La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) représente environ 25% des cancers pédiatriques diagnostiqués chaque année. Dans 80 % des cas, une rémission complète est observée. Cependant, les patients résistants aux traitements ainsi que les patients en rechute présentent un mauvais pronostique. Les altérations épigénétiques sont des facteurs essentiels dans le développement et la progression de la maladie, ainsi qu’à la résistance aux traitements. Lors d’un criblage de médicaments approuvés par la FDA, nous avons découvert des molécules ayant des caractéristiques anticancéreux et épigénétiques. Pour évaluer l’activité de ces molécules, nous avons procédé à un criblage secondaire sur plusieurs lignées cellulaires leucémiques. Nous avons découvert qu’une de ces molécules, un glucoside cardiotonique appelé la proscillaridine A, avait une activité anticancéreuse spécifique pour des cellules leucémiques. Nous faisons donc l’hypothèse que la proscillaridine A pourrait avoir des effets épigénétiques et anticancéreux dans des modèles précliniques de LLA. Pour tester cette hypothèse, nous avons traité deux lignées cellulaires de LLA Nalm-6 (LLA pre-B) et Molt-4 (T-LLA) in vitro pendant 2 à 96 heures à des doses pertinentes sur le plan clinique. Nous avons alors pu observer une inhibition de croissance qui était dépendante de la dose administrée dans les deux lignées cellulaires, avec des valeurs de 50% d’inhibition de croissance (CI50) de 3.0 nM pour les Nalm-6 et de et 2.3 nM pour les Molt-4. De plus, nos études sur le cycle cellulaire par BrdU démontrent un arrêt en phase G2/M. Nous avons également détecté par immunobuvardage de type western des baisses significatives de l’acétylation de résidus de l’histone 3. Les niveaux d’expression des enzymes responsables de cette acétylation, les histones acétyltransférases CBP, P300 et TIP60 ainsi que de l’oncogène C-MYC étaient également diminuées. Par des analyses de séquençage de l’ARN, nous avons observé une augmentation de l’expression des gènes impliquées dans les processus d’apoptose et de différentiation cellulaire, ainsi qu’une diminution des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire comme en particulier les gènes cibles de C-MYC. Ces résultats prometteurs suggèrent le potentiel prometteur de la proscillaridine A comme nouvelle thérapie pour les patients atteints de LLA. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) represents approximately 25% of all pediatric cancers diagnosed every year. In about 80% of cases, pediatric patients will attain a 5-year event-free survival. Unfortunately, patients who are resistant to treatment or who relapse have a poor prognosis. Hence, novel therapeutic approaches are necessary to increase survival rates. Epigenetic alterations, such as DNA methylation and histone modifications, are involved in disease development, progression, and in particular, resistance to treatment. These reversible alterations represent novel targets in ALL. We recently discovered candidate epigenetic drugs in FDA-approved drug libraries. We performed a secondary screen to test the activity of these drugs in a panel of cancer cell lines. We found that a cardiac glycoside, called proscillaridin A, had anticancer specificity against pediatric leukemia cell lines. Thus, we hypothesize that proscillaridin A has some drug repositioning potential in pediatric ALL. To characterize its epigenetic mechanism of action, we treated two ALL cell lines Nalm-6 (pre-B ALL) and Molt-4 (T-ALL) in vitro for different time points (2-96h) with clinically relevant concentrations of proscillaridin A and analyzed cell growth, cell cycle, gene expression and chromatin modifications. We observed dose-dependent growth inhibition in both cell lines, where 50% of growth inhibition (IC50) was obtained at 3.0 and 2.3 nM in Nalm-6 and Molt-4, respectively. Our results using BrdU staining indicate a cell cycle block in the G2/M phase. By western blot, we detected significant decreases in histone 3 acetylation levels (H3K14ac, H3K9ac, and H3K27ac). Decreases in histone acetylation were associated with a significant reduction in histone acetyltransferase expression (CBP, P300 and TIP60) as well as the CMYC oncogene. By RNA sequencing and gene set enrichment analysis, we observed an upregulation of apoptosis and cell differentiation genes, as well as a decrease in cell proliferation and C-MYC target genes. These promising results illustrate the potential of using the cardiac glycoside proscillaridin A as a novel drug in treatment of relapsed or refractory ALL.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le traitement de première ligne des leucémies aiguës myéloblastiques (maladie définie par la présence, dans la moelle osseuse hématopoïétique, de cellules blastiques représentant plus de 30% des cellules médullaires) associe classiquement l'aracytine à un inhibiteur de la topoisomérase II, en particulier une anthracycline. Ce traitement permet d'obtenir une rémission complète (définie par la réduction de la blastose médullaire en dessous de 5% et la normalisation de l'hémogramme) chez 70 à 85 % des patients en fonction des doses utilisées et de l'âge des patients. Cette réponse doit être confortée par une ou plusieurs séquences de chimiothérapie ( éventuellement complétées par une autogreffe ou une allogreffe de cellules souches hématopoïétiques) afin d'éliminer les cellules leucémiques résiduelles. Une résistance initiale au traitement est observée chez 15 à 30 % des patients (leucémie aiguë réfractaire) tandis qu'une rechute survient dans un délai de quelques semaines à plusieurs années chez une partie des patients initialement en réponse complète. Ces évènements traduisent une résistance au traitement cytotoxique, responsable de la mort de 60 à près de 100% des patients atteints de leucémie aiguë myéloblastique en fonction des facteurs pronostiques. Les principaux facteurs pronostiques identifiés sont l'âge avancé, certaines anomalies cytogénétiques et la leucocytose initiale élevée . La résistance d'une fraction des cellules leucémiques au traitement cytotoxique fait intervenir divers mécanismes parmi lesquels un défaut d'accumulation des médicaments anticancéreux dans les cellules blastiques, par exemple du fait d'une augmentation de leur efflux par un mécanisme dépendant de l' ATP (phénotype de résistance multiple aux agents cytotoxiques impliquant la glycoprotéine Pen particulier), de l'altération du métabolisme intracellulaire de l'agent cytotoxique (principalement l'aracytine) ou de la modification de sa cible intracellulaire (réduction de la quantité de topoisomérase II ou mutation de l'enzyme par exemple). L'identification de ces mécanismes de résistance a conduit à mettre au point des stratégies de réversion, en particulier l'utilisation d'inhibiteurs compétitifs de la glycoprotéine P. Cependant, jusqu'à maintenant, ces stratégies se sont révélées décevantes en clinique humaine, à l'exception, peut être, des leucémies aiguës myéloblastiques issues de la transformation des syndromes myélodysplasiques primitifs. Il semble que la mort cellulaire par apoptose soit la principale forme de mort induite dans les leucémies par les agents cytotoxiques. On observe, dans le sang de sujets atteints de leucémie aiguë et recevant un traitement cytotoxique, des cellules blastiques ayant un phénotype apoptotique. La mort par apoptose implique l'activation séquentielle d'un certain nombre d'évènements moléculaires (modifications mitochondriales, activation de caspases, clivage de protéines intracellulaires et de l' ADN). L'activation de ces évènements semble la conséquence des lésions spécifiquement induites par l'agent cytotoxique au niveau de sa cible cellulaire (par exemple, les altérations de l' ADN nucléaire induites par un inhibiteur de la topoisomérase II). A côté de ces lésions spécifiques, les agents cytotoxiques sont capables d'activer plusieurs voies de signalisation intracellulaires dont certaines favorisent la mort cellulaire par apoptose (par exemple la génération de céramide) alors que d'autres ont un effet inverse (par exemple l'activation de NF-KB ou de certaines isoformes de la protéine kinase C). L'apoptose n'est pas la seule forme de mort cellulaire induite par les agents cytotoxiques dans les cellules leucémiques. Des lignées cellulaires dont la sensibilité à l'apoptose induite par un agent cytotoxique est très différente peuvent avoir une sensibilité identique à cet agent dans un test clonogénique ou un modèle in vivo. Néanmoins, la compréhension des mécanismes de mort cellulaire par apoptose devrait permettre d'identifier de nouvelles cibles pour tenter de sensibiliser les cellules leucémiques aux agents cytotoxiques, voire de provoquer directement, et le plus spécifiquement possible, la mort de ces cellules. C'est sur la base de cette hypothèse que nous avons entrepris notre travail de thèse. Nous avons choisi de nous intéresser au rôle des caspases dans l'apoptose des cellules leucémiques exposées à un agent cytotoxique. Nous avons d'abord identifié la capacité des agents cytotoxiques à induire la transcription de gènes codant pour les caspases (gènes CASP) avant la mise en route du processus de mort cellulaire proprement dit. Ces premiers résultats nous ont conduit à nous focaliser progressivement sur la caspase-2 (encore appelée Ich-1) dont la régulation transcriptionnelle est particulièrement marquée dans notre modèle d'étude (principalement les cellules leucémiques U937 exposées à l'étoposide). Deux isoformes de cette caspase avait été décrites : une isoforme longue dont la surexpression induit l'apoptose et une isoforme courte dont la surexpression peut avoir un effet protecteur de la mort cellulaire. Nous avons identifié deux autres isoformes synthétisées en faible quantité dans les cellules. Nous nous sommes interessés à la fonction de chacune de ces isoformes. Ces travaux nous ont conduit aux conclusions suivantes - L'isoforme longue de la caspase-2, caspase-2L, participe à l'activation de la procaspase-8 dans les cellules exposées aux agonistes de Fas. Cette observation faite dans la lignée U937 a été confirmée dans les lignées Jurkat et CEM. La caspase-2L accélère ainsi la cinétique de l'apoptose induite par le ligand de Fas sans être indispensable à cette voie d'activation. Cet effet s'exerce sans que la caspase-2L interagisse directement avec les éléments constitutifs du complexe associant Fas, FADD et la procaspase-8 (DISC). - L'isoforme courte de la caspase-2, caspase-2S, interfère avec la condensation de la chromatine et les modifications membranaires associées à l'apoptose des cellules U937 exposées à l' étoposide. Elle n'a aucun effet sur la cascade d'activation des autres caspases, ni sur la fragmentation internucléosomale de l' ADN. - L'isoforme de la caspase-2L que nous avons identifiée, caspase-2L­Pro, interagit avec le prodomaine de la procaspase-2L et la molécule adaptatrice RAIDD et protège partiellement les cellules Namalwa de la mort induite par les agents cytotoxiques et les agonistes des récepteurs à domaine de mort. La mutation du site d'interaction de !'isoforme ProL avec la procaspase-2L et avec RAIDD supprime cette activité biologique. Ces résultats seront présentés en détail dans les pages qui suivent, après une synthèse des connaissances actuelles concernant le rôle des caspases, et singulièrement de la caspase-2, dans la mort cellulaire par apoptose.

La leucémie est un cancer qui touche les cellules souches du sang. Il existe plusieurs types de leucémies, toutefois nous nous sommes intéressés à la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) pédiatrique. L’anomalie se trouve au niveau des cellules souches lymphoïdes, et se développe de manière soudaine, en quelques jours ou quelques semaines. De nombreuses conséquences néfastes sont connues au niveau cardiorespiratoire, musculaire, de l'énergie et de l’activité physique d’enfants en fin de chimiothérapie. L’objectif premier de l’étude était de mesurer les capacités cardiorespiratoires et musculaires réelles d’enfants atteints d’une LLA à trois temps de la chimiothérapie : l’induction (T1), la consolidation 2 (T2) et l’entretien (T3). Un deuxième objectif était de tester la faisabilité d’une épreuve d’effort maximal cardiorespiratoire pendant ou après l’induction. Le protocole de l’étude comprenait une épreuve d’effort physique sur ergocycle pour évaluer la consommation maximale d’oxygène (V ̇ O2max) un questionnaire sur la qualité de vie et un sur l’activité physique. La force musculaire était évaluée par un audit des dossiers (N=16) de physiothérapie d’anciens patients et des participants à l’étude. Une patiente a complété le test V ̇ O2max aux T1 et T2, et s’est améliorée de 54,5% entre les deux tests, mais restait nettement sous les valeurs normales. Pour l’ensemble des données de force musculaire : force de préhension, moment de force des extenseurs du genou et des fléchisseurs dorsaux de la cheville, les valeurs étaient inférieures à celles d’enfants sains, et avaient diminuées entre l’induction et la consolidation 2. Les résultats de ce mémoire démontrent que certains enfants atteints d’une LLA présentent un déconditionnement cardiorespiratoire et musculaire dès l’induction. Elles démontrent également la faisabilité d’un exercice cardiorespiratoire soutenu après la phase d’induction. Ces données importantes serviront aux professionnels de la santé dans la mise en place d’interventions en activité physique adaptée aux capacités d’enfants atteints d’une LLA. / Leukemia is a blood cancer and can be expressed in many forms, but the main focus of this thesis will be on acute lymphoblastic leukemia (ALL) in the pediatric population. The anomaly develops in the lymphoid stem cells and the disease develops rapidly, within a few days to a few weeks. Leukemia and chemotherapy have been shown to have many deleterious on the children cardiorespiratory and muscular status, energy level and engagement in physical activity mainly reported for children in the last phase of chemotherapy. The first aim of our work was to collect data on their cardiorespiratory and muscular status during three phases of the chemotherapy: induction (T1), consolidation 2 (T2) and maintenance (T3). The second aim was to test the feasibility of maximal oxygen consumption test ((V ̇ O2max) during or post induction. The protocol comprised a (V ̇ O2max) test on ergocycle, a quality of life and physical activity questionnaires. Data on muscular strength was collected through auditing the physical therapy files (n=16) of past and current patients. One participant completed the T1 and T2 (V ̇ O2max) testing and showed a 54.5% increase from T1 to T2. Despite this improvement, her score at T2 was still poor compared to her expected value. Data collected on muscular strength were: grip strength, moments of force of the knee extensors and the ankle dorsiflexors. They all showed lower values than expected compared to normative value at T1 and a decline from T1 to T2. The results outlined in this thesis show that children with ALL may present with decreased cardiorespiratory and muscular fitness with an onset as early as induction chemotherapy. Nonetheless, the results showed that high intensity cardiorespiratory exercise was feasible post induction. The data are of importance as they will help health care professionals build physical activity interventions adapted to the physical capacities of children with ALL.

Titre de l'écran-titre (visionné le 16 janvier 2024) / La leucémie lymphoblastique aiguë de type T (LLA-T) provient de la transformation maligne des progéniteurs des lymphocytes T dans le thymus. Leur migration à partir du thymus vers la moelle osseuse puis vers d'autres organes est associée à un mauvais pronostic. Pour s'infiltrer, les cellules leucémiques LLA-T doivent circuler dans le sang puis transmigrer la barrière endothéliale puis traverser la membrane basale des vaisseaux sanguins composée majoritairement de matrice extracellulaire dont la laminine est le principal composant. Celle-ci est liée principalement par l'intégrine α6, mais dont le rôle dans la leucémie LLA-T n'est pas étudié. Nos résultats montrent que les cellules leucémiques LLA-T expriment fortement l'intégrine α6 qui leur permet de migrer à travers la laminine. Par ailleurs, le blocage de l'intégrine α6 par un anticorps spécifique réduit le développement de la leucémie dans un modèle murin de xénogreffe de leucémie LLA-T. Pour déterminer le mécanisme par lequel l'intégrine α6 favorise la migration des cellules leucémiques LLA-T, nous avons considéré l'implication des récepteurs purinergiques. En effet, nos travaux récents ont montré que les lymphocytes Th17 migrent à travers la fibronectine en impliquant l'ATP et son récepteur purinergique P2X4. Nos résultats montrent que les cellules leucémiques expriment les récepteurs purinergiques P2X4, P2X7 et P2Y₁₁. L'utilisation de l'apyrase qui dégrade l'ATP extracellulaire inhibe fortement la migration des cellules leucémiques LLA-T à travers la laminine. De plus, l'utilisation d'antagonistes spécifiques a montré que l'inhibition du récepteur P2X4, mais pas des récepteurs P2X7 ou P2Y₁₁, réduit la migration des cellules leucémiques LLA-T à travers la laminine. Ces résultats montrent que l'intégrine α6 via le récepteur P2X4 est une voie majeure dans la migration et la dissémination des cellules leucémiques LLA-T et suggèrent que son blocage peut représenter une nouvelle cible thérapeutique afin d'améliorer le pronostic des patients.

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Le taux de survie à 5 ans est d'environ 90%. La cause principale d'échec au traitement demeure la rechute survenant dans environ 20% des cas. Avec le plafonnement du taux de survie, considérer de nouvelles approches pour mieux prévenir, anticiper et gérer la chimiorésistance entraînant l'échec thérapeutique est nécessaire. La pharmacoépigénomique est une discipline émergente qui étudie comment les changements de l'épigénome, dont la méthylation de l'ADN (meADN), influencent la réponse aux médicaments. Sachant que les signaux environnementaux peuvent changer la meADN, certaines marques de méthylations présentent en LLA au diagnostic ou acquises durant le traitement pourraient prédire la réponse initiale au traitement ou l'évolution vers la chimiorésistance.Le but de mon projet était d'identifier des marques de meADN associées à la réponse aux thérapies en LLA pédiatrique. Le premier objectif a identifié dans une cohorte de LLA pédiatrique, 16 sites CpG de pharmacogènes candidats dont la méthylation au diagnostic est associée à un pronostic favorable (*DOK5, PTGS2, VEGFC*) ou défavorable (*ACTG1, ADORA2A, PATZ1*). Le second objectif a évalué les changements de meADN de régions de 100pb dans un modèle cellulaire de LLA chimiorésistant au méthotrexate. Plusieurs changements de meADN ont été observés dans le modèle résistant alors que peu de changements étaient présents dans le modèle sensible après 72 heures d'exposition au méthotrexate (55 445 vs 390 régions). Des analyses d'enrichissement génique de ces régions révèlent des voies liées à des fonctions cellulaires importantes, dont la réponse cellulaire au stress et le métabolisme des carbohydrates. Ces résultats appuient l'intérêt de comprendre la contribution des changements de meADN dans la réponse et la chimiorésistance en LLA pour les exploiter comme outils cliniques. L'étude des mécanistiques par lesquels ces changements mènent à la progression et la chimiorésistance pourrait révéler des cibles thérapeutiques innovantes. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common pediatric cancer. The 5-year survival rate is approximately 90%. The main cause of treatment failure is disease relapse, occurring in about 20% of cases. With the survival rate plateauing, it is imperative to consider new approaches to better anticipate and manage chemotherapy resistance, which inevitably leads to relapse. The pharmacoepigenomics is an emerging discipline that studies how changes in the epigenome, including DNA methylation, influence drug response. The methylation marks can change under the influence of environmental signals. Some methylation marks present in ALL at diagnosis could be determinants of the initial treatment response and their evolution during exposure to chemotherapy could participate in chemoresistance acquisition. The goal of my project was to identify DNA methylation marks associated with therapy response in pediatric ALL. Using a pediatric ALL cohort, the first objective has identified 16 CpG sites in pharmacogenes for which the methylation at diagnosis was associated with a favorable (*DOK5, PTGS2, VEGFC*) or an unfavorable (*ACTG1, ADORA2A, PATZ1*) outcome. The second objective was to evaluate the changes in methylation of 100bp DNA regions in an ALL cell model with conferred resistance to methotrexate chemotherapy. While the resistant model gained or lost thousands of methylation marks (55,445 regions), exposing a sensitive model to 72 hours of methotrexate resulted in fewer changes (390 regions). Gene Set Enrichment Analysis of the modified regions showed an enrichment of pathways linked with important cellular functions such as cellular stress responses and carbohydrate metabolism. These results support the need to better understand the role of DNA methylation changes in chemotherapy response and resistance in order to employ them as clinical tools. Investigating the mechanisms by which these changes contribute to the progression or drug resistance in ALL may reveal novel therapeutic targets.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est le type de leucémie le plus commun chez l'adulte en occident. L'évolution clinique des patients est hétérogène et difficile à prédire. Notre groupe a mis en évidence que la LLC est plus agressive chez les patients ayant une expression élevée de la voie glycosyltransférase UGT2B17 au niveau des cellules B leucémiques. En effet, UGT2B17 est associé à une survie sans progression et une survie globale réduite des patients LLC, et constitue ainsi un marqueur pronostique indépendant de ceux utilisés en clinique actuellement. UGT2B17 est également associée à de la pharmacorésistance accrue de certains antileucémiques tel que l'ibrutinib, une molécule inhibitrice de la tyrosine kinase de Bruton (BTK) de la voie pro-survie du récepteur des cellules B (BCR). La résistance aux médicaments demeure un obstacle important à la guérison des patients atteints de LLC. Mon projet avait pour objectif de se pencher sur le ou les mécanismes impliqué(s) par lequel ou lesquels UGT2B17 affecte la progression et la réponse au traitement de la LLC en étudiant la voie du BCR. Nos données révèlent une modification significative de l'expression en ARNm et au niveau protéique d'effecteurs de la voie du BCR lors de la surexpression d'UGT2B17. Ceci suggère un effet transcriptionnel d'UGT2B17 par un mécanisme encore inconnu. De plus, la modification du statut phosphorylé de protéines de la voie du BCR appuie une influence d'UGT2B17 sur la transduction du signal de ce récepteur. De plus, une interaction protéine-protéine entre UGT2B17 et BTK de la voie du BCR, a pu être observée, suggérant l'implication d'un réseau d'interaction complexe dans les cellules B leucémiques impliquant UGT2B17. Ces résultats indiquent une influence d'UGT2B17 sur la voie de signalisation du BCR. UGT2B17 pourrait promouvoir des phénotypes oncogéniques et une réponse réduite aux traitements anticancéreux en favorisant la signalisation du BCR. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in adults in the western world. Patient outcomes are heterogenous and can be difficult to predict. Our group evidenced that CLL is more aggressive in patients with high expression of the glycosyltransferase pathway UGT2B17 in leukemic B cells. UGT2B17 is associated with shorter treatment-free survival and global survival of CLL patients, providing novel information for risk assessment independent of known prognostics markers used in clinic. UGT2B17 also affects B-cells sensitivity to drugs such as ibrutinib, an emerging therapy inhibiting the pro-survival B cell receptor (BCR)-associated Bruton's tyrosine kinase (BTK). Drug's resistances remain a clinic obstacle to CLL patients' recovery. My project's objectives were to study UGT2B17 mechanisms that affects progression and treatment response in CLL by investigating the BCR signaling pathway. Our results reveal a significative modulation of the expression in mRNA and in protein of effectors of the BCR pathway with UGT2B17 surexpression. That suggests a transcriptional effect of UGT2B17 via an unknown mechanism. Moreover, the modification of the phosphorylation status of downstream proteins supports an influence of UGT2B17 on the signal transduction of this receptor. A protein-protein interaction between UGT2B17 and the Bruton's tyrosine kinase (BTK) of the BCR pathway has been observed. This interaction suggests the implication of a complex interaction network in the leukemic B cells that involves UGT2B17. Those results indicate an influence of UGT2B17 on the BCR signaling pathway. UGT2B17 could promote oncogenic phenotypes and an altered anticancer treatment response favoring the BCR signaling pathway.

RESUME GENERAL<p><p>Contexte :une association entre exposition prolongée aux champs magnétiques (CM) d’extrêmement basses fréquences (ELF) et risque sanitaire a été établie pour la leucémie infantile (CM 50/60 Hz de l’électricité, RR = 2,0 pour ≥ 0,4 µT d‘intensité moyennée dans le temps) et est suggérée pour le décès par maladie d’Alzheimer (CM 50/60 Hz, CM 16,7 Hz des voies ferrées pour 21 µT d’intensité moyennée dans le temps) et pour certaines hémopathies chez l’adulte (CM 16,7 Hz). Ces associations restent inexpliquées à ce jour. Sur base d’observations animales (effets des CM ELF sur la sécrétion de mélatonine) d’une part, et de la sensibilité magnétique confirmée des cryptochromes (régulateurs des biorythmes) d’autre part, il a été suggéré que ces associations puissent être dues à une perturbation des biorythmes par les CM ELF. Selon les instances internationales, une intensité > 1 mT est requise pour l’existence d’effets biologiques. <p>Objectifs et méthode :sur base d’une revue exhaustive de la littérature et de modèles théoriques reconnus, le présent travail développe certains mécanismes possibles pour un effet perturbateur des biorythmes par les CM ELF. L’impact en santé publique de cette hypothèse est ensuite évalué. Enfin, des protocoles sont proposés pour sa mise à l’épreuve, tenant compte des mécanismes envisagés. <p>Résultats :la possibilité existe d’une interaction des oscillations ELF de l’intensité et/ou de l’orientation du CM (somme vectorielle du CM ELF et du CM terrestre ou CMT) avec les cryptochromes rétiniens. Chez l’animal magnétosensible (dont le rongeur), une perturbation des biorythmes pourrait être consécutive à un mécanisme non spécifique de perturbation sensorielle. Toute observation animale pourrait donc ne pas être extrapolable à l’Homme. Chez ce dernier, une perturbation des biorythmes pourrait être causée par les oscillations de l’intensité du CM (peut- être dès < 100 µT d’intensité de CM ELF). Une telle perturbation pourrait aussi être causée par les variations spatiales de l’intensité du CMT qui existent dans l’environnement résidentiel (proximité de structures métalliques). Par ailleurs, dans l’éventualité de l’existence, chez l’Homme également, d’une sensibilité directionnelle basée sur les cryptochromes rétiniens, les oscillations de l’orientation du CM pourraient alors aussi interférer avec ces cryptochromes (peut-être dès ≤ 10 µT). Dans l’hypothèse où une telle interférence affecte les biorythmes, seules pourraient alors être concernées les oscillations dont l’amplitude atteint plusieurs degrés d’angle. Un tel mécanisme ne pourrait donc s’appliquer à la relation entre CM ELF et leucémie infantile que dans l’éventualité où les intensités les plus élevées (+ 1 à 2 SD) de CM ELF y jouent un rôle. Au cas où l’hypothèse de la perturbation des biorythmes par les CM ELF se voyait confirmée, d’autres troubles de santé seraient alors concernés et d’autres sources de CM seraient en cause, tels les CM statiques d’intensité variable émis par les lignes de transport électrifié. Les paramètres d’exposition considérés devraient inclure l’orientation relative CM ELF/CMT, mais aussi l’intensité locale du CMT (facteur à la fois déterminant et confondant dans la présente hypothèse). L’expérimentation animale devrait investiguer l’expression des clock genes. L’expérimentation humaine devrait investiguer les biorythmes chez l’enfant. Et l’épidémiologie devrait investiguer l’incidence de troubles liés à une perturbation des biorythmes en relation avec l’exposition aux CM ELF ainsi qu’aux variations locales de l’intensité du CMT. <p>Conclusions :malgré les incertitudes persistantes quant aux fonctions précises des cryptochromes de la rétine humaine et quant à l’exactitude des modèles théoriques qui décrivent les interactions entre CM et cryptochromes, certains mécanismes paraissent possibles pour une interaction entre CM ELF et biorythmes. En l’absence persistante d’alternative valide pour l’explication de l’association entre CM ELF et leucémie infantile, l’hypothèse de la perturbation des biorythmes par ces CM paraît devoir être investiguée plus avant, mais en tenant compte des variations locales d’intensité du CMT. <p>Background: An association between prolonged exposure to extremely low frequency (ELF) magnetic fields (MF) and health risk has been established for childhood leukemia (50/60 Hz MF of electricity, RR = 2.0 for ≥ 0.4 µT of time-averaged intensity) and is suggested for death by Alzheimer's disease (50/60 Hz MF, 16.7 Hz MF of railways at 21 µT of time-averaged intensity) and for some hematologic malignancies in adults (16.7 Hz MF). These associations remain unexplained so far. Based on animal studies (effects of ELF MF on melatonin secretion) on the one hand, and on the confirmed magnetic sensitivity of cryptochromes (regulators of biorhythms) on the other hand, it has been suggested that these associations may be due to a disruption of biorhythms by ELF MF. From current data, however, biological effects seem only possible at > 1 mT of intensity.<p>Objectives and methods: on the basis of an exhaustive literature review and with use of recognized theoretical models, this paper develops some possible mechanisms for disruption of biorhythms by ELF MF. The public health impact of this hypothesis is then evaluated. Finally, protocols are proposed for the testing of it, with taking into account the proposed mechanisms.<p>Results: an interaction seems possible between ELF oscillations of the intensity and/or the orientation of the ambient MF (the vector sum of both the ELF MF and the geomagnetic field or GMF) with retinal cryptochromes. In magnetosensitive animals (including rodents), disruption of biorhythms may then be secondary to a non-specific mechanism of sensory disturbance. All animal observation could therefore not be extrapolated to humans. In the latter, on his turn, a disruption of biorhythms may be caused by the oscillations of the MF intensity (perhaps from <100 µT of ELF MF intensity). Such disruption could also be caused by spatial variations of the intensity of the GMF that exist in residential environment (near steel structures). Moreover, in case of the existence in humans (like in animals) of a directional sensitivity based on retinal cryptochromes, then the oscillations of the MF orientation also could interfere with these cryptochromes (perhaps from ≤ 10 µT). In the event that such interference affects biorhythms, only oscillations of several degrees of amplitude would then be concerned. As a consequence, such a mechanism could apply to the relation between ELF MF and childhood leukemia only in the event that the highest MF intensities (Mean + 1-2 SD) also play a role in that relation. In the event the hypothesis of disruption of biorhythms by ELF MF is confirmed, other health problems would be concerned and other kind of MF would be involved, such as the static MF of variable intensity that are emitted by the lines of electrified transport. The considered exposure parameters should include the relative orientation of ELF MF and GMF, but also the local intensity of GMF (both determining factor and confounder in this case). Animal experiments should investigate the expression of clock genes. Human experimentation should investigate biorhythms in children. And epidemiology should investigate the incidence of disorders related to disruption of biorhythms in relation to exposure to ELF MF as well as to local variations in the intensity of the GMF.<p>Conclusions: Despite the persisting uncertainties about the precise functions of retinal cryptochrome as well as about the accuracy of the theoretical models that describe the interactions between MF and cryptochromes, some mechanisms seem possible for an interaction between ELF MF and biorhythms. In the persisting absence of valid alternative explanation for the association between childhood leukemia and ELF MF, the hypothesis of biorhythm disturbance by ELF MF deserves further investigation, however with taking into account local intensity variations of the GMF.<p> / Doctorat en Sciences de la santé publique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Parmi les rétrovirus tumorigènes, les rétrovirus appelés « complexes » dont font partie HTLV-1 chez l’homme et BLV chez le mouton, sont responsables de leucémies lymphoïdes chroniques caractérisées par des pathogenèses similaires. Bien que la contribution essentielle de la protéine Tax dans la leucémogenèse soit bien établie pour ces deux virus, il existe toujours une contreverse quant à l’expression des protéines virales -dont l’oncoprotéine Tax- dans les cellules transformées. Dans le cas de HTLV-1 et BLV, le virus est latent. Une hypothèse attrayante suggère que l’extinction complète du provirus accompagnée du blocage transcriptionnel de l’expression de Tax dans la cellule leucémique serait un élément indispensable au développement de la tumeur en réduisant son immunogénicité. Le silencing viral permettrait à la cellule infectée d’échapper à la reconnaissance par le système immunitaire de l’hôte. <p>Dans la première partie de notre travail, nous avons pu montrer, grâce à l’observation et le suivi de deux moutons infectés par BLV, que l’extinction virale était associée au développement tumoral. Alors que la phase asymptomatique est caractérisée par l’existence de différents clones cellulaires infectés et exprimant le virus, la phase tumorale est caractérisée par l’existence d’un seul clone cellulaire dans lequel l’expression virale est éteinte. Dans le cas du mouton S2531, nous avons mis en évidence que le silencing observé dans la phase tumorale est d’origine génétique. L’extinction de l’expression virale et la domination du clone muté au niveau de la protéine Tax (K303) sont associées à l’émergence de la leucémie et constituent une caractéristique de la phase tumorale. Le deuxième mouton étudié, S267, est caractérisé par la présence de cellules infectées non transformées et transformées au même moment. Par ailleurs, le mouton S267 est caractérisé par une absence de mutations ou délétions au niveau du provirus intégré dans les cellules tumorales. Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons pu, grâce à l’établissement de la lignée L267 dans laquelle le silencing viral n’est pas lié à une défection dans la structure génomique du provirus, élucider les mécanismes épigénétiques responsables du silencing. Nous montrons que ce provirus silencieux peut être réactivé in vitro 1) lorsque la protéine Tax sauvage est introduite par transfert rétroviral, 2) après traitement des cellules par la trichostatine A (TSA), un inhibiteur des histones désacétylases, 3) par traitement des cellules à la 5’azacytidine, un agent inhibiteur de DNA méthyltransférases. La réactivation du provirus silencieux lui confère la capacité d’infecter des moutons sains, suggérant que le provirus est complet et exempt de mutation qui pourrait altérer son fonctionnement. Les complexes de désacétylation des histones msin3A et HDAC-1 jouent un rôle important dans l’établissement du silencing viral via la condensation de la chromatine, et ce changement de la structure chromatinienne est lié a un ensemble de modifications ciblant les acides aminés des queues N-terminales des histones H3 et H4 établissant ainsi un code histone pour l’extinction et l’expression du provirus. Enfin, l’étude comparative des profils d’expression génique de cellules B tumorales dans lesquelles le provirus BLV est soit silencieux, soit ré-activé suite à l’expression exogène de Tax a montré que les mécanismes épigénétiques de silencing se superposent même dans le modèle génétique de silencing. De plus le rétablissement de l’expression virale par Tax est associé à une élimination des complexes de désacétylation des histones au niveau du promoteur viral.<p>Nos résultats ouvrent le champ vers l’utilisation de modèle de leucémie ovine dans des essais thérapeutiques basés sur la combinaison du traitement par des inhibiteurs des HDACs et des DNMTs et une immunothérapie ciblant des antigènes tumoraux d’origine virale ou cellulaire. De telles expériences in vivo constitueront un modèle utile pour le traitement l’ATLL et de pathologies prolifératives touchant les cellules B chez l’homme.<p><p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la plus fréquente des leucémies qui touchent le monde occidental. Cette pathologie est toujours incurable et se caractérise par une hétérogénéité d’évolution clinique marquée par une survie globale oscillant de quelques mois à des dizaines d’années. Il est donc primordial de savoir à quel type d’évolution le patient sera confronté afin d’adapter au mieux le suivi de la maladie et la précocité ou non du traitement.<p><p>\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished