Le site d’action des bactériocines de la sous-classe IIa est la membrane cytoplasmique des bactéries à Gram positif. Le mécanisme d’action se décompose en trois étapes : (i) adsorption de la bactériocine sur la membrane ; (ii) structuration du peptide et insertion dans la bicouche lipidique ; (iii) formation de pores. La présence de pores provoque des fuites de composés vitaux aboutissant soit à un arrêt de la croissance soit à la mort de la bactérie. Le degré de pénétration de la mésentérocine 52A dans la membrane a été mesuré grâce à l’anisotropie de fluorescence de deux sondes, le TMA-DPH et le DPH, respectivement localisées à la surface et en profondeur de la bicouche lipidique. Des résultats différents ont été obtenus avec deux espèces bactériennes appartenant au genre Listeria. Dans un cas, le peptide s’insère partiellement dans la membrane et dans l’autre en profondeur. Ces résultats suggèrent que la mésentérocine 52A peut suivre deux mécanismes distincts aboutissant à une bactériostase. Pour mieux comprendre les interactions entre la bactériocine et la cellule cible, le degré de pénétration de la mésentérocine 52A dans la membrane de trois souches de Leuconostoc, la première sensible, la seconde naturellement insensible et la dernière rendue résistante, a été caractérisé. Il semblerait que le phénotype de résistance soit corrélé avec les propriétés physico-chimiques de l’enveloppe cellulaire. Afin de pouvoir généraliser les résultats observés avec la mésentérocine 52A, d’autres bactériocines de la sous-classe IIa, les carnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2, produites par la souche Carnobacterium maltaromaticum CP5, ont été étudiées. Dans un premier temps, ces bactériocines ont été produites et purifiées à partir d’une souche d’Escherichia coli recombinante. L’étape de production en fermenteur a été optimisée, des quantités de l’ordre de 300 mg de peptides ont été produites. Le mode d’action des carnobactériocines, seules ou en combinaison, a été déterminé vis-à-vis de cellules procaryotes ou eucaryotes. Les carnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2 ont un mode d’action synergique contre les bactéries sensibles et ne présentent pas de cytotoxicité vis-à-vis des cellules de la lignée Caco-2 / The action site of sub-class IIa bacteriocins is the cytoplasmic membrane of Gram-positive bacteria. The current view of the mechanism of action is divided into three steps: (i) adsorption of bacteriocins on the membrane; (ii) apparition of the structures of peptide and integration into the lipid double layer (iii) formation of pores. The presence of pores leads to efflux of vital cell compounds. They cause growth stop or bacterial death. The degree of penetration of mesenterocin 52A into the membrane was measured by fluorescence anisotropy of two probes, TMA-DPH and the DPH, which target the surface or the depth of the membrane, respectively. Different results were obtained with two bacterial species of the genus Listeria. In the first hand, the peptide is partially inserted into the membrane and in the second hand in depth. These results suggest that mesenterocin 52A can exhibit two different mechanisms leading to the same antibacterial effect. To better understand the interactions between bacteriocins and the target cell, the degree of penetration of mesenterocin 52A into the membrane of three Leuconostoc strains, the first sensitive, the second naturally resistant and last induced resistant, was characterized. It seems that the resistance phenotype is correlated with physical and chemical properties of the cell envelope. To generalize the results observed with mesenterocin 52A, other bacteriocins of sub-class IIa, the carnobacteriocins Cbn BM1 and Cbn B2, produced by Carnobacterium maltaromaticum CP5 strain, were studied. These bacteriocins were produced in E. coli and subsequently purified. The optimization of the production process in a reactor led to purify up to 300 mg of peptides for 1.5 liter of culture. The mode of action of carnobacteriocins, alone or in combination, was determined with prokaryotic or eukaryotic cells as targets. The carnobacteriocins Cbn BM1 and Cbn B2 have a synergistic mode of action against sensitive bacteria and are not cytotoxic against Caco-2 cell line

Résumé confidentiel / Résumé confidentiel

La faisabilité d'un réacteur à enzyme malolactique pour effectuer et contrôler la fermentation malolactique (FML) des vins est étudiée. Des bactéries lactiques du vin, <i>Leuconostoc oenos</I> 84-06, sont cultivées en fermenteur de 10 litres, sur un milieu induisant la. fabrication de l'enzyme malolactique. La production d'enzyme est de 0,5 à 0,7 U/ml de milieu de culture, en 60 heures. L'enzyme malolactique est extraite par désintégration des bactéries aux ultrasons. Après action de la DNase 1 et précipitations au sulfate d'ammonium à 35% puis à 70%, l'extrait est filtré sur une colonne de chromatographie d'ultrogel AcA 34. L'enzyme obtenue a une activité spécifique de 8,9 U/mg ; elle a été purifiée à 3,3 fois avec un rendement de 75%. Sa masse moléculaire relative est d'environ 132 000, son point isoélectrique se situe à pH 4,35 et son pH optimum d'activité est de 5,5. Cette enzyme est utilisée pour fabriquer le réacteur (demande de brevet Français No 13131, déposée le 16 octobre 1990). Il s'agit d'un module d'ultrafiltration en fibres creuses de polyamide composé de deux circuits. Dans le circuit interne, le NAD est fixé et l'enzyme circule librement dans un milieu à pH 6 (milieu synthétique ou vin). Le milieu à traiter (milieu synthétique ou vin à pH 3) circule dans le circuit externe. Après passage dans le réacteur d'un milieu synthétique, le rendement de la FML est de 80% à 95% pendant 3 jours. Avec le vin, le rendement est de 50% à 60%. Nous avons montré que la FML des vins est maintenant techniquement réalisable avec un réacteur à enzyme malolactique et NAD. Il faut optimiser chaque étape de façon à pouvoir appliquer cette technique à la FML en continu pour de plus grandes quantités de vin.