A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa e sua patogênese está associada à expressão de um neogene, bcr-abl, que codifica uma proteína tirosina quinase Bcr-Abl. Esse trabalho tem como objetivos o estudo dos mecanismos envolvidos na resistência à morte das células Bcr-Abl positivas e a identificação de alterações gênicas nessas células. Dados de expressão gênica global obtidos por \"microarray\" mostraram uma superexpressão nas células HL-60.Bcr-Abl com relação a HL-60 dos genes faim e nipa, que foi confirmada por qRT-PCR em diferentes linhagens celulares Bcr-Abl positivas. Já os genes de trail e osm, apresentaram uma diminuição significativa em HL-60.Bcr-Abl, que foi confirmada para trail, porém osm não teve seu resultado validado. A avaliação da expressão dos genes em células de pacientes portadores de LMC, em diferentes fases da doença também foi estudada. Com esses resultados, o presente estudo visa a melhor compreensão de como alterações na expressão desses genes contribuem na fisiopatologia da LMC. / Chronic myelogenous leukemia (CML) is a stem cell disease characterized by the presence of the Bcr-Abl oncoprotein, which is the cause of the malignant transformation and the extreme resistance to apoptosis displayed by CML patients. Our aim was to analyze the alteration in global gene expression in Bcr-Abl expressing cells. Data obtained from microarray analysis showed significant up-regulation of nipa and faim in HL60.Bcr-Abl and down-regulation of osm and trail. These results were further confirmed by Real-Time PCR to nipa, faim and trail, but not for osm expression in HL-60.Bcr-Abl cells. To evaluate the potential of some of the modified genes as therapeutic targets or prognostic markers for CML, we also analyzed the expression of these genes in samples from CML patients.

Fosfoetanolamina sintética (Pho-s) é um monoéster análogo à fosfoetanolamina da membrana celular fosforilada artificialmente, com propriedades antiinflamatórias e apoptóticas para vários tipos de células tumorais humanas e murinas. Neste projeto foram avaliados os efeitos antitumorais in vitro da Pho-s e da formulação lipossomal DODAC/Pho-s na linhagem tumoral de leucemia mielóide crônica humana (K-562), em comparação ao modelo resistente a múltiplas drogas K-562 Lucena (MDR+). Os efeitos de citotoxicidade da Pho-s na linhagem tumoral K-562 e K-562 Lucena (MDR+) foram avaliados pela viabilidade celular utilizando o teste da Sulforodamina B, e os valores da IC50% obtidos foram de 43.1 mM e 145.9 mM, respectivamente após 24 horas de tratamento. O tratamento com o carreador DODAC vazio nas células K-562 e K-562 Lucena (MDR+) a IC50% foi de 0,0003mM e 0,008mM respectivamente, e com o tratamento com a formulação lipossomal DODAC/Pho-s a IC50% obtida respectivamente de, 0,56 mM e 0,31 mM. A viabilidade celular foi determinada a exclusão pelo azul de tripan 0,2%, em sistema automatizado Vi-Cell e foram significativas as diminuições da viabilidade celular em comparação ao grupo controle não tratado nas diversas concentrações e em diferentes períodos de tempo de tratamento. As alterações nas distribuições nas populações celulares nas fases do ciclo celular determinadas por citometria de fluxo mostraram aumento do DNA fragmentado (Sub/G1) em 12 e 24 horas de tratamento. Atividade apoptótica das células tumorais pela expressão da Anexina V/PI, no estágio de apoptose inicial, apoptose tardia e necrose foram quantificadas em citometria de fluxo, o tratamento com Pho-s, quando comparado ao grupo controle K-562 (40 e 80 mM) e K-562 Lucena (MDR+) (146 e 292 mM) ocorreu aumento significativo do número de células apoptóticas e em menor percentual o número de células necróticas. O tratamento com a Pho-s em célula leucêmica K-562 e K-562 Lucena (MDR+) tratadas, respectivamente com 40 e 80 mM e 146 e 292 mM mostraram que independente da expressão do fenótipo de resistência há uma redução significativa no potencial elétrico mitocondrial, analisado pelo o ensaio da rodamina-123. Os marcadores de controle e progressão do ciclo celular e da apoptose, mostraram efeitos moduladores da Pho-s dependentes da p53 na expressão da moléculas pró-apoptóticas. Esse conjunto de informações demonstrou os efeitos apoptóticos da Pho-s e da formulação lipossomal nas células tumorais independentemente do perfil molecular de resistência (MDR+), o que possibilita dizer que esse composto possui significativo potencial terapêutico nesse grupo de leucemias / Synthetic phosphoethanolamine (Pho-s) is a monoester analogous to the phosphoethanolamine which composes the membrane of an artificially phosphorylated cell, with anti-inflammatory and apoptotic properties for various types of human and murine tumor cells. In this project, we evaluated in vitro antitumor effects of Pho-s and the DODAC/Pho-s liposomal formulation in the human chronic myeloid leukemia (K-562) tumor line in comparison with the K-562 Lucena (MDR+). The effects of cytotoxicity of Pho-s on K-562 and K-562 Lucena (MDR +) tumor cells lines were evaluated by cell viability using the Sulforhodamine B test, and the IC50% values obtained were 43.1 mM and 145.9 mM after 24 hours of treatment, respectively. Treatment with the empty DODAC carrier on the K-562 and K-562 Lucena (MDR+) at IC50% cells was 0.0003 mM and 0.008 mM, and the treatment with the DODAC/Pho-s liposomal formulation obtained results of 0.56 mM and 0.31 mM, respectively. Cell viability was determined by 0.2% trypan blue exclusion in automated Vi-Cell system and the decreases in cell viability were significant in comparison to the untreated control group at various concentrations and different treatment time periods. Alterations in the distributions of cell populations in the cell cycle phases determined by flow cytometry showed increment of fragmented DNA (Sub/G1) in 12 and 24 hours of treatment. Apoptotic activity of tumor cells by the expression of Annexin V/PI, in the early apoptosis, late apoptosis phase and necrosis stage were quantified in flow cytometry, the treatment with Pho-s, when compared to the control group K-562 (40 and 80 mM) and K-562 Lucena (MDR +) (146 and 292 mM) demonstrated that there was a significant increase in the number of apoptotic cells and, in a lower percentage, the number of necrotic cells. Treatments with Pho-s in leukemic cell K-56 with 40 and 80 mM and in K-562 Lucena (MDR+) with 146 and 292 mM showed that independent of the expression of the resistance phenotype there is a significant reduction in the electrical potential of the mitochondrial membrane, analyzed with the rhodamine-123 assay. Control and progression markers of cell cycle and apoptosis showed p53-dependent modulating effects on the expression of pro-apoptotic molecules. This set of information demonstrated the apoptotic effects of Pho-s and liposomal formulation on tumor cells independently of the molecular resistance profile (MDR+), which makes it possible to say that this compound has significant therapeutic potential in this group of leukemias

INTRODUÇÃO: O impacto do aumento de expressão do fator de crescimento endotelial no curso da Leucemia Mielóide Crônica (LMC) ainda é desconhecido, porém há relatos de que estes pacientes apresentam maior densidade vascular em medula óssea do que em indivíduos saudáveis, principalmente em crise blástica. Outro fator recentemente associado ao aumento da angiogênese é a expressão anormal da proteína hsecurina, que, por sua vez, inibi uma protease denominada separase, responsável pela separação das cromátides irmãs durante a anáfase da mitose. Por esses motivos, quantificamos células endoteliais circulantes e VEGF em portadores de LMC como marcador de angiogênese e expressão do gene hsecurina. MÉTODOS: Realizamos análise prospectiva e consecutiva de uma coorte de 31 pacientes com LMC em fase crônica ao diagnóstico, 23 em crise blástica, 30 em fase acelerada, atendidos no ambulatório de Hematologia da FMUSP e 50 indivíduos saudáveis, doadores de plaquetas por aférese, para quantificação da porcentagem de células endoteliais circulantes e subtipos pelo método de citometria de fluxo no laboratório de Imunopatologia HC/FMUSP. Desta coorte 25 pacientes em fase crônica, 14 em crise blástica, 26 em fase acelerada e 32 indivíduos saudáveis foram analisados para os genes hsecurina e VEGF por PCR quantitativo em tempo real. RESULTADOS: A mediana da porcentagem das células endoteliais circulantes foi de 0, 0146% em LMC em crise blástica e 0,0059% no grupo controle, p < 0,01 às custas das células endoteliais maduras (p < 0,01). A mediana de células endoteliais circulantes em crise blástica foi de 0, 0146%, superior à da fase acelerada (0,0059%), p < 0,01 com predomínio de células endoteliais maduras (p < 0,01). Em relação à expressão do gene VEGF observamos aumento estatisticamente significativo nas fases crônica (p < 0,01), acelerada (p < 0,01) e crise blástica (p = 0,04). Encontramos aumento significativo da expressão do gene hsecurina na crise blástica da doença, com mediana de 0,390 em relação aos grupos controle com mediana de 0,125 (p < 0,01) e fase acelerada, com mediana de 0,230 (p = 0,04). Os pacientes na fase crônica da doença apresentaram mediana de 0,260 e p = 0,03 quando comparados com o grupo controle. CONCLUSÃO: Observamos neste estudo que a quantificação de CEC é uma ferramenta útil para predizer e identificar precocemente a progressão da LMC para fase blástica, diferentemente da variável VEGF que foi elevado em todas as fases da doença. A expressão do gene hSecurina na fase crônica da doença foi significantemente alta, demonstrando provável relação com a elevação da taxa de proliferação celular. Entretanto, estudos complementares do gene hSecurina deverão ser realizados na crise blástica da LMC, para entendermos com precisão o real significado nesta fase da doença. / INTRODUCTION: The impact of the increased expression of vascular endothelial growth factor in the course of chronic myeloid leukemia (CML) is still unknown, but there are reports that those patients have higher vascular density in bone marrow than healthy individuals, particularly in blast crisis. Another factor recently associated with increased angiogenesis is the abnormal expression of protein hSecurin, which, in turn, inhibits a protease called separase, responsible for the separation of sister chromatids during the anaphase of mitosis. For these reasons, we quantified circulating endothelial cells and VEGF in patients with CML as a marker of angiogenesis and hSecurin gene expression. METHODS: We performed a prospective analysis of consecutive cases in a cohort of 31 patients with CML in chronic phase at diagnosis, 23 in blast crisis, 30 in accelerated phase who attended the outpatient Hematology FMUSP ward, and 50 healthy subjects, platelet apheresis donors, for quantification of the percentage of circulating endothelial cells and subtypes through the flow cytometry method, at HC/FMUSP Immunopathology laboratory. In this cohort, 25 patients in chronic phase, 14 in blast crisis, 26 in accelerated phase, and 32 healthy subjects were tested for the genes VEGF and hSecurin by quantitative real-time PCR. RESULTS: The median percentage of circulating endothelial cells was 0.0146% in CML in blast crisis and 0.0059% in the control group, p <0.01 at the expense of mature endothelial cells (p <0.01). The median circulating endothelial cells in blast crisis was 0.0146% higher than in accelerated phase (0.0059%), p <0.01 with predominance of mature endothelial cells (p <0.01). Regarding the expression of the VEGF gene, a statistically significant increase was observed in chronic phase (p <0.01), accelerated (p <0.01) and blast crisis (p = 0.04). We found a significant increase in hSecurin gene expression in blast crisis disease, with a median of 0.390 compared to control groups, with a median of 0.125 (p <0.01) and accelerated phase, with a median of 0.230 (p = 0.04). Patients with chronic disease had a median of 0.260 and p = 0.03 compared with the control group. CONCLUSION: In this study, we observed that the quantification of CPB is a useful tool to predict and identify the early progression of CML to blast phase, unlike the VEGF variable, which was elevated in all stages of the disease. The expression of hSecurin gene in chronic phase was significantly higher, demonstrating a likely relationship with the increased cell proliferation rate. However, further studies of hSecurin gene should be made in the blastic crisis of CML to understand precisely the real meaning at this stage of the disease.

Bcr-Abl é a tirosina quinase (TK) responsável por causar a Leucemia Mielóide Crônica (LMC). Os últimos estudos de follow-up mostram que apenas 50% dos pacientes tratados com a segunda geração de inibidores de TK atinge a remissão completa, o que significa que metade desses pacientes necessita de um algo melhor do que está disponível. Wiskott Aldrich Syndrome Protein (WASP) é um gene essencial para o bom desenvolvimento e função das células hematopoiéticas. Ante esse contexto, decidimos investigar se WASP poderia ter algum papel ou relevância na LMC. Em conclusão, Bcr-Abl suprime a expressão WASP por um mecanismo epigenético. A re-expressão de WASP torna as células mais suscetíveis à apoptose em resposta ao Imatinib. Sugerimos que a recuperação da expressão WASP deve ser discutida como estratégia para a terapia da LMC. / Bcr-Abl is the tyrosine kinase (TK) responsible for causing Chronic Myeloid Leukemia (CML). This fusion protein up- and down-regulates several genes and pathways, producing a strong resistance to apoptosis and a blockage of cell maturation in the hematopoietic compartment. The last follow-up studies provided that only 50% of the patients treated with second generation achieve complete remission, what means that one-half of these patients needs something better. Wiskott Aldrich Syndrome Protein (WASP) is an essential gene for the proper development and function of the hematopoietic cells. In the light of this background, we decided to investigate if WASP could have some role or relevance in the CML context. In conclusion, Bcr-Abl suppresses WASP expression by an epigenetic mechanism. The re-expression of WASP makes the CML cells more susceptible to apoptosis and contribute to respond to Imatinib. We suggest that recovery of WASP expression should be discussed as a new and additional strategy for CML therapy.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa clonal caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia e o oncogene BCR-ABL1. Este oncogene codifica a oncoproteína Bcr-Abl com atividade tirosina-quinase constitutiva. A proteína Bcr-Abl é responsável pela resistência das células leucêmicas a apoptose. Atualmente, os pacientes com LMC são tratados com os inibidores de tirosina-quinase - mesilato de imatinibe, dasatinibe e nilotinibe. Apesar de o tratamento ser eficiente, pacientes em fases avançadas e mesmo na fase crônica da doença, apresentam resistência à terapia. Desta forma, novos fármacos devem ser investigados para melhorar o tratamento da LMC. As L-aminoácido oxidases (LAAOs) têm sido descritas como substâncias citotóxicas e indutoras de apoptose. Assim, o principal objetivo do presente estudo foi investigar o potencial antitumoral da LAAO isolada da serpente Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) nas células Bcr-Abl positivas. Avaliou-se a citotoxicidade da CR-LAAO nas linhagens HL-60 (linhagem Bcr-Abl negativa), HL-60.Bcr-Abl, K562 e KCL22 (linhagens Bcr-Abl positivas) e nas células mononucleares (MNC) de sangue periférico de indivíduos saudáveis, na presença ou ausência da catalase. Para investigar os mecanismos da ação citotóxica da CR-LAAO, realizou-se os ensaios de indução de apoptose por meio da quantificação das percentagens de núcleos hipodiplóides e anexina V-FITC, nas linhagens celulares e nas células MNC de indivíduos saudáveis e pacientes com LMC. Avaliou-se também os níveis de expressão das caspases 3, 8 e 9, o potencial de membrana mitocondrial, danos no DNA e o efeito apoptótico da toxina combinada com os inibidores de tirosina-quinase nas linhagens Bcr-Abl positivas. Além disso, investigamos se a CR-LAAO foi capaz de modular a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-146a, miR-21, miR-130a e miR-130b, assim como das proteínas pro- e anti-apoptóticas Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 e Mcl-1 nas linhagens Bcr-Abl positivas. Nossos resultados mostraram que o efeito citotóxico da CR-LAAO foi mais potente nas linhagens Bcr-Abl positivas em relação às células MNC de indivíduos saudáveis, e está associado ao peróxido de hidrogênio produzido durante a reação enzimática da CR-LAAO. Demonstrou-se também que a CR-LAAO induziu apoptose nas linhagens Bcr-Abl postivas testadas e nas células MNC de pacientes com LMC na fase crônica da doença. Em todas as linhagens celulares detectou-se danos no DNA, perda do potencial de membrana e ativação das caspases 3, 8 e 9. A percentagem de apoptose aumentou quando as células HL-60.Bcr-Abl foram tratadas com a CR-LAAO combinada com os inibidores de tirosina-quinase. A CR-LAAO modulou a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a e miR-130b e de possíveis proteínas alvos nas linhagens Bcr-Abl positivas. Sendo assim, os resultados obtidos sugerem que a CR-LAAO apresenta uma ação antitumoral capaz de destruir as células leucêmicas / Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative disease characterized by the presence of Philadelphia chromosome and BCR-ABL1 oncogene. This oncogene encodes the Bcr-Abl tyrosine kinase (TK) which presents a constitutive activity. The Bcr-Abl is responsible for leukemic cells resistance to apoptosis. The CML patients are currently treated with tyrosine kinase inhibitors (TKI) - imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib. Although TKI are efficient for CML treatment, patients in advanced phases and even in chronic phase of the disease present resistance to therapy. Thus, potential new drugs must be investigated to improve the CML treatment. The L-amino acid oxidases (LAAOs) have been described as cytotoxic and apoptosis-inducing substances. Here, we investigated the LAAO from Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) antitumoral potential against Bcr-Abl positive cells. We evaluated the CR-LAAO cytotoxic effect against HL-60 (Bcr-Abl negative cell line), HL-60.Bcr-Abl, K562, KCL22 (Bcr-Abl positive cell lines) and the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy subjects, in the presence or absence of catalase. To investigate the mechanisms underlying the CR-LAAO cytotoxic action, we performed the apoptosis induction assays through the hypodiploid nuclei and annexin-V quantification in the cell lines and PBMC from healthy subjects and CML patients. We also evaluated the levels of caspases 3, 8 and 9 expression, the mitochondrial membrane potential, DNA damage and the apoptotic effect of CR-LAAO combined with TKI on Bcr-Abl positive cells. In addition we investigated if CR-LAAO was capable of modulating the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-29c, hsa-let-7d, miR-145, miR-146a, miR-21, miR-130a, miR-130b, miR-142-3p and miR-26a, the pro- and anti-apoptotic proteins (Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 and Mcl-1 expression in HL-60, HL-60.Bcr-Abl, K562 and KCL22 cells. Our results showed that the CR-LAAO cytotoxic effect was more potent in Bcr-Abl positive cell lines than in PBMC from healthy subjects and it is linked to hydrogen peroxide produced during the enzymatic action of CR-LAAO. It was also demonstrated that CR-LAAO was capable of inducing apoptosis in Bcr-Abl positive cell lines and CML patient\'s cells in chronic phase of the disease. In all tested cell lines, the loss of mitochondrial membrane potential, DNA damage and caspases 3, 8 and 9 activation were detected. The apoptosis percentage was improved when HL-60.Bcr-Abl cells were treated with CR-LAAO combined with TKI. The CR-LAAO modulated the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a and miR-130b expression as well the predict target proteins levels on Bcr-Abl positive cells. Thus, our results suggest that CR-LAAO presents an antitumoral action capable of destroying the CML cells.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:51:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Completa.pdf: 5651353 bytes, checksum: 51c96a7210d03ea18a0c2bf0251eec36 (MD5) Previous issue date: 2009-06-01 / As leucemias são desordens proliferativa nas células tronco hematopoiéticas pluripotentes caracterizada por mutações que comprometem seus precursores mielóides ou linfóides levando ao desenvolvimento de leucemias similares quanto ao fenótipo (Mielóide ou Linfóide) e forma (Crônica ou Aguda). Descrito em 1960, o cromossomo philadelphia (Ph) foi a primeira anomalia cromossômica associada a uma neoplasia, a Leucemia Mielóide Crônica (LMC). Em 1973, foi demonstrado que o cromossomo Ph resulta da translocação recíproca entre os braços longos do cromossomo 9 e 22 [t(9;22)(q34;q11)], produzindo um gene quimérico BCR-ABL, encontrado em 95% dos casos de LMC. A proteína quimérica codificada, BCR-ABL, com atividade tirosina quinase descontrolada, é o fator causal da LMC. Durante os anos 1990, uma série de moléculas sintéticas foram desenvolvidas e testadas para inibir especificamente a atividade tirosina quinase da proteína BCR-ABL, o Imatinib (STI-571 ou Gleevec) foi a primeira dessas drogas aprovadas e usadas como agente terapêutico contra a LMC, demonstrando redução do número de células leucêmicas em quase todos pacientes. No entanto muitos pacientes com resistências primárias ou secundárias foram frequentemente relatados. Os mecanismos de resistência são provavelmente heterogêneos, e no mínimo dois mecanismos envolvendo o gene BCR-ABL foram descritos em estudos realizados in vivo: amplificação do gene e ocorrência de mutações que resultam em substituições de aminoácidos associadas com o fenótipo de resistência. Diferentes níveis de resistência são frequentemente associadas a mutações pontuais recorrentes encontradas no domínio quinase da proteína c-ABL em regiões como: sítio catalítico, alça de ativação (A-loop) e alça de fosforilação (P-loop). Os primeiros estudos computacionais foram realizados com o mutante Thr334Ile e mutações na região do P-loop, e ajudaram a entender num nível molecular, os mecanismos de resistência ao Imatinib. Neste trabalho, realizamos um estudo estrutural e termodinâmico das interações entre os ligantes Imatinib e Nilotinib no sítio ativo da proteína c-ABL selvagem e em 12 proteínas com mutações específicas, além de determinar a importância do solvente (com particular interesse na molécula de água denominada Cw - que medeia a interação fármaco-proteína) no processo de resistência aos fármacos. No presente trabalho, utilizamos o método semi-empírico de energia de interação linear (LIE) de maneira alternativa: analisando as interações entre diferentes mutantes da proteína c-ABL e um inibidor (Imatinib ou Nilotinib). Os coeficientes de LIE obtidos foram os seguintes: com Cw fixa (restrição de Cw na posição inicial) = 0,2169; = 0,0654; = 1,4159; e Cw livre (sem restrição de Cw na posição inicial) = 0,0394; = 0,0077; = -2,0503. O melhor ajuste dos coeficientes de LIE foram obtidos nas simulações sem restrição da posição inicial de uma molécula de água conservada (Cw), essa escolha foi baseada no valor de energia livre absoluta da proteína c-ABL selvagem ( ) ser sempre um número mais negativo quando comparado com o valor da energia livre absoluta de cada proteína c-ABL mutada. O uso do método LIE (Linear Interaction Energy) com essa estratégia foi eficiente para analisar o efeito da interação entre diferentes proteínas c-ABL mutantes e um ligante (Imatinib ou Nilotinib). Até o momento não existem simulações de dinâmica molecular na presença de outros domínios da proteína BCR-ABL: SH2 e SH3.

As leucemias cromossomo Ph-positivas estão intimamente associadas à expressão da tirosina-quinase Bcr-Abl. Esta oncoproteína promove independência de fatores de crescimento, alterações na adesão e inibição da apoptose por mecanismos ainda não totalmente elucidados. O objetivo desse estudo foi avaliar a contribuição da atividade quinase de Bcr-Abl para seu potencial anti-apoptótico e identificar alterações moleculares envolvidas na transformação celular induzida por essa proteína. Nossos resultados sugerem que a resistência à apoptose não depende da manutenção constante da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, tampouco da presença de proteínas fosforiladas em tirosina. A comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl revelou que a presença de Bcr-Abl causa alterações profundas no padrão de expressão protéica. As proteínas afetadas estão associadas a diversos processos celulares, como adesão, transdução de sinais, proliferação e morte celular. Esses achados devem contribuir para a identificação de novos marcadores de prognóstico e alvos terapêuticos. / Ph chromosome-positive leukemias are closely associated with the expression of Bcr-Abl tyrosine kinase. This oncoprotein promotes growth factor independence, alters cell adhesion and confers resistance to apoptosis by mechanisms that are not fully understood. The aim of this study was to evaluate the contribution of Bcr-Abl kinase activity for its antiapoptotic potential and identify molecular alterations involved in Bcr-Abl-induced cell malignant transformation. Our results suggest that Bcr-Abl is not required to be constantly active to maintain the resistance to apoptosis and pY-containing proteins may not be responsible for the antiapoptotic effect of Bcr-Abl. The comparison between the proteome of HL-60.vector and HL-60.Bcr-Abl cells revealed that the presence of Bcr-Abl alters the expression of a great variety of proteins. The affected molecules are associated with several cellular processes, including cell adhesion, signal transduction, proliferation and cell death. Our findings might help the identification of new prognostic markers and therapeutic targets.

A galectina-1 (LGALS1) participa em diferentes etapas da neoplasia, mas sua função na leucemia mielóide crônica (LMC) é desconhecida. Neste trabalho, a expressão etópica de BCR-ABL selvagem, mas não de BCR-ABL quinase deficiente, em linhagens celulares hematopoéticas, resultou em aumento de LGALS1. O efeito foi revertido com a inibição da tirosina quinase pelo mesilato de imatinibe. Este resultado indicou que a galectina-1 é modulada pela atividade tirosina-quinase de BCR-ABL. Em pacientes com LMC, a maior expressão de LGALS1 foi correlacionada a altos níveis de BCR-ABL, progressão da doença e a um tempo de sobrevida menor. Adicionalmente, as células K562 com LGALS1 inibida por RNA de interferência exibiram crescimento mais lento do que as células K562 com LGALS1 intacta, em camundongos nude. Portanto, o pior prognóstico de pacientes com altos níveis de galectina-1 sugere um efeito cooperativo de galectina-1 na tumorigênese de BCR-ABL reforçando o conceito de que a galectina-1 é um forte candidato para intervenção terapêutica na LMC. / Galectin-1 (LGALS1) participates in different steps of neoplasia but its role in chronic myeloid leukemia (CML) is unknown. In this work, ectopic expression of wild-type but not kinase-deficient BCR-ABL in different hematopoietic cells resulted in LGALS1 upregulation. Tyrosine-kinase inhibition by imatinib mesylate reversed this effect. This result indicate that galectin-1 is modulated by tyrosine kinase activity. In CML patients, the elevated expression of LGALS1 was correlated with high BCR-ABL levels, disease progression and shorter survival time. Additionally, in nude mice, LGALS1-deficient K562 cells obtained by RNA interference were less efficient in tumor formation than control K562 cells. Therefore, the worst prognosis in patients bearing high LGALS1 levels suggests a cooperative role for galectin-1 in BCR-ABL-positive leukemia and support the concept that galectin-1 is a strong candidate for CML therapeutic intervention.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa caracterizada citogeneticamente pela presença do cromossomo Philadelfia (Ph) e molecularmente pelo neogene bcr-abl1 que codifica a oncoproteína BCR-ABL com alta atividade de tirosina-quinase. A célula leucêmica BCR-ABL+ apresenta baixa adesão ao estroma medular, resistência à apoptose e potencial mitogênico exacerbado. A LMC possui curso evolutivo trifásico (fase crônica, acelerada e blástica) e seu tratamento pode ser realizado por meio de diferentes modalidades terapêuticas, destacando-se o mesilato de imatinibe (MI) que inibe a TK BCR-ABL induzindo altas taxas de remissão citogenética dos pacientes na fase crônica da doença. Apesar do MI ser eficiente, os pacientes na fase acelerada e blástica da doença são comumente refratários a essa terapia e na fase crônica há casos de resistência ao MI descritos. Nesse contexto, potenciais novos fármacos são investigados para melhorar a eficiência da terapia da LMC. Nesse estudo, investigamos o efeito do veneno bruto (VB) e da enzima L-amino-ácido-oxidase (LAAO) da Bothrops pirajai em desencadear apoptose em células BCR-ABL+. A apoptose das células HL-60 e HL-60.BCR-ABL foi quantificada pela detecção da percentagem de células com núcleos hipodiplóides pela da citometria de fluxo e confirmada pela observação da ativação das caspases 3, 8 e 9 por western-blot. Os resultados obtidos indicam que a LAAO é capaz de induzir apoptose em células HL-60 e HL-60.BCR-ABL por ativação das vias extrínseca e intrínseca. Além disso, foi verificado que a LAAO diminui a fosforilação de BCR-ABL em células HL-60.BCR-ABL e quando associada ao MI potencializou a inibição da atividade quinase de BCR-ABL. Os dados da presente investigação indicaram ainda que a LAAO é capaz de modular a expressão de bad, bak, bax, bid, bimel, fas,fasl, a1, bcl-2, bcl-xl, bcl-w e c-flip, genes reguladores da apoptose celular. Apesar do pouco conhecimento acerca do mecanismo de ação dessa toxina, os dados obtidos sugerem que a LAAO possui o potencial de estimular a apoptose nas linhagens HL-60 e HL-60.BCR-ABL e aumentar o efeito do inibidor da atividade quinase, MI, dados relevantes para estudos futuros associados a descrição de novos fármacos contra leucemia mielóide crônica. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder cytogenetically characterized by the presence of Philadelphia chromosome (Ph) and molecularly by bcr-abl1 neogene that encodes the BCR-ABL oncoprotein with high tyrosine kinase (TK) activity. The leukemic cell BCR-ABL+ presents poor adhesion to bone marrow stroma, resistance to apoptosis and exacerbated mitogenic potential. The CML has a three-phase course (chronic, accelerated and blastic phase) and its treatment can be performed by different therapeutic modalities, especially the imatinib mesylate (IM) that inhibits the TK BCR-ABL inducing high rates of cytogenetic remission in chronic phase. Although MI is effective, patients in accelerated and blastic phases of the disease are often refractory to this therapy and there are also cases of resistance to MI described in chronic phase. In this context, potential new drugs are investigated to improve the efficiency of the therapy of CML. In this study, we investigated the effect of crude venom (CV) and of the enzyme L-amino acid oxidase (LAAO) from Bothrops pirajai in triggering apoptosis in BCR-ABL+. The apoptosis of HL-60 cells and HL-60. BCR-ABL was quantified by detecting the percentage of cells with hypodiploid nuclei by flow cytometry and confirmed by observation of the activation of caspases 3, 8 and 9 by Western blot. The results indicate that LAAO is able to induce apoptosis in HL-60 cells and HL-60. BCR-ABL by activation of the extrinsic and intrinsic pathways. Furthermore, it was found that LAAO decreases phosphorylation of BCR-ABL in HL-60 cells. BCR-ABL when associated with MI potencialized the inhibition of kinase activity of BCR-ABL. The data from this study also indicated that the LAAO is able to modulate the expression of bad, bak, bax, bid, bimel, fas, FasL, A1, bcl-2, bcl-xl, bcl-w and c-flip, regulatory genes of apoptosis. Even though there is little knowledge about the mechanism of action of this toxin, the data obtained suggests that LAAO has the potential to stimulate apoptosis in HL-60 lines and HL-60. BCR-ABL and increase the effect of the inhibitor of protein kinase activity, MI, relevant data for future studies associated with the description of new drugs against chronic myeloid leukemia.

Fosfoetanolamina sintética (Pho-s) é um monoéster análogo à fosfoetanolamina da membrana celular fosforilada artificialmente, com propriedades antiinflamatórias e apoptóticas para vários tipos de células tumorais humanas e murinas. Neste projeto foram avaliados os efeitos antitumorais in vitro da Pho-s e da formulação lipossomal DODAC/Pho-s na linhagem tumoral de leucemia mielóide crônica humana (K-562), em comparação ao modelo resistente a múltiplas drogas K-562 Lucena (MDR+). Os efeitos de citotoxicidade da Pho-s na linhagem tumoral K-562 e K-562 Lucena (MDR+) foram avaliados pela viabilidade celular utilizando o teste da Sulforodamina B, e os valores da IC50% obtidos foram de 43.1 mM e 145.9 mM, respectivamente após 24 horas de tratamento. O tratamento com o carreador DODAC vazio nas células K-562 e K-562 Lucena (MDR+) a IC50% foi de 0,0003mM e 0,008mM respectivamente, e com o tratamento com a formulação lipossomal DODAC/Pho-s a IC50% obtida respectivamente de, 0,56 mM e 0,31 mM. A viabilidade celular foi determinada a exclusão pelo azul de tripan 0,2%, em sistema automatizado Vi-Cell e foram significativas as diminuições da viabilidade celular em comparação ao grupo controle não tratado nas diversas concentrações e em diferentes períodos de tempo de tratamento. As alterações nas distribuições nas populações celulares nas fases do ciclo celular determinadas por citometria de fluxo mostraram aumento do DNA fragmentado (Sub/G1) em 12 e 24 horas de tratamento. Atividade apoptótica das células tumorais pela expressão da Anexina V/PI, no estágio de apoptose inicial, apoptose tardia e necrose foram quantificadas em citometria de fluxo, o tratamento com Pho-s, quando comparado ao grupo controle K-562 (40 e 80 mM) e K-562 Lucena (MDR+) (146 e 292 mM) ocorreu aumento significativo do número de células apoptóticas e em menor percentual o número de células necróticas. O tratamento com a Pho-s em célula leucêmica K-562 e K-562 Lucena (MDR+) tratadas, respectivamente com 40 e 80 mM e 146 e 292 mM mostraram que independente da expressão do fenótipo de resistência há uma redução significativa no potencial elétrico mitocondrial, analisado pelo o ensaio da rodamina-123. Os marcadores de controle e progressão do ciclo celular e da apoptose, mostraram efeitos moduladores da Pho-s dependentes da p53 na expressão da moléculas pró-apoptóticas. Esse conjunto de informações demonstrou os efeitos apoptóticos da Pho-s e da formulação lipossomal nas células tumorais independentemente do perfil molecular de resistência (MDR+), o que possibilita dizer que esse composto possui significativo potencial terapêutico nesse grupo de leucemias / Synthetic phosphoethanolamine (Pho-s) is a monoester analogous to the phosphoethanolamine which composes the membrane of an artificially phosphorylated cell, with anti-inflammatory and apoptotic properties for various types of human and murine tumor cells. In this project, we evaluated in vitro antitumor effects of Pho-s and the DODAC/Pho-s liposomal formulation in the human chronic myeloid leukemia (K-562) tumor line in comparison with the K-562 Lucena (MDR+). The effects of cytotoxicity of Pho-s on K-562 and K-562 Lucena (MDR +) tumor cells lines were evaluated by cell viability using the Sulforhodamine B test, and the IC50% values obtained were 43.1 mM and 145.9 mM after 24 hours of treatment, respectively. Treatment with the empty DODAC carrier on the K-562 and K-562 Lucena (MDR+) at IC50% cells was 0.0003 mM and 0.008 mM, and the treatment with the DODAC/Pho-s liposomal formulation obtained results of 0.56 mM and 0.31 mM, respectively. Cell viability was determined by 0.2% trypan blue exclusion in automated Vi-Cell system and the decreases in cell viability were significant in comparison to the untreated control group at various concentrations and different treatment time periods. Alterations in the distributions of cell populations in the cell cycle phases determined by flow cytometry showed increment of fragmented DNA (Sub/G1) in 12 and 24 hours of treatment. Apoptotic activity of tumor cells by the expression of Annexin V/PI, in the early apoptosis, late apoptosis phase and necrosis stage were quantified in flow cytometry, the treatment with Pho-s, when compared to the control group K-562 (40 and 80 mM) and K-562 Lucena (MDR +) (146 and 292 mM) demonstrated that there was a significant increase in the number of apoptotic cells and, in a lower percentage, the number of necrotic cells. Treatments with Pho-s in leukemic cell K-56 with 40 and 80 mM and in K-562 Lucena (MDR+) with 146 and 292 mM showed that independent of the expression of the resistance phenotype there is a significant reduction in the electrical potential of the mitochondrial membrane, analyzed with the rhodamine-123 assay. Control and progression markers of cell cycle and apoptosis showed p53-dependent modulating effects on the expression of pro-apoptotic molecules. This set of information demonstrated the apoptotic effects of Pho-s and liposomal formulation on tumor cells independently of the molecular resistance profile (MDR+), which makes it possible to say that this compound has significant therapeutic potential in this group of leukemias