Les télomères sont les extrémités des chromosomes et sont protégés par le complexe shelterin pour ne pas être reconnus comme des cassures accidentelles d'ADN double brin. Un enjeu majeur dans la recherche sur les télomères est de comprendre comment l'intégrité des extrémités des chromosomes au cours de l'oncogenèse est modifiée. La perte de répétitions télomériques à chaque division cellulaire peut être compensée par l’activité de l’enzyme télomérase qui ajoute "de novo" des motifs télomériques. Bien que la télomérase soit surexprimée dans la majorité des cellules cancéreuses, l’impact de modifications des protéines shelterin qui coiffent les télomères dans le processus oncogénique n'est pas clair. Dans la première étude, nous avons analysé l'état des télomères de patients atteints de la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) uniquement au stade précoce de la LLC, stade A de Binet. La LLC est une leucémie commune aux pays occidentaux et se développe chez les personnes âgées. Nous avons montré que la majorité des patients atteints de la maladie présente des télomères dysfonctionnels. Les dommages télomériques ne corrèlent pas avec la longueur des télomères ou le statut mutationnel des patients, mais corrèlent avec la faible expression des protéines télomériques TIN2 et TPP1. Dans la seconde étude, nous avons montré que l'expression de l'oncogène H-RasV12 confère une résistance accrue vis-à-vis des télomères dysfonctionnels et aucun défaut de croissance n’est observable lorsque TRF2, une protéine télomérique est inhibée. Cet effet dépend de l'expression de l'interleukine 6 (IL-6), révélant un rôle inattendu de cette cytokine dans la fonction des télomères. De plus, la co-inhibition de TRF2 et IL-6 dans les cellules RasV12 conduit à blocage G2 / M associé à une séparation des chromatides sœurs. Ces résultats suggèrent que l'induction de la tumorigénicité par l’oncogène Ras protège les télomères contre les dommages et que la ségrégation des chromosomes est dépendante de TRF2 et IL-6. / Telomeres protect the chromosome extremities from being repaired and recognized as accidental DNA breaks double-strand. A major issue in telomere research is to understand how systems monitoring the integrity of chromosomes ends change during oncogenesis. Although telomerase overexpression occurs in the majority of cancer cells, whether other types of telomere changes play roles in the oncogenic process is unclear. In the first study, we analyzed the status of telomeres in patients with early stage Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL), which is a common leukemia in Western countries that develops in the elderly. We showed that the majority of CLL patients exhibit telomeric dysfunction. It does not correlate with telomere length or mutation status of patients, but correlates with low expression of telomeric proteins TIN2 and TPP1. In the second study, we showed that expression of the H-RasV12 oncogene confers increased resistance to telomere uncapping and protects against to growth defects when TRF2, a telomeric protein, is depleted. This effect depends upon the expression of interleukin 6 (IL-6), revealing an unexpected role for this cytokine in telomere function. Notably, the co-inhibition of TRF2 and IL-6 in RasV12 cells led to G2/M block associated with an increased incidence of premature sister chromatid separation. These findings suggest that the induction of a tumorigenic state by oncogenic Ras protects against telomere damage and chromosome segregation defects in TRF2-compromised cells through an increase of IL-6 expression

La spectroscopie vibrationnelle est une technologie permettant de générer une grande quantité de données très informatives quant à la composition moléculaire des échantillons analysés. Lorsqu'elle est couplée à des méthodes chimiométriques de traitement et de classification de données, elle devient un outil très performant pour l'identification de structures et sous-structures des échantillons. Appliqué dans le domaine du biomédical, cet outil présente alors un fort potentiel pour le diagnostic de maladie. C'est dans ce cadre qu'ont été réalisés les travaux de ce manuscrit. Dans une première étude relevant du développement algorithmique, un algorithme automatique de classification non supervisée (basé sur les Fuzzy C-Means) et récemment implémenté au sein du laboratoire pour apporter une aide au diagnostic de cancers cutanés par imagerie infrarouge, a été amélioré afin de i) considérablement réduire le temps nécessaire à son exécution ii) augmenter la qualité des résultats obtenus sur les données infrarouge et iii) étendre son champs d'application à des données réelles et simulées, habituellement employées dans la littérature. Cet outil a été testé sur des données infrarouge acquises sur 16 échantillons de cancers cutanés (BCC, SCC, maladie de Bowen et mélanomes), et sur 49 jeux de données réels et simulés. Les résultats obtenus ont montré la capacité de ce nouvel algorithme à estimer des partitions proches de la réalité quelque soit le type de données étudié. La seconde étude de ce manuscrit avait pour but de mettre au point un outil chimiométrique autonome d'aide au diagnostic de la leucémie lymphoïde chronique par spectroscopie Raman. Dans ce travail, des traitements numériques et l'algorithme de classification supervisée Support Vector Machines, ont été appliqués à des données acquises sur des cellules sanguine de 27 témoins et 49 patients présentant une leucémie lymphoïde chronique. Les résultats de classification obtenus ont montré une sensibilité de 80% et une spécificité de 100% dans la détection de la maladie. / Vibrational spectroscopy is a technology able to record a large amount of molecular information from studied samples. Coupled with chemometrics and classification methods, vibrational spectroscopy is an efficient tool to identify sample structures and substructures. When applied to the biomedical field, this tool shows a high potential for disease diagnosis. It is in this context that the works presented in this thesis have been realized. In a first study, dealing with algorithmic development, an automatic and unsupervised classification algorithm (based on the Fuzzy C-Means) and developed by our laboratory in order to help for skin cancer diagnosis using IR spectroscopy, was improved in order to i) reduce the computational time needed to realize clustering, ii) increase results quality obtained on infrared data, iii) and extend its application fields to simulated and real datasets, commonly used in the literature. This tool has been tested on 16 infrared spectral images of skin cancers (BCC, SCC, Bowen's disease and melanoma), and 49 real and simulated datasets. The obtained results showed the ability of this new algorithm to estimate realistic data partitions regardless the considered dataset. The second study of this work aimed at developing an independent chemometric tool to assist for chronic lymphocytic leukemia diagnosis by Raman spectroscopy. In this second work, different numerical preprocessing steps and a supervised classification algorithm, Support Vector Machines, have been applied on data recorded on blood cells coming from 27 healthy persons and 49 patients with chronic lymphocytic leukemia. The classification results showed a sensitivity of 80% and a specificity of 100% in the disease diagnosis.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC), caractérisée par une résistance à l'apoptose in vivo et par la faible immunogénicité des cellules leucémiques est une maladie de présentation hétérogène. L'immunochimiothérapie a permis de progresser dans son traitement, mais l'identification de nouvelles cibles d'immunothérapie serait souhaitable. Dans ce contexte, la présence de TLR-7 et TLR-9 sur les cellules de LLC est une piste intéressante. L'objectif principal de cette étude était ainsi de préciser les effets in vitro de l'engagement de TLR-7 et TLR-9 sur les cellules tumorales par leur ligands respectifs Imiquimod R837 et ODN CpG M362. Ces effets ont été examinés sur des LLC classées en formes cliniques et/ou selon leur statut mutationnel IgVH. Les cellules séparées de 40 patients ont été cultivées pendant trois jours, avec du milieu seul, de l'acétate phorbolmyristate (PMA) ou d'Imiquimod ou d'ODN. La cytométrie en flux a permis d'étudier l'expression des TLRs et d'antigènes de différenciation au niveau des cellules B tumorales, d'évaluer l'apoptose, la prolifération et de doser les cytokines. Les voies de signalisation ont été explorées par une technique d'antibody-array et par western blot. Les résultats confirment que les TLRs sont actifs et répondent à leurs ligands sur les cellules leucémiques. L'Imiquimod induit une apoptose accrue des cellules tumorales, surtout chez les patients stables et mutés, impliquant également la voie p38MAPK. L'ODN induit la prolifération des cellules tumorales et les protège de l'apoptose, surtout pour les patients avec une forme agressive et/ou non mutée. Ceci s'accompagne de l'activation de nombreuses protéines anti-apoptotiques et de la production d'IL-8 et d'IL-6. Ces résultats suggèrent que l'Imiquimod et l'ODN pourraient entrer dans une stratégie d'immunothérapie adjuvante pour les patients atteints de LLC / Chronic lymphoid leukemia (CLL), characterized by in vivo resistance to apoptosis and poor immunogenicity of leukemic cells is a hetereogeneous disease. Immunochemotherapy has allowed to progress greatly in its treatment, but the identification of new immunotherapy targets would be welcome. In this context, the presence of TLR-7 and TLR-9 on CLL cells is a promising prospect. The main objective of this work was therefore to precise the effects of in vitro engagement of TLR-7 and TLR-9 on tumor cells by their respective ligands Imiquimod R837 and ODN CpG M362. These effects were examined on CLL classified according to clinical evolution and /or according to their IgVH mutational status. Separated cells from 40 patients were cultured for three days with medium alone, acetate phorbolmyristate (PMA) or Imiquimod or ODN. Flow cytometry allowed to study the expression of TLRs and differentiation antigens on CLL cells' surface, to evaluate apoptosis, measure proliferation and assay cytokines production. Signaling pathways were further studied by antibody-array and western blot. Data obtained confirmed that TLRs are active and respond to their ligands on CLL B-cells. Imiquimod induces increased apoptosis, especially in patients with stable disease or mutated IgVH, with the additional involvement of the p38MAPK pathway. ODN induces cell proliferation and protects them from apoptosis, mostly for patients with an aggressive disease and/or unmutated IgVH. This is concomitant of the activation of anti-apoptotic proteins and of the production of IL-8 and IL-6. These results suggest that Imiquimod and ODN could enter in an adjuvant immunotherapy strategy in CLL

La LLC est caractérisée par une forte hétérogénéité de présentation clinico-biologique avec description de formes indolentes (IGVH mutes, ZAP-70-) et de formes agressives (IGVH non mutes, ZAP-70+). Le BCR et les voies de signalisation en aval ont fait l’objet d'une étude transcriptionnelle de la réponse à une forte stimulation du BCR, que nous avons poursuivi par une approche protéomique. La MW est un syndrome lymphoprolifératif chronique dont la physiopathologie reste actuellement mal comprise même si une mutation récurrente a été récemment décrite. Nous avons pu montrer que l’analyse globale de 48 profils protéomiques permettait de distinguer les cellules de LLC M et UM avant toute stimulation. Parmi les protéines différentiellement exprimées, on peut citer notamment la protéine HCLS1, dont le rôle a déjà été explore dans la LLC. De plus, la stimulation du BCR induit une réponse protéomique spécifique dans les cellules de LLC agressives, correspondant a des variations d’expression de protéines impliquées dans la signalisation cellulaire, la régulation de la réponse immunologique, le métabolisme protéique, la croissance cellulaire et l’apoptose. La diminution d’expression de 2 protéines, RAD23B et PDCD4, après stimulation du BCR de cellules de LLC agressives a été confirmée par Western-Blot chez 19 patients. Cette technologie DIGE permettant également l’étude de différents isoformes protéiques (et notamment d’isoformes de phosphorylation), nous avons observe des modifications d’état de phosphorylation de plusieurs protéines impliquées dans le cytosquelette après stimulation du BCR (lamines, vimentine….). Une étude protéomique par électrophorèse bidimensionnelle E2D DIGE sur des cellules primaires de sang et de moelle issues de patients porteurs de MW non préalablement traités, en comparaison a d’autres syndromes lymphoprolifératifs tels les lymphomes de la zone marginale (LZM) ou la LLC, a permis de mettre en évidence un profil protéomique spécifique des cellules de MW. Parmi les spots polypeptidiques différentiellement exprimés, est à souligner la sous-expression de la protéine Ku70 chez les patients porteurs de MW par rapport aux autres lymphoproliférations. La confirmation de cette sous-expression de Ku70 a été validée au niveau transcriptionnel par PCR classique et au niveau protéique par Western-Blot dans une plus grande cohorte de patients. La mise en évidence de ces protéines d'intérêt dans l'agressivité et la physiopathologie de ces néoplasies lymphoïdes ouvrent la voie à de nouvelles études portant sur la régulation de ces molécules / CLL is characterized by a strong heterogeneity of clinical and biological presentation with indolent forms (mutated IgVH, ZAP-70-) and aggressive forms (unmutated IgVH, ZAP-70 +). BCR and the downstream signaling pathways have been the subject of a study of the transcriptional response to a strong stimulation of the BCR. We continued with a proteomic approach. WM is a chronic lymphoproliferative disorder whose pathophysiology remains poorly understood, although a recurrent mutation has recently been described. We have shown that the overall 48 proteomic profiles analysis allowed to distinguish between CLL cells M and UM before stimulation. Among the differentially expressed proteins include HCLS1 including protein, whose role has already been explored in CLL. Furthermore, stimulation of the BCR induces a specific response in proteomics aggressive LLC cells, corresponding to protein expression changes involved in cellular signaling, regulation of the immune response, protein metabolism, cell growth and apoptosis. The decrease in expression of two proteins, and RAD23B PDCD4 after stimulation aggressive cells was confirmed by Western blotting in 19 patients. This DIGE technology also allows the study of different protein isoforms (especially phosphorylation isoforms), we observed phosphorylation state changes more involved in the cytoskeleton after stimulation of RCC (rolled, vimentin ....). A proteomic study by two-dimensional electrophoresis E2D DIGE on primary cells of blood and marrow from carriers MW previously untreated patients, in comparison to other lymphoproliferative disorders such as marginal zone lymphoma (MZL) or CLL, helped to highlight a specific proteomic profile of cell MW. Among the spots differentially expressed polypeptide is to highlight the under-expression of Ku70 protein in patients MW compared with other lymphoproliferative disorders. The confirmation of this under-expression of Ku70 was confirmed at the transcriptional level by conventional PCR and at the protein level by Western blotting in a larger cohort of patients. We were able to highlight specific proteomic profiles aggressive forms and identification of differently expressed proteins allowed to identify new proteins involved in aggressiveness and pathophysiology of diseases, opening the way for new studies will focus on the regulation of these molecules of interest

Une cellule reçoit en permanence des signaux de son environnement. Cette stimulation induit une cascade de signalisation activant un programme génique et protéomique dynamique aboutissant à une réponse cellulaire adaptée. Dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC), la stimulation du récepteur à l’antigène induit un programme et une réponse anormale à l’origine de la prolifération leucémique. Notre objectif est de caractériser ce programme cellulaire pathologique. Pour cela, nous avons mis en place un modèle de stimulation afin de reproduire ex vivo cette stimulation du récepteur à l’antigène de cellules primaires issues de patients porteurs de LLC et d’activer ce programme cellulaire. Nous avons alors analysé la dynamique transcriptionnelle et protéomique activée dans ces cellules afin de caractériser les anomalies de ce programme. Cette étude nous a permis de mettre en évidence la spécificité de ce programme prolifératif et de caractériser les gènes clés de ce programme tumoral. Ces gènes constituent de potentielles cibles thérapeutiques innovantes. / A cell constantly receives signals from its environment. This stimulation induces a signalling cascade activating a dynamic genic and proteomic program, leading to an adapted cellular response. In chronic lymphocytic leukemia (CLL), an antigen receptor stimulation induces a program and an abnormal response behind leukemic proliferation. Our aim was to characterize the pathological cell program. To achieve this, we have implemented a stimulation model to reproduce ex vivo antigen receptor stimulation of primary cells from CLL patients and activate this cellular program. We then analyzed the transcriptional and proteomic dynamics activated in these cells in order to characterize the abnormalities of this program. This study allows us to highlight the specificity of this proliferative program and to identify key genes of tumor program. These genes constitute potential new therapeutic targets.

Les neuropathies à anticorps anti-MAG sont secondaires à une gammapathie monoclonale IgM dirigée contre la MAG des gaines de myéline des nerfs périphériques. Le traitement est celui de l’hémopathie sous‐jacente. Même si les thérapeutiques sont de plus en plus efficaces, les hémopathies restent le plus souvent incurables. Le rituximab est couramment utilisé dans le traitement des neuropathies à anticorps anti‐MAG, mais son efficacité n’a pas pu être clairement démontrée dans deux études contrôlées. Le FTY720 ou fingolimod est un sphingolipide, analogue de la sphingosine, qui inhibe les récepteurs de la sphingosine-1-phosphate (S1P). Il est utilisé comme immunosuppresseur dans la Sclérose en Plaques. Des études ont également rapporté un effet cytotoxique du FTY720 dans des hémopathies sans toutefois clairement expliquer son mécanisme d’action. L’objectif de ce travail est d’élucider les mécanismes moléculaires de l’effet cytotoxique du FTY720 dans un modèle d’hémopathie B, la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Des cellules leucémiques primaires de LLC et une lignée cellulaire MEC1 ont été utilisées comme modèle expérimental in vitro. Le FTY720, comme la sphingosine, entraîne une cytotoxicité dose‐dépendante dans la LLC. Cet effet, médié par la forme non phosphorylée de FTY720, est indépendant des récepteurs au S1P. Le FTY720 induit l’expression de marqueurs d’apoptose: exposition de la phosphaJdylsérine, clivage de PARP et de caspase 3. Cependant sa toxicité apparaît indépendante des caspases. La lipidation accrue de LC3 et la formation d’autophagolysosomes indiquent que le FTY720 augmente également le flux autophagique. Cependant, des inhibiteurs de l’autophagie ne permettent pas de bloquer la mort cellulaire induite par le FTY720, suggérant que l’autophagie a ici un rôle protecteur vis à vis de la toxicité du FTY720. Plusieurs éléments permettent de conclure que le FTY720 est responsable d’une nécrose cellulaire : aspect morphologique de nécrose en microscopie électronique, perméabilisation membranaire précoce avec relocalisation cytoplasmique de HMGB1, libération extracellulaire de LDH, perméabilisation de la membrane lysosomale associée à une activation des cathepsines. Au niveau moléculaire, l’action du FTY720 n’est pas bloquée par la nécrostatine 1, indiquant que la nécrose induite par le FTY720 est indépendante de RIPK1 (receptor interacJng protein 1), une kinase clef des voies extrinsèques de nécrose cellulaire programmée. Par contre, nos travaux ont établi l’implication de DRP1 (dynamin related protein), une enzyme régulatrice de la fission mitochondriale, dans le processus de nécrose induite par le FTY720. En plus d’une relocalisation précoce de DRP1 à la mitochondrie accompagnée d’une augmentation de sa phosphorylation sur des sites régulateurs de son activité, nos expériences montrent que la suppression de son expression par interférence à ARN dans les cellules leucémiques réduit fortement la mort cellulaire induite par le FTY720. Le FTY720 est donc responsable dans la LLC d’une nécrose cellulaire programmée dépendante de DRP1. Nos résultats illustrent l’implication des sphingolipides dans la régulation de la survie cellulaire et dans les voies de nécrose programmée. Le FTY720 a un mode d’action original différent de l’apoptose induite par les chimiothérapies classiques. Le FTY720 pourrait donc être une alternative thérapeutique dans les néoplasies B résistantes aux chimiothérapies usuelles et dans certaines manifestations auto‐immunes des hémopathies comme les neuropathies à anticorps anti‐MAG. / Fingolimod (FTY720) is an immunosuppressive drug that was recently approved for the treatment of multiple sclerosis and is currently under pre-clinical investigation as a therapy for a number of haematological malignancies. Previous studies have indicated a role for FTY720 in inducing autophagy and caspase-independent cell death in cancer cells through incompletely characterized molecular mechanisms. Our study thus aims at a beeer understanding of the way of action of FTY720. In chronic lymphocytic leukaemia (CLL) cells, FTY720 induced cell death with typical features of apoptosis, including phosphatidylserine exposure and caspase-3 activation, and features of autophagy, including LC3 conversion, autophagolysosome formation and lysosomal cathepsins activation. However, neither caspase nor autophagy blockade prevented the cytotoxic effect of FTY720, suggesting another mechanism of cell death. Using electron and fluorescence microscopy, flow cytometry and biochemical analyses, we found that FTY720 treatment increased a fraction of annexin V-/7-AAD+ cells both in primary and transformed leukemic cells and induced morphological changes representative of necrosis, including oncosis, mitochondrial and plasma membrane alteration. FTY720 treatment resulted in increased plasma membrane permeability as shown by the extracellular translocation of the nuclear high mobility group box 1 (HMGB1) protein and by the release into the culture medium of the cytosolic enzyme lactate dehydrogenase (LDH). Interestingly, cell death induced by FTY720 was not prevented by pharmacological inhibition of RIPK1 and PP2A. In contrast, FTY720--‐induced necrosis was accompanied by an early relocation to the mitochondria of Dynamin Related Protein 1, DRP1. Importantly, FTY720 stimulation led to ma tior changes in the phosphorylation of serine residues associated with the mitochondrial fission activity of DRP1. Finally, siRNA--‐mediated knockdown of DRP1 significantly reduced necrotic cell death induced by FTY720. In this study, we thus demonstrate that in leukemic cells the cytotoxic effect of the immunosuppressive drug Fingolimod involves a DRP1--‐dependent regulated necrosis. These observations are important in line of the future development of Fingolimod as a new therapeutic agent in haematological malignancies.

L’évaluation de l’effet cytotoxique de différents jus de fruits naturellement riches en polyphénols vis-à-vis de quatre lignées de cancer colorectal a montré que le jus de la canneberge est particulièrement actif. En effet, les polyphénols de la canneberge induisent l’apoptose associée à une surexpression des deux facteurs de transcription pro-apoptotiques p73 et FOXO3a. Cette mort programmée est aussi associée à une diminution de l’expression de SIRT1 le déacétylateur de protéines non histone telles que p73, KU70, ou FOXO. D’autres événements précoces comme la production de ROS et les dommages à l’ADN connus pour réguler l’expression de SIRT1 ont été confirmés. Une deuxième étude avait pour objectif de valider le potentiel anticancéreux in vivo chez la souris Balb/C injectée de cellules d’adénocarcinome colique murin. Pour cela nous avons choisi le jus d’aronie noire qui a montré in vitro un profil de cytotoxicité intéressant. L’analyse des tumeurs a montré que l’administration de jus d’aronie entraine une réduction de la prolifération des cellules tumorales. Enfin, l’augmentation significative de la mobilité de LC3 suggère l’activation d’une mort cellulaire autophagique. Afin d’évaluer l’utilisation clinique des polyphénols, nous avons évalué les effets cytotoxiques des polyphénols de myrtille sur des lymphocytes, de patients atteints de LLC. Nos résultats montrent que l’extrait polyphénolique induit une apoptose dépendante du stress oxydant et impliquant aussi des protéines pro-apoptotiques dans des cellules de patients atteints de LLC mais pas dans les cellules de sujets sains. / The evaluation of the cytotoxic effect of different fruit juices, naturally rich in polyphenols, on four different colorectal cancer cell lines proved that cranberry juice was the most active. Indeed, cranberry polyphenols induce apoptosis associated with the overexpression of two important proapoptotic transcription factors, p73 and FOXO3a on one hand. Furthermore, it has been also correlated with a decrease in the expression of SIRT1, the deacetylase of several non-histone proteins such as p73, KU70 and FOXO. Other early events such as ROS production and DNA damage, which are known to regulate the expression of SIRT1 were confirmed. The second study aims at validating the potential anticancer effects in an in vivo model of colorectal cancer in BALB/c mice injected subcutaneously of murine colon adenocarcinoma cells. Accordingly, we chose the black chokeberry juice, which showed an interesting cytotoxic profile in vitro. The analysis of tumors demonstrated that the administration of chokeberry juice leads to a reduction in tumor cell proliferation. Finally, the significant increase in the mobility of LC3 suggests the activation of autophagic cell death. To validate the clinical use of polyphenols, we evaluated the cytotoxic effects of blueberry polyphenols on lymphocytes of CLL patients. Our results show that the polyphenolic extract induces an oxidative stress-dependent apoptosis that involve various pro-apoptotic proteins in cells of patients with CLL but not in healthy subjects.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est particulièrement associée aux cytopénies auto-immunes (AIC). L’expression de ZAP-70 dans la LLC est un facteur pronostique,due à une forte signalisation par le BCR. Nous décrivons une nouvelle population B normale (LyBn) qui exprime ZAP-70. Ces LyBn ZAP-70+ ne semble pas appartenir à une sous-population LyB particulière, et elles n’ont pas un phénotype activé. L’expression de ZAP-70 dans les LyB naïves suggère que ce phénomène est précoce. Il y a une bonne corrélation dans le niveau de ZAP-70 entre les LyBn et les LyB de LLC. Les LyBn ZAP-70+ ont été retrouvé dans tous les cas de AIC associée à la LLC.L’analyse des anticorps monoclonaux prévenant de LyB ZAP-70+ et des souris ZAP-70KI, réalisés pendant ce travail, définiront les conséquences de la surexpression de ZAP-70 dans les LyB dans la pathogénèse de l’auto-immunité et de la lymphoprolifération. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is particularly associated with autoimmune cytopenia (AIC). The expression of ZAP-70 in CLL cells is a prognostic factor, through increased BCR signaling. We described a novel normal B cell population (LyBn) that expresses ZAP-70. ZAP-70+ LyBn do not seem to belong to a certain subset of B cells, nor seem to have an activated phenotype. The presence of ZAP-70 in the naïve B cell subset suggests that this is an early process, which probably occurs before malignant transformation. There is a good correlation in the level of ZAP-70 expression, between normal B cells and CLL B cells. We found a significant percentage of ZAP-70+ LyBn in all AIC-associated CLLs. Analysis of monoclonal antibodies and of conditional ZAP-70KI mouse model synthesized in this work will clarify the consequences of aberrant ZAP-70 expression in B cells on autoimmunity and lymphoproliferation.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la plus fréquente des leucémies de l'adulte, caractérisée par l'accumulation de lymphocytes B CD5+ anormaux dans le sang, la moelle osseuse, et les organes lymphoïdes secondaires. Les événements oncogéniques à l'origine du développement de la LLC sont peu connus. L'identification de nouveaux gènes dérégulés est importante afin d'améliorer notre compréhension du développement et de l'évolution de la LLC, et de proposer de nouvelles stratégies ciblées. Tout d'abord, nous avons montré que la LLC se développe à partir de progéniteurs hématopoïétiques multipotentes pré-leucémiques portant des mutations somatiques. J'ai également analysé la délétion 14q dans une large série de patients, et nous avons conclu que la del(14q) est associé à la trisomie 12 et à des facteurs pronostiques péjoratifs : IGHV non mutée, mutations NOTCH1, et une survie sans traitement plus courte. Enfin, la partie principale de ma thèse portrait sur la caractérisation du gain du bras court du chromosome 2 (2p). J'ai identifié une région minimale de gain chez les patients LLC/2p+ et démontré que CRM1/XPO1 (Exportin-1) se trouve dans cette région, et muté de façon récurrente dans la LLC. J'ai démontré que le gain 2p provoque la résistance aux traitements RFC, Ibrutinib, R-Idélalisib, et au Selinexor. Nos résultats révèlent également que le Selinexor est inefficace pour induire l'apoptose dans les cellules LLC-B muté pour XPO1. Au total, mon travail préconise l'évaluation du gain 2p et des mutations de XPO1 avant de décider d'un traitement de la LLC. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL), the most common adulthood leukemia, is characterized by an accumulation of abnormal CD5+ B-lymphocytes in the peripheral blood, bone marrow, and secondary lymphoid organs. The origin and pathogenic mechanisms of CLL are not fully understood. Identifying the deregulation of new genes is important to improve our understanding about CLL development and evolution, and to propose new targeted strategies. First, we have shown that CLL develops from pre-leukemic multipotent hematopoietic progenitors carrying somatic mutations. I have also analyzed the deletion 14q in a large series of patients, and we have concluded that del(14q) was associated with trisomy 12 and with pejorative prognostic factors: unmutated IGHV, NOTCH1 mutations, and a short treatment-free survival. Finally, the main part of my thesis was about the characterization of the short arm of chromosome 2 (2p). I identified a minimal region gained in 2p+/CLL patients and demonstrated that CRM1/XPO1 (Exportin-1) is located in this region, and recurrently mutated in CLL. I demonstrated that 2p gain provokes FCR, Ibrutinib, R-Idelalisib, and Selinexor drug resistance. Our results also reveal that Selinexor is inefficient in inducing apoptosis in CLL B-cells with mutations in XPO1. Altogether, my work advocates for the assessment of the 2p+ and XPO1 mutations before deciding a CLL therapy.

Les neuropathies à anticorps anti-MAG sont secondaires à une gammapathie monoclonale IgM dirigée contre la MAG des gaines de myéline des nerfs périphériques. Le traitement est celui de l'hémopathie sous‐jacente. Même si les thérapeutiques sont de plus en plus efficaces, les hémopathies restent le plus souvent incurables. Le rituximab est couramment utilisé dans le traitement des neuropathies à anticorps anti‐MAG, mais son efficacité n'a pas pu être clairement démontrée dans deux études contrôlées. Le FTY720 ou fingolimod est un sphingolipide, analogue de la sphingosine, qui inhibe les récepteurs de la sphingosine-1-phosphate (S1P). Il est utilisé comme immunosuppresseur dans la Sclérose en Plaques. Des études ont également rapporté un effet cytotoxique du FTY720 dans des hémopathies sans toutefois clairement expliquer son mécanisme d'action. L'objectif de ce travail est d'élucider les mécanismes moléculaires de l'effet cytotoxique du FTY720 dans un modèle d'hémopathie B, la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Des cellules leucémiques primaires de LLC et une lignée cellulaire MEC1 ont été utilisées comme modèle expérimental in vitro. Le FTY720, comme la sphingosine, entraîne une cytotoxicité dose‐dépendante dans la LLC. Cet effet, médié par la forme non phosphorylée de FTY720, est indépendant des récepteurs au S1P. Le FTY720 induit l'expression de marqueurs d'apoptose: exposition de la phosphaJdylsérine, clivage de PARP et de caspase 3. Cependant sa toxicité apparaît indépendante des caspases. La lipidation accrue de LC3 et la formation d'autophagolysosomes indiquent que le FTY720 augmente également le flux autophagique. Cependant, des inhibiteurs de l'autophagie ne permettent pas de bloquer la mort cellulaire induite par le FTY720, suggérant que l'autophagie a ici un rôle protecteur vis à vis de la toxicité du FTY720. Plusieurs éléments permettent de conclure que le FTY720 est responsable d'une nécrose cellulaire : aspect morphologique de nécrose en microscopie électronique, perméabilisation membranaire précoce avec relocalisation cytoplasmique de HMGB1, libération extracellulaire de LDH, perméabilisation de la membrane lysosomale associée à une activation des cathepsines. Au niveau moléculaire, l'action du FTY720 n'est pas bloquée par la nécrostatine 1, indiquant que la nécrose induite par le FTY720 est indépendante de RIPK1 (receptor interacJng protein 1), une kinase clef des voies extrinsèques de nécrose cellulaire programmée. Par contre, nos travaux ont établi l'implication de DRP1 (dynamin related protein), une enzyme régulatrice de la fission mitochondriale, dans le processus de nécrose induite par le FTY720. En plus d'une relocalisation précoce de DRP1 à la mitochondrie accompagnée d'une augmentation de sa phosphorylation sur des sites régulateurs de son activité, nos expériences montrent que la suppression de son expression par interférence à ARN dans les cellules leucémiques réduit fortement la mort cellulaire induite par le FTY720. Le FTY720 est donc responsable dans la LLC d'une nécrose cellulaire programmée dépendante de DRP1. Nos résultats illustrent l'implication des sphingolipides dans la régulation de la survie cellulaire et dans les voies de nécrose programmée. Le FTY720 a un mode d'action original différent de l'apoptose induite par les chimiothérapies classiques. Le FTY720 pourrait donc être une alternative thérapeutique dans les néoplasies B résistantes aux chimiothérapies usuelles et dans certaines manifestations auto‐immunes des hémopathies comme les neuropathies à anticorps anti‐MAG.