réponse cytotoxique T et NK contre cette transformation. Dans les syndromes lymphoprolifératifs chroniques, les mécanismes de la leucémogenèse reposent essentiellement sur une stimulation antigénique ou une activation des voies du récepteur à l’antigène (BCR) qui induit la prolifération cellulaire. De plus, les ligands MICA/B ne sont pas retrouvés à la surface de ces cellules. Les objectifs de cette thèse sont (i) rechercher si l’activation de la prolifération lymphocytaire peut induire l’expression de MICA/B et (ii) étudier les mécanismes induisant cette expression et leurs liens avec les voies de lésions/réparations de l’ADN. Pour cela, nous avons mis en place des conditions d’activation du récepteur à l’antigène permettant d’obtenir une prolifération (objectivée après marquage par CFSE) de lymphocytes B sains et de lymphocytes issus de patients porteurs de leucémie lymphoïde chronique (LLC), la plus fréquente des leucémie de l’adulte. L’expression des ligands MICA et MICB a ensuite été évaluée par qPCR, cytométrie en flux, western blots et ELISA. L’implication des différentes voies de signalisation en aval du récepteur à l’antigène a été analysée, ainsi que la cinétique d’apparition des lésions de l’ADN durant ce processus. Mes résultats montrent que MICA/B ne sont pas exprimés à la surface des lymphocytes B issus de donneurs sains ou de patients porteurs de LLC. Cependant, l’activation de la prolifération lymphocytaire induit une activation transcriptionnnelle de MICA ainsi que son expression à la surface de ces cellules. Cette expression est induite par différentes voies du récepteur à l’antigène ainsi que par la voie JAK/STAT et est indépendante des lésions de l’ADN qui surviennent plus tardivement dans la cellule. Au total, l’activation du récepteur à l’antigène qui induit la prolifération lymphocytaire induit également l’expression du ligand MICA (et non MICB) à la surface des lymphocytes sains et cette capacité d’expression est conservée dans les cellules de LLC qui ne l’expriment pas. Ces résultats suggèrent que MICA pourrait jouer un rôle crucial aux stades précoces de l’immunité anti-proliférative, ce qui ouvre la voie à de potentielles applications thérapeutiques. / Tumor cell’s uncontrolled proliferation induces an accumulation of genetic aberrations. In response to this genotoxic stress, most cells in transformation express NKG2D ligands (not expressed on resting cells), including MICA and MICB, which are non-conventional MHC class I molecules that could induce a cytotoxic T and NK response against the transformed cell. In chronic lymphoproliferative conditions, leukemogenic mechanisms rely in part on antigenic stimulations and/or activation of the B cell antigen receptor (BCR) pathways that induce cell proliferation. My thesis aims at studying : (i) the induction of MICA/B expression during lymphocyte proliferation and (ii) the mechanisms inducing this expression and their relationship with the DNA damage/repair pathways.I did generate BCR activation conditions to obtain B cells proliferation from healthy control individuals and from patients suffreing from chronic lymphocytic leukemia (CLL), the most common leukemia in adults. MICA and MICB expression was assessed by quantitative PCR, flow cytometry, Western blotting and ELISA after activation of B-cell proliferation. The different signaling pathways downstream BCR were analyzed, as were the kinetics of the DNA damage during this process. The results show that MICA/B aren’t expressed on cell surface of B cells from healthy control individuals or CLL patients before activation. Lymphoproliferative stimulation however up-regulates both MICA mRNA and surface protein in these same cells. This expression was induced by several BCR and by JAK/STAT pathways and seems to be indpendant of DNA damage. In conclusion, antigen receptor activation that induces lymphocyte proliferation also induces MICA expression (but not MICB) on B cells surface from healthy control individuals and this expression capacity is conserved in B cells from patients suffering from CLL. These results suggest that MICA may play a crucial role in the early stages of anti-proliferative immunity, which opens the avenue for therapeutic interventions.