Dentre as enfermidades que causam alterações hematológicas em bovinos podemos citar a leucose enzoótica bovina (LEB). Podendo em alguns animais, determinar formações tumorais por infiltração de células mononucleares (linfócitos, pró-linfócitos e linfócitos atípicos), em diferentes tecidos. A doença possui quadro sintomático pleomórfico e alterações hematológicas, evidenciadas por leucocitose e linfocitose persistente, com aumento de formas linfocitárias atípicas. Desta forma o presente estudo tem como objetivo avaliar a atipia linfocitária em bovinos da raça Holandesa Preto e Branco em animais soropositivos com ou sem a presença de linfocitose persistente e animais soronegativos para LEB e correlacioná-la com a apoptose de células CD5+ e a proliferação linfocitária. Assim, foram selecionados 56 animais, divididos de acordo com o leucograma e o sorodiagnóstico da LEB pela imunodifusão em ágar gel e pelo ensaio imunoenzimático em: negativos (n = 25), alinfocitóticos (AL, n= 12) e com linfocitose persistente (LP, n=19). Destes, 15 animais tiveram suas amostras sanguíneas avaliadas quanto a proliferação de linfócitos e apoptose. Os resultados deste estudo mostraram que, a contagem de leucócitos totais e os valores absolutos e relativos de linfócitos atípicos foram maiores no grupo LP. Em relação aos linfócitos atípicos, os linfócitos sombra de Gümprecht, linfócito monocitóide e linfócito com núcleo duplo, foram encontrados nos três grupos de estudo, porém mais comumente em animais infectados pelo VLEB, predominantemente no grupo manifestando linfocitose persistente. Este trabalho demonstrou uma menor proliferação de linfócitos nos animais infectados pelo VLEB manifestando LP, associado a uma menor apoptose de células CD5+. Na análise da correlação entre a apoptose de células CD5+ e a porcentagem das populações linfocitárias entre os 15 animais, observou-se que a apoptose tem uma correlação positiva com os linfócitos com núcleo duplo, o que não ocorreu nas demais populações celulares. Na correlação entre a proliferação, foi observado nos 15 animais, que quanto maior a porcentagem de linfócitos menor é a proliferação e quanto maior a porcentagem de linfócitos monocitóides menor a proliferação, o que não ocorreu nas demais populações celulares. Portanto, a manifestação da LP em animais naturalmente infectados pelo VLEB, pode ser associada ao aumento de linfócitos atípicos do tipo sombra de Gümprecht, linfócito monocitóide e linfócito núcleo duplo e da menor apoptose das células CD5 + e da menor proliferação de linfócitos / Among the diseases that cause hematological changes in cattle can cite the enzootic bovine leukemia (EBL). And in some animals, to determine tumor formations by infiltration of mononuclear cells (lymphocytes, pro-lymphocytes and atypical lymphocytes) in different tissues. The disease has symptoms very pleomorphic and hematological changes, evidenced by leukocytosis, and persistent lymphocytosis, an increase of atypical lymphocyte forms. Thus this study aims to evaluate the atypical lymphocyte in Holstein Black and White in seropositive animals with or without the presence of persistent lymphocytosis and animals seronegative LEB and correlate them with apoptosis of cells CD5 + and lymphocyte proliferation. Thus, we selected 56 animals, divided according to the WBC and serodiagnosis of LEB by agar gel immunodiffusion and by enzyme immunoassay in: negative (n = 25), non- lymphocytic (AL, n = 12) and with persistent lymphocytosis (PL, n = 19). Of these, 15 animals had their blood samples evaluated for lymphocyte proliferation and apoptosis. The results of this study showed that in total leukocytes and absolute and relative values of atypical lymphocytes were higher in group LP. Regarding atypical lymphocytes, lymphocytes Gumprecht shadow, lymphocyte and monocytoid lymphocytes with dual core, were found in the three study groups, but more commonly in animals infected VLEB, predominantly in the group with persistent lymphocytosis. This study demonstrated a reduced proliferation of lymphocytes in animals infected VLEB expressing LP, associated with lower apoptosis of CD5 + cells. In analyzing the correlation between apoptosis of cells and the percentage of CD5 + lymphocyte populations among the 15 animals, we observed that apoptosis has a positive correlation with lymphocytes with dual core, which did not occur in other cell populations. Correlation between proliferation, was observed in 15 animals, the higher the percentage of lymphocyte proliferation and lower the higher the percentage of monocytoid lymphocytes less proliferation, which did not occur in other cell populations. Therefore, the expression of LP in animals naturally infected VLEB may be associated with increased atypical lymphocytes of the type of shadow Gumprecht, lymphocyte and lymphocyte monocytoid dual-core and reduced apoptosis of CD5 + cells and reduced lymphocyte proliferation

Dentre as enfermidades que causam alterações hematológicas em bovinos podemos citar a leucose enzoótica bovina (LEB). Podendo em alguns animais, determinar formações tumorais por infiltração de células mononucleares (linfócitos, pró-linfócitos e linfócitos atípicos), em diferentes tecidos. A doença possui quadro sintomático pleomórfico e alterações hematológicas, evidenciadas por leucocitose e linfocitose persistente, com aumento de formas linfocitárias atípicas. Desta forma o presente estudo tem como objetivo avaliar a atipia linfocitária em bovinos da raça Holandesa Preto e Branco em animais soropositivos com ou sem a presença de linfocitose persistente e animais soronegativos para LEB e correlacioná-la com a apoptose de células CD5+ e a proliferação linfocitária. Assim, foram selecionados 56 animais, divididos de acordo com o leucograma e o sorodiagnóstico da LEB pela imunodifusão em ágar gel e pelo ensaio imunoenzimático em: negativos (n = 25), alinfocitóticos (AL, n= 12) e com linfocitose persistente (LP, n=19). Destes, 15 animais tiveram suas amostras sanguíneas avaliadas quanto a proliferação de linfócitos e apoptose. Os resultados deste estudo mostraram que, a contagem de leucócitos totais e os valores absolutos e relativos de linfócitos atípicos foram maiores no grupo LP. Em relação aos linfócitos atípicos, os linfócitos sombra de Gümprecht, linfócito monocitóide e linfócito com núcleo duplo, foram encontrados nos três grupos de estudo, porém mais comumente em animais infectados pelo VLEB, predominantemente no grupo manifestando linfocitose persistente. Este trabalho demonstrou uma menor proliferação de linfócitos nos animais infectados pelo VLEB manifestando LP, associado a uma menor apoptose de células CD5+. Na análise da correlação entre a apoptose de células CD5+ e a porcentagem das populações linfocitárias entre os 15 animais, observou-se que a apoptose tem uma correlação positiva com os linfócitos com núcleo duplo, o que não ocorreu nas demais populações celulares. Na correlação entre a proliferação, foi observado nos 15 animais, que quanto maior a porcentagem de linfócitos menor é a proliferação e quanto maior a porcentagem de linfócitos monocitóides menor a proliferação, o que não ocorreu nas demais populações celulares. Portanto, a manifestação da LP em animais naturalmente infectados pelo VLEB, pode ser associada ao aumento de linfócitos atípicos do tipo sombra de Gümprecht, linfócito monocitóide e linfócito núcleo duplo e da menor apoptose das células CD5 + e da menor proliferação de linfócitos / Among the diseases that cause hematological changes in cattle can cite the enzootic bovine leukemia (EBL). And in some animals, to determine tumor formations by infiltration of mononuclear cells (lymphocytes, pro-lymphocytes and atypical lymphocytes) in different tissues. The disease has symptoms very pleomorphic and hematological changes, evidenced by leukocytosis, and persistent lymphocytosis, an increase of atypical lymphocyte forms. Thus this study aims to evaluate the atypical lymphocyte in Holstein Black and White in seropositive animals with or without the presence of persistent lymphocytosis and animals seronegative LEB and correlate them with apoptosis of cells CD5 + and lymphocyte proliferation. Thus, we selected 56 animals, divided according to the WBC and serodiagnosis of LEB by agar gel immunodiffusion and by enzyme immunoassay in: negative (n = 25), non- lymphocytic (AL, n = 12) and with persistent lymphocytosis (PL, n = 19). Of these, 15 animals had their blood samples evaluated for lymphocyte proliferation and apoptosis. The results of this study showed that in total leukocytes and absolute and relative values of atypical lymphocytes were higher in group LP. Regarding atypical lymphocytes, lymphocytes Gumprecht shadow, lymphocyte and monocytoid lymphocytes with dual core, were found in the three study groups, but more commonly in animals infected VLEB, predominantly in the group with persistent lymphocytosis. This study demonstrated a reduced proliferation of lymphocytes in animals infected VLEB expressing LP, associated with lower apoptosis of CD5 + cells. In analyzing the correlation between apoptosis of cells and the percentage of CD5 + lymphocyte populations among the 15 animals, we observed that apoptosis has a positive correlation with lymphocytes with dual core, which did not occur in other cell populations. Correlation between proliferation, was observed in 15 animals, the higher the percentage of lymphocyte proliferation and lower the higher the percentage of monocytoid lymphocytes less proliferation, which did not occur in other cell populations. Therefore, the expression of LP in animals naturally infected VLEB may be associated with increased atypical lymphocytes of the type of shadow Gumprecht, lymphocyte and lymphocyte monocytoid dual-core and reduced apoptosis of CD5 + cells and reduced lymphocyte proliferation

Diferentes populações de leucócitos desempenham papeis fundamentais na eliminação de agentes invasores através da sua fagocitose e destruição, utilizando-se de mecanismos dependentes (metabolismo oxidativo) e independentes de oxigênio. Baseando-se na hipótese de que o vírus da Leucose Enzoótica Bovina, uma enfermidade crônica, que afeta, particularmente, os órgãos ricos em tecido linfóide destes animais, altera quantitativa e qualitativamente as subpopulações de leucócitos circulantes dos bovinos, influenciando na qualidade da resposta imunológica inata destes animais, o presente estudo avaliou a produção intracelular de peróxido de hidrogênio (H2O2) por leucócitos circulantes, frente estímulo in vitro com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), lipopolissacarídeos de Escherichia coil (LPS) e após fagocitose de Staphylococcus aureus conjugados com iodeto de propídio (Sa-PI). Para tal, células foram obtidas de cinco vacas negativas no diagnóstico para LEB, de cinco vacas naturalmente infectadas pelo vírus da leucose bovina (VLB), alinfocitóticas, e de cinco vacas infectadas, manifestando linfocitose persistente (LP), e analisadas por citometria de fluxo. Foi averiguada a normalidade da distribuição dos resultados, utilizando-se do teste de Anderson-Darling, e sua homoscedasticidade, utilizando-se do teste F ou do teste de Lavene. Para a análise das freqüências observadas, foi utilizado o teste Qui-quadrado. Para a avaliação das diferenças entre as médias dos resultados obtidos, foram feitos os testes de análise de variância (One-way ANOVA), de Tukey-Kramer, teste t de Student, de Mann-Whitney ou de Kruskal-Wallis. A porcentagem média total de células produzindo H2O2, caracterizada pela intensidade de fluorescência da 2,7-diclorofluoresceína, no ensaio sem estímulo in vitro, de 30,60%, foi menor (p=0,005) que aquela observada no ensaio com adição in vitro de LPS, de 52,00%, e que aquela obtida no ensaio com adição in vitro de PMA, de 63,13%. A porcentagem média total de células produzindo H2O2 no ensaio com estímulo por fagocitose in vitro de SaPI, de 47,47%, não diferiu da observada no ensaio sem estímulo. As porcentagens médias totais de células produzindo H2O2 não diferiram entre os ensaios em que houve prévio estímulo in vitro. Não houve diferença na porcentagem de leucócitos que estavam produzindo H2O2, entre os grupos experimentais, todavia, a produção intracelular média de H2O2, sem estímulo in vitro (p=0,007), após adição in vitro de PMA (p<0,001), de LPS (p=0,001) ou após fagocitose (p=0,002), de leucócitos obtidos de animais apresentando LP, foi menor que aquela verificada em células provenientes de animais soronegativos e de animais soropositivos alinfocitóticos. A porcentagem de leucócitos realizando fagocitose, caracterizada pela intensidade de fluorescência do iodeto de propídio, entre as células obtidas de animais com LP, de 7,20%, foi menor que aquela verificada nas amostras coletadas de animais soronegativos, de 12,90%, e soropositivos alinfocitóticos, de 14,70% (p=0,047). Além disso, as células provenientes de animais com LP apresentaram uma menor intensidade de fagocitose que aquela observada em leucócitos de animais soronegativos e soropositivos alinfocitóticos (p<0,001). Assim, os resultados obtidos demonstram uma vulnerabilidade funcional em leucócitos sangüíneos obtidos de animais infectados pelo VLB, manifestando LP. / Different leukocyte populations play key roles on the elimination of foreign antigens through phagocytosis and killing by oxygen-independent and -dependent (respiratory burst) mechanisms. Assuming that Enzootic Bovine Leukosis virus (BLV), that causes a chronic disease, and affects, mainly, lymphoid tissues, alters bovine circulating leukocyte subpopulations quantitatively and qualitatively, and influences the innate immune response, this study evaluated the intracellular production of hydrogen peroxide (H2O2) of circulating leukocytes after in vitro stimuli with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), Escherichia coli lipopolysaccharides (LPS), or phagocytosis of propidium iodide-labeled Staphylococcus aureus (PI-Sa). Cells were obtained from five BLV-negative cows, five naturally BLV-infected, non-lymphocytotic cows, and five BLV-positive cows with persistent lymphocytosis (PL), and analyzed by flow cytometry. Normality was tested using the Anderson-Darling test, followed by an F test or a Lavene\'s test to analyze the equality of variances. Differences among frequencies were tested using the Qui-square test. Differences among means were verified by a one way analysis of variance (ANOVA), followed by a Turkey-Kramer test, or a Student t-test, a Mann-Whitney U-test, or a Kruskal-Wallis test. Mean total percentage of H2O2-producing cells, characterized by the intensity of 2,7-dichlorofluorescein fluorescence, in the assay without in vitro stimulus (30.60%) was smaller (p=0.005) than that verified in the assay after in vitro addition of LPS (52.00%), and after addition of PMA (63.13%). Mean total percentage of H2O2-producing cells in the assay with stimulus by in vitro phagocytosis of PI-Sa (47.47%) was not different from that verified in the assay without in vitro stimulus. Mean total percentages of H2O2-producing leukocytes did not differ among assays with previous in vitro stimuli. There was no difference in the percentages of H2O2-producing leukocytes, among cells obtained from cows that belonged to different groups. However, mean intracellular H2O2-production of leukocytes obtained from BLV-infected cows, presenting PL, without in vitro stimulus (p=0.007), after in vitro addition of PMA (p<0.001), or LPS (p=0.001), or after phagocytosis (p=0.002) was smaller than that verified in leukocytes obtained from non-infected and from BLV-infected, non-lymphocytotic, cows. The percentage of leukocytes that were carrying out phagocytosis, characterized by the intensity of propidium iodide fluorescence, among cells obtained from BLV-infected cows, presenting PL (7.20%), was smaller (p=0.047) than that verified among cells obtained from non-infected and from BLV-infected (12.90%), non-lymphocytotic (14.70%), cows. Furthermore, leukocytes obtained from BLV-infected cows, presenting PL, showed smaller phagocytosis intensity (p<0.001) than leukocytes obtained from non-infected and from BLV-infected, non-lymphocytotic, cows. Therefore, results show a functional vulnerability of circulating leukocytes obtained from BLV-infected, lymphocytotic cows.

Foi demonstrado o envolvimento das espécies reativas de oxigênio (ERO) na patogênese de algumas retroviroses, levando muitas vezes à progressão e/ou persistência das mesmas. No entanto, o papel das espécies reativas de oxigênio resultante da modulação do sistema antioxidante, e seu envolvimento na infecção de bovinos naturalmente infectados pelo VLEB, até o presente trabalho, não tinha sido ainda investigado. Desta forma, o presente estudo objetivou-se avaliar o envolvimento do estresse oxidativo na infecção pelo VLEB em bovinos naturalmente infectados, associado ou não ao estabelecimento da linfocitose persistente (LP). Assim, a avaliação do estresse oxidativo se deu pelo teor de malondialdeído, concentração de glutationa reduzida, atividade da glutationa peroxidase e da superóxido dismutase, e pela atividade antioxidante total; e a resposta imune pela quantificação das subpopulações de linfócitos, função fagocítica e produção intracelular de peróxido de hidrogênio de leuccitos polimorfonucleares, morte celular e proliferação linfocitária, além da avaliação hematológica e sorodiagnóstico da leucose enzoótica bovina (LEB). Os resultados do presente estudo apontaram para o envolvimento do estresse oxidativo na infecção pelo vírus da leucose enzoótica bovina, dado pela menor concentração de glutationa peroxidase e a tendência a menor atividade da superxido dismutase eritrocitárias nos animais infectados pelo VLEB, não podendo, contudo, ser associado à fase da infecção. Ademais, os marcadores de estresse oxidativo não apresentaram alterados nem sequer a atividade antioxidante total destes animais. Além disso, o presente trabalho apontou para menor proliferação de linfócitos e redução da apoptose de células CD5+ nos animais infectados pelo VLEB manifestando LP, corroborados pelo significante aumento da população de linfcitos B (CD21+), e dos principais co-marcadores das células infectadas, no caso células CD5+ e CD11b+, nestes animais. No entanto, não observou diferenças significativas na população de linfócitos T destes animais, nem sequer alteração da capacidade fagocítica e produção intracelular de peróxido de hidrogênio pela população de leucócitos polimorfonucleares nos animais infectados. / Abundant observations of multiple pathogenic interactions between reactive oxygen species (ROS) and the pathogenesis of some retroviruses have drawn attention to role of ROS on disease progression and/or persistence of infection. Therefore, the role of the oxidative stress resulted from the modulation of the antioxidant system in dairy cows naturally infected with BLV has not been studied yet. So, the present study tries to investigate the involvement of oxidative stress in dairy cows naturally infected with BLV associated or not with the persistent lymphocytosis (PL). Thus, the oxidative stress was evaluated by the malondialdehyde, reduced glutathione content, and by the activity of glutathione peroxidase and superoxide dismutase, and also total antioxidant activity. The immune response was also evaluated by the quantification of lymphocyte subsets, lymphocyte proliferation, polymorfonuclear leukocytes phagocytosis and intracellular hydrogen peroxide production, and cell death. The results of the present work point out to an involvement of oxidative stress in dairy cows naturally infected with BLV, given by a lower glutathione peroxidase activity and also a tendency towards lower superoxide dismutase activity, but it can be not associated with PL. Futhermore, the oxidative stress markers and also the total antioxidant status was not altered in infected animals. The present study also showed a lower lymphocyte proliferarion and apoptosis rates of CD5+ cells, strengthen by a higher B cells (CD21+) counts and also by a significant augment of CD5+ and CD11b+ positive cells that are often co-expressed by the infected cells. Although, no significant difference was observed in T cells counts. Moreover, the phagocytosis rates and the intracellular hydrogen peroxide production by the polymorphonuclear leukocytes are not altered in BLV infected dairy cows.

A Leucose Enzoótica dos Bovinos (LEB) é uma enfermidade neoplásica, infectocontagiosa, pluri-sintomática, de evolução crônica, que compromete os órgãos linfopoiéticos e está associada ao desenvolvimento de linfocitose persistente (LP) e linfossarcoma. Acarreta diminuição na produção, quer por seus efeitos danosos diretos, quer pelos indiretos. No entanto, seu efeito na função e na quantidade das diferentes subpopulações de linfócitos, assim como seu papel no estabelecimento de outras doenças oportunistas, ainda não está claro. O presente estudo avaliou a resposta imunitária de bovinos da raça Holandês Preto e Branco naturalmente infectados pelo vírus da LEB (VLB), após desafio antigênico fornecido por vacinação contra o vírus da febre aftosa. Para tal, foram coletadas amostras sanguíneas antes do desafio e, após o desafio, semanalmente, por sete semanas, de dez vacas soropositivas, sem LP; de dez vacas soropositivas, manifestando LP; e de dez vacas soronegativas. Foram avaliadas as alterações quantitativas das diferentes subpopulações de leucócitos circulantes; a função dos linfócitos B, por meio da quantificação de diferentes isotipos de imunoglobulinas (Ig) séricas; os índices de proliferação linfocitária; os índices de morte celular por apoptose ou por necrose; e as concentrações séricas de interleucina-10 (IL-10), IL-12, inteferon- (IFN-&gamma;) e fator de necrose tumoral-&alpha; (TNF-&alpha;). Foi verificada a normalidade da distribuição dos resultados obtidos, utilizando-se do teste de Anderson-Darling, e sua homoscedasticidade, utilizando-se do teste F (para dados que apresentaram distribuição normal) ou do teste de Lavene (para dados que não apresentaram distribuição normal). Para a avaliação das diferenças entre as médias dos resultados obtidos, de acordo, respectivamente, com a ocorrência ou não de homoscedasticidade, foram feitos, para dados com distribuição normal, os testes de análise de variância (One-way ANOVA), seguida do teste de Tukey-Kramer ou o teste t; e, para dados que não apresentaram distribuição normal, o teste de Mann-Whitney ou o teste de Kruskal-Wallis. Para todos os resultados, foram consideradas significantes as análises que apresentaram p&le;0,05. Verificou-se que não houve diferença nas concentrações séricas de IgG1, de IgM e de IgA, tanto entre os tempos de coleta, quanto, a cada tempo, entre animais pertencentes aos diferentes grupos. As concentrações séricas de IgG2 aumentaram, após a vacinação, em todos os animais (p<0,05). Todavia, 17 dias após o desafio antigênico, as concentrações séricas de IgG2, em animais manifestando LP foram, a cada tempo de coleta, menores (p<0,01) que aquelas verificadas nos animais pertencentes aos demais grupos, indicando que animais com LP apresentam resposta humoral menos intensa e menos duradoura. Observou-se que ocorreu um aumento no índice de proliferação de linfócitos sanguíneos (p<0,01), 24 dias após a vacinação contra o vírus da febre aftosa, independente da presença de infecção pelo VLB. A partir deste momento, ocorre um aumento na porcentagem de linfócitos &gamma;&sigma; circulantes (p<0,05) e posterior diminuição nas concentrações séricas de IgG2 (p<0,05), indicando regulação desta resposta humoral por linfócitos &gamma;&sigma;. Em bovinos com LP, o aumento na porcentagem de linfócitos circulantes foi maior (p<0,05), ocasionando diminuição mais intensa e mais precoce nas concentrações séricas de IgG2. Constatou-se que a LP ocorre em decorrência de menor índice de apoptose, posto que as porcentagens de leucócitos sofrendo processo de apoptose foram menores (p&le;0,001) entre as células obtidas de animais manifestando LP, do naquelas coletadas dos animais pertencentes aos demais grupos. Verificou-se que as concentrações séricas das citocinas de perfil Th1, IL-12 e IFN-&gamma;, são maiores em amostras sangüíneas de animais infectados pelo VLB, alinfocitóticos (p<0,01), ao passo que as concentrações séricas das citocinas de perfil Th2, IL-10 e TNF-&alpha;, são maiores em amostras sangüíneas de animais infectados manifestando LP (p<0,01), indicando que alterações no perfil sérico de citocinas podem ser causa ou consequência da LP. Em resposta ao desafio vacinal, ocorre uma elevação nas concentrações séricas de IL-10 (p<0,01), de TNF-&alpha; (p=0,005) e de IFN-&gamma; (p<0,01), três dias após o desafio, e de IL-12 (p<0,001), dez dias após o desafio. A elevação na concentração sérica de IL-10 perdura até 31 dias após o desafio e pode ser responsável pelo maior índice de proliferação de linfócitos &gamma;&sigma; verificado a partir de 31 dias após a vacinação. Foi observado que a maioria dos linfócitos B circulantes, em bovinos, consiste de linfócitos B1 e, em animais infectados pelo VLB, a LP ocorre em decorrência de um aumento na porcentagem de linfócitos B1a (p<0,05). Além disso, em animais infectados pelo VLB, apresentando LP, as relações entre linfócitos T auxiliares e citotóxicos são menores (p<0,01) e a porcentagem de linfócitos &gamma;&sigma; é maior (p<0,01), indicando atividade viral nas células infectadas. Assim, os resultados permitem-nos concluir que animais infectados pelo VLB, manifestando LP, apresentam alterações na resposta imunitária frente vacinação contra o vírus da febre aftosa. / Enzootic Bovine Leukosis (EBL) is an infectious, multi-symptomatic, chronic, neoplastic disease, which undermines the lymphopoietic organs and is associated with the development of persistent lymphocytosis (PL) and lymphosarcoma. Infected animals present a decrease of production, either by its direct or its indirect harmful effects. However, its effect on the function and quantity of different lymphocyte subpopulations, as well as its role in the establishment of other opportunistic diseases, are unclear. This study evaluated the immune response of Holstein dairy cattle naturally infected with Bovine Leukosis Virus BLV, after antigen challenge provided by vaccination against foot and mouth disease (FMD) virus. To this end, blood samples were collected before challenge and after challenge, weekly, for seven weeks, from ten seropositive cows without PL, from ten seropositive cows expressing PL, and from ten seronegative cows. We evaluated the quantitative changes of different subpopulations of leukocytes; the function of B lymphocytes, through the quantification of different isotypes of immunoglobulins (Ig) serum concentration; the rate of lymphocyte proliferation; the rate of cell death by apoptosis or necrosis; and the serum concentrations of interleukin-10 (IL-10), IL-12, inteferon-&gamma; (IFN-&gamma;), and tumor necrosis factor-&alpha; (TNF-&alpha;). It was verified the normality of distribution of the results using the Anderson-Darling test, and their homoscedasticity, using the F test (for data with normal distribution) or the Levene test (for data without normal distribution). For the evaluation of differences between the average results, according respectively to the presence or absence of homoscedasticity, we used, for data with normal distribution, One-way ANOVA test, followed by the Tukey-Kramer test or the t test, and, for data without normal distribution, the Mann-Whitney test or the Kruskal-Wallis test. Results with p&le;0.05 were considered statistically significant. There were no differences related to serum IgG1, IgM, and IgA concentrations, both among sampling time and, every time, among animals belonging to different groups. IgG2 serum concentrations increased after vaccination in all animals (p<0.05). However, in animals expressing PL, each collection time, 17 days after antigen challenge, IgG2 serum concentration was lower (p<0.01) than those observed in animals belonging to other groups, indicating that animals with PL present less intense and less enduring humoral response. It was observed that there was an increase in the rate of lymphocyte proliferation (p<0.01) 24 days after vaccination against FMD virus, irrespective of the presence of infection by BLV. From this moment, there was an increase in the percentage of &gamma;&sigma;-lymphocytes (p<0.05) and a subsequent decrease in serum IgG2 (p<0.05), indicating regulation of this humoral response by &gamma;&sigma;-lymphocytes. In cattle with PL, the increase in the percentage of &gamma;&sigma;-lymphocytes was higher (p<0.05), leading to more intense and earlier decrease in IgG2 serum concentration. It was found that PL is due to a lower rate of apoptosis, since the percentage of leukocytes undergoing apoptosis was lower (p&le;0.001) among cells obtained from animals expressing PL, when compared to those collected from animals from the other groups. It was found that serum concentrations of Th1 cytokines, specifically IL-12 and IFN-&gamma;, were higher in blood samples from nonlymphocytotic infected animals (p<0.01), whereas serum concentrations of Th2 cytokines, particularly IL-10 and TNF-&alpha;, were higher in blood samples from infected animals expressing LP (p<0.01), indicating that changes in serum cytokines profile may be a cause or a consequence of PL. IL-10 (p<0.01), TNF-&alpha; (p=0.005), and IFN-&gamma; (p<0.01) serum concentrations increased three days after the challenge, and IL-12 serum concentration increased (p<0.001), ten days after the challenge. The increase in IL-10 serum concentration lasts until 31 days after the challenge and may account for the higher rate of &gamma;&sigma;-lymphocyte proliferation found from 31 days after vaccination. It was observed that the majority of circulating B lymphocytes in cattle consists of B1 lymphocytes and that, in BLV-infected animals, PL occurs due to an increase in the percentage of B1a lymphocytes (p<0.05). Moreover, in lymphocytotic BLV-infected animals, the rate between helper and cytotoxic Tlymphocytes are smaller (p<0.01) and the percentage of &gamma;&sigma;-lymphocytes is greater (p<0.01), indicating viral activity in infected cells. Thus, results allow us to conclude that lymphocytotic BLV-infected animals show changes in the immune response after vaccination against FMD virus.

A Leucose Enzoótica dos Bovinos (LEB) é uma enfermidade neoplásica, infectocontagiosa, pluri-sintomática, de evolução crônica, que compromete os órgãos linfopoiéticos e está associada ao desenvolvimento de linfocitose persistente (LP) e linfossarcoma. Acarreta diminuição na produção, quer por seus efeitos danosos diretos, quer pelos indiretos. No entanto, seu efeito na função e na quantidade das diferentes subpopulações de linfócitos, assim como seu papel no estabelecimento de outras doenças oportunistas, ainda não está claro. O presente estudo avaliou a resposta imunitária de bovinos da raça Holandês Preto e Branco naturalmente infectados pelo vírus da LEB (VLB), após desafio antigênico fornecido por vacinação contra o vírus da febre aftosa. Para tal, foram coletadas amostras sanguíneas antes do desafio e, após o desafio, semanalmente, por sete semanas, de dez vacas soropositivas, sem LP; de dez vacas soropositivas, manifestando LP; e de dez vacas soronegativas. Foram avaliadas as alterações quantitativas das diferentes subpopulações de leucócitos circulantes; a função dos linfócitos B, por meio da quantificação de diferentes isotipos de imunoglobulinas (Ig) séricas; os índices de proliferação linfocitária; os índices de morte celular por apoptose ou por necrose; e as concentrações séricas de interleucina-10 (IL-10), IL-12, inteferon- (IFN-&gamma;) e fator de necrose tumoral-&alpha; (TNF-&alpha;). Foi verificada a normalidade da distribuição dos resultados obtidos, utilizando-se do teste de Anderson-Darling, e sua homoscedasticidade, utilizando-se do teste F (para dados que apresentaram distribuição normal) ou do teste de Lavene (para dados que não apresentaram distribuição normal). Para a avaliação das diferenças entre as médias dos resultados obtidos, de acordo, respectivamente, com a ocorrência ou não de homoscedasticidade, foram feitos, para dados com distribuição normal, os testes de análise de variância (One-way ANOVA), seguida do teste de Tukey-Kramer ou o teste t; e, para dados que não apresentaram distribuição normal, o teste de Mann-Whitney ou o teste de Kruskal-Wallis. Para todos os resultados, foram consideradas significantes as análises que apresentaram p&le;0,05. Verificou-se que não houve diferença nas concentrações séricas de IgG1, de IgM e de IgA, tanto entre os tempos de coleta, quanto, a cada tempo, entre animais pertencentes aos diferentes grupos. As concentrações séricas de IgG2 aumentaram, após a vacinação, em todos os animais (p<0,05). Todavia, 17 dias após o desafio antigênico, as concentrações séricas de IgG2, em animais manifestando LP foram, a cada tempo de coleta, menores (p<0,01) que aquelas verificadas nos animais pertencentes aos demais grupos, indicando que animais com LP apresentam resposta humoral menos intensa e menos duradoura. Observou-se que ocorreu um aumento no índice de proliferação de linfócitos sanguíneos (p<0,01), 24 dias após a vacinação contra o vírus da febre aftosa, independente da presença de infecção pelo VLB. A partir deste momento, ocorre um aumento na porcentagem de linfócitos &gamma;&sigma; circulantes (p<0,05) e posterior diminuição nas concentrações séricas de IgG2 (p<0,05), indicando regulação desta resposta humoral por linfócitos &gamma;&sigma;. Em bovinos com LP, o aumento na porcentagem de linfócitos circulantes foi maior (p<0,05), ocasionando diminuição mais intensa e mais precoce nas concentrações séricas de IgG2. Constatou-se que a LP ocorre em decorrência de menor índice de apoptose, posto que as porcentagens de leucócitos sofrendo processo de apoptose foram menores (p&le;0,001) entre as células obtidas de animais manifestando LP, do naquelas coletadas dos animais pertencentes aos demais grupos. Verificou-se que as concentrações séricas das citocinas de perfil Th1, IL-12 e IFN-&gamma;, são maiores em amostras sangüíneas de animais infectados pelo VLB, alinfocitóticos (p<0,01), ao passo que as concentrações séricas das citocinas de perfil Th2, IL-10 e TNF-&alpha;, são maiores em amostras sangüíneas de animais infectados manifestando LP (p<0,01), indicando que alterações no perfil sérico de citocinas podem ser causa ou consequência da LP. Em resposta ao desafio vacinal, ocorre uma elevação nas concentrações séricas de IL-10 (p<0,01), de TNF-&alpha; (p=0,005) e de IFN-&gamma; (p<0,01), três dias após o desafio, e de IL-12 (p<0,001), dez dias após o desafio. A elevação na concentração sérica de IL-10 perdura até 31 dias após o desafio e pode ser responsável pelo maior índice de proliferação de linfócitos &gamma;&sigma; verificado a partir de 31 dias após a vacinação. Foi observado que a maioria dos linfócitos B circulantes, em bovinos, consiste de linfócitos B1 e, em animais infectados pelo VLB, a LP ocorre em decorrência de um aumento na porcentagem de linfócitos B1a (p<0,05). Além disso, em animais infectados pelo VLB, apresentando LP, as relações entre linfócitos T auxiliares e citotóxicos são menores (p<0,01) e a porcentagem de linfócitos &gamma;&sigma; é maior (p<0,01), indicando atividade viral nas células infectadas. Assim, os resultados permitem-nos concluir que animais infectados pelo VLB, manifestando LP, apresentam alterações na resposta imunitária frente vacinação contra o vírus da febre aftosa. / Enzootic Bovine Leukosis (EBL) is an infectious, multi-symptomatic, chronic, neoplastic disease, which undermines the lymphopoietic organs and is associated with the development of persistent lymphocytosis (PL) and lymphosarcoma. Infected animals present a decrease of production, either by its direct or its indirect harmful effects. However, its effect on the function and quantity of different lymphocyte subpopulations, as well as its role in the establishment of other opportunistic diseases, are unclear. This study evaluated the immune response of Holstein dairy cattle naturally infected with Bovine Leukosis Virus BLV, after antigen challenge provided by vaccination against foot and mouth disease (FMD) virus. To this end, blood samples were collected before challenge and after challenge, weekly, for seven weeks, from ten seropositive cows without PL, from ten seropositive cows expressing PL, and from ten seronegative cows. We evaluated the quantitative changes of different subpopulations of leukocytes; the function of B lymphocytes, through the quantification of different isotypes of immunoglobulins (Ig) serum concentration; the rate of lymphocyte proliferation; the rate of cell death by apoptosis or necrosis; and the serum concentrations of interleukin-10 (IL-10), IL-12, inteferon-&gamma; (IFN-&gamma;), and tumor necrosis factor-&alpha; (TNF-&alpha;). It was verified the normality of distribution of the results using the Anderson-Darling test, and their homoscedasticity, using the F test (for data with normal distribution) or the Levene test (for data without normal distribution). For the evaluation of differences between the average results, according respectively to the presence or absence of homoscedasticity, we used, for data with normal distribution, One-way ANOVA test, followed by the Tukey-Kramer test or the t test, and, for data without normal distribution, the Mann-Whitney test or the Kruskal-Wallis test. Results with p&le;0.05 were considered statistically significant. There were no differences related to serum IgG1, IgM, and IgA concentrations, both among sampling time and, every time, among animals belonging to different groups. IgG2 serum concentrations increased after vaccination in all animals (p<0.05). However, in animals expressing PL, each collection time, 17 days after antigen challenge, IgG2 serum concentration was lower (p<0.01) than those observed in animals belonging to other groups, indicating that animals with PL present less intense and less enduring humoral response. It was observed that there was an increase in the rate of lymphocyte proliferation (p<0.01) 24 days after vaccination against FMD virus, irrespective of the presence of infection by BLV. From this moment, there was an increase in the percentage of &gamma;&sigma;-lymphocytes (p<0.05) and a subsequent decrease in serum IgG2 (p<0.05), indicating regulation of this humoral response by &gamma;&sigma;-lymphocytes. In cattle with PL, the increase in the percentage of &gamma;&sigma;-lymphocytes was higher (p<0.05), leading to more intense and earlier decrease in IgG2 serum concentration. It was found that PL is due to a lower rate of apoptosis, since the percentage of leukocytes undergoing apoptosis was lower (p&le;0.001) among cells obtained from animals expressing PL, when compared to those collected from animals from the other groups. It was found that serum concentrations of Th1 cytokines, specifically IL-12 and IFN-&gamma;, were higher in blood samples from nonlymphocytotic infected animals (p<0.01), whereas serum concentrations of Th2 cytokines, particularly IL-10 and TNF-&alpha;, were higher in blood samples from infected animals expressing LP (p<0.01), indicating that changes in serum cytokines profile may be a cause or a consequence of PL. IL-10 (p<0.01), TNF-&alpha; (p=0.005), and IFN-&gamma; (p<0.01) serum concentrations increased three days after the challenge, and IL-12 serum concentration increased (p<0.001), ten days after the challenge. The increase in IL-10 serum concentration lasts until 31 days after the challenge and may account for the higher rate of &gamma;&sigma;-lymphocyte proliferation found from 31 days after vaccination. It was observed that the majority of circulating B lymphocytes in cattle consists of B1 lymphocytes and that, in BLV-infected animals, PL occurs due to an increase in the percentage of B1a lymphocytes (p<0.05). Moreover, in lymphocytotic BLV-infected animals, the rate between helper and cytotoxic Tlymphocytes are smaller (p<0.01) and the percentage of &gamma;&sigma;-lymphocytes is greater (p<0.01), indicating viral activity in infected cells. Thus, results allow us to conclude that lymphocytotic BLV-infected animals show changes in the immune response after vaccination against FMD virus.

Diferentes populações de leucócitos desempenham papeis fundamentais na eliminação de agentes invasores através da sua fagocitose e destruição, utilizando-se de mecanismos dependentes (metabolismo oxidativo) e independentes de oxigênio. Baseando-se na hipótese de que o vírus da Leucose Enzoótica Bovina, uma enfermidade crônica, que afeta, particularmente, os órgãos ricos em tecido linfóide destes animais, altera quantitativa e qualitativamente as subpopulações de leucócitos circulantes dos bovinos, influenciando na qualidade da resposta imunológica inata destes animais, o presente estudo avaliou a produção intracelular de peróxido de hidrogênio (H2O2) por leucócitos circulantes, frente estímulo in vitro com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), lipopolissacarídeos de Escherichia coil (LPS) e após fagocitose de Staphylococcus aureus conjugados com iodeto de propídio (Sa-PI). Para tal, células foram obtidas de cinco vacas negativas no diagnóstico para LEB, de cinco vacas naturalmente infectadas pelo vírus da leucose bovina (VLB), alinfocitóticas, e de cinco vacas infectadas, manifestando linfocitose persistente (LP), e analisadas por citometria de fluxo. Foi averiguada a normalidade da distribuição dos resultados, utilizando-se do teste de Anderson-Darling, e sua homoscedasticidade, utilizando-se do teste F ou do teste de Lavene. Para a análise das freqüências observadas, foi utilizado o teste Qui-quadrado. Para a avaliação das diferenças entre as médias dos resultados obtidos, foram feitos os testes de análise de variância (One-way ANOVA), de Tukey-Kramer, teste t de Student, de Mann-Whitney ou de Kruskal-Wallis. A porcentagem média total de células produzindo H2O2, caracterizada pela intensidade de fluorescência da 2,7-diclorofluoresceína, no ensaio sem estímulo in vitro, de 30,60%, foi menor (p=0,005) que aquela observada no ensaio com adição in vitro de LPS, de 52,00%, e que aquela obtida no ensaio com adição in vitro de PMA, de 63,13%. A porcentagem média total de células produzindo H2O2 no ensaio com estímulo por fagocitose in vitro de SaPI, de 47,47%, não diferiu da observada no ensaio sem estímulo. As porcentagens médias totais de células produzindo H2O2 não diferiram entre os ensaios em que houve prévio estímulo in vitro. Não houve diferença na porcentagem de leucócitos que estavam produzindo H2O2, entre os grupos experimentais, todavia, a produção intracelular média de H2O2, sem estímulo in vitro (p=0,007), após adição in vitro de PMA (p<0,001), de LPS (p=0,001) ou após fagocitose (p=0,002), de leucócitos obtidos de animais apresentando LP, foi menor que aquela verificada em células provenientes de animais soronegativos e de animais soropositivos alinfocitóticos. A porcentagem de leucócitos realizando fagocitose, caracterizada pela intensidade de fluorescência do iodeto de propídio, entre as células obtidas de animais com LP, de 7,20%, foi menor que aquela verificada nas amostras coletadas de animais soronegativos, de 12,90%, e soropositivos alinfocitóticos, de 14,70% (p=0,047). Além disso, as células provenientes de animais com LP apresentaram uma menor intensidade de fagocitose que aquela observada em leucócitos de animais soronegativos e soropositivos alinfocitóticos (p<0,001). Assim, os resultados obtidos demonstram uma vulnerabilidade funcional em leucócitos sangüíneos obtidos de animais infectados pelo VLB, manifestando LP. / Different leukocyte populations play key roles on the elimination of foreign antigens through phagocytosis and killing by oxygen-independent and -dependent (respiratory burst) mechanisms. Assuming that Enzootic Bovine Leukosis virus (BLV), that causes a chronic disease, and affects, mainly, lymphoid tissues, alters bovine circulating leukocyte subpopulations quantitatively and qualitatively, and influences the innate immune response, this study evaluated the intracellular production of hydrogen peroxide (H2O2) of circulating leukocytes after in vitro stimuli with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), Escherichia coli lipopolysaccharides (LPS), or phagocytosis of propidium iodide-labeled Staphylococcus aureus (PI-Sa). Cells were obtained from five BLV-negative cows, five naturally BLV-infected, non-lymphocytotic cows, and five BLV-positive cows with persistent lymphocytosis (PL), and analyzed by flow cytometry. Normality was tested using the Anderson-Darling test, followed by an F test or a Lavene\'s test to analyze the equality of variances. Differences among frequencies were tested using the Qui-square test. Differences among means were verified by a one way analysis of variance (ANOVA), followed by a Turkey-Kramer test, or a Student t-test, a Mann-Whitney U-test, or a Kruskal-Wallis test. Mean total percentage of H2O2-producing cells, characterized by the intensity of 2,7-dichlorofluorescein fluorescence, in the assay without in vitro stimulus (30.60%) was smaller (p=0.005) than that verified in the assay after in vitro addition of LPS (52.00%), and after addition of PMA (63.13%). Mean total percentage of H2O2-producing cells in the assay with stimulus by in vitro phagocytosis of PI-Sa (47.47%) was not different from that verified in the assay without in vitro stimulus. Mean total percentages of H2O2-producing leukocytes did not differ among assays with previous in vitro stimuli. There was no difference in the percentages of H2O2-producing leukocytes, among cells obtained from cows that belonged to different groups. However, mean intracellular H2O2-production of leukocytes obtained from BLV-infected cows, presenting PL, without in vitro stimulus (p=0.007), after in vitro addition of PMA (p<0.001), or LPS (p=0.001), or after phagocytosis (p=0.002) was smaller than that verified in leukocytes obtained from non-infected and from BLV-infected, non-lymphocytotic, cows. The percentage of leukocytes that were carrying out phagocytosis, characterized by the intensity of propidium iodide fluorescence, among cells obtained from BLV-infected cows, presenting PL (7.20%), was smaller (p=0.047) than that verified among cells obtained from non-infected and from BLV-infected (12.90%), non-lymphocytotic (14.70%), cows. Furthermore, leukocytes obtained from BLV-infected cows, presenting PL, showed smaller phagocytosis intensity (p<0.001) than leukocytes obtained from non-infected and from BLV-infected, non-lymphocytotic, cows. Therefore, results show a functional vulnerability of circulating leukocytes obtained from BLV-infected, lymphocytotic cows.

Foi demonstrado o envolvimento das espécies reativas de oxigênio (ERO) na patogênese de algumas retroviroses, levando muitas vezes à progressão e/ou persistência das mesmas. No entanto, o papel das espécies reativas de oxigênio resultante da modulação do sistema antioxidante, e seu envolvimento na infecção de bovinos naturalmente infectados pelo VLEB, até o presente trabalho, não tinha sido ainda investigado. Desta forma, o presente estudo objetivou-se avaliar o envolvimento do estresse oxidativo na infecção pelo VLEB em bovinos naturalmente infectados, associado ou não ao estabelecimento da linfocitose persistente (LP). Assim, a avaliação do estresse oxidativo se deu pelo teor de malondialdeído, concentração de glutationa reduzida, atividade da glutationa peroxidase e da superóxido dismutase, e pela atividade antioxidante total; e a resposta imune pela quantificação das subpopulações de linfócitos, função fagocítica e produção intracelular de peróxido de hidrogênio de leuccitos polimorfonucleares, morte celular e proliferação linfocitária, além da avaliação hematológica e sorodiagnóstico da leucose enzoótica bovina (LEB). Os resultados do presente estudo apontaram para o envolvimento do estresse oxidativo na infecção pelo vírus da leucose enzoótica bovina, dado pela menor concentração de glutationa peroxidase e a tendência a menor atividade da superxido dismutase eritrocitárias nos animais infectados pelo VLEB, não podendo, contudo, ser associado à fase da infecção. Ademais, os marcadores de estresse oxidativo não apresentaram alterados nem sequer a atividade antioxidante total destes animais. Além disso, o presente trabalho apontou para menor proliferação de linfócitos e redução da apoptose de células CD5+ nos animais infectados pelo VLEB manifestando LP, corroborados pelo significante aumento da população de linfcitos B (CD21+), e dos principais co-marcadores das células infectadas, no caso células CD5+ e CD11b+, nestes animais. No entanto, não observou diferenças significativas na população de linfócitos T destes animais, nem sequer alteração da capacidade fagocítica e produção intracelular de peróxido de hidrogênio pela população de leucócitos polimorfonucleares nos animais infectados. / Abundant observations of multiple pathogenic interactions between reactive oxygen species (ROS) and the pathogenesis of some retroviruses have drawn attention to role of ROS on disease progression and/or persistence of infection. Therefore, the role of the oxidative stress resulted from the modulation of the antioxidant system in dairy cows naturally infected with BLV has not been studied yet. So, the present study tries to investigate the involvement of oxidative stress in dairy cows naturally infected with BLV associated or not with the persistent lymphocytosis (PL). Thus, the oxidative stress was evaluated by the malondialdehyde, reduced glutathione content, and by the activity of glutathione peroxidase and superoxide dismutase, and also total antioxidant activity. The immune response was also evaluated by the quantification of lymphocyte subsets, lymphocyte proliferation, polymorfonuclear leukocytes phagocytosis and intracellular hydrogen peroxide production, and cell death. The results of the present work point out to an involvement of oxidative stress in dairy cows naturally infected with BLV, given by a lower glutathione peroxidase activity and also a tendency towards lower superoxide dismutase activity, but it can be not associated with PL. Futhermore, the oxidative stress markers and also the total antioxidant status was not altered in infected animals. The present study also showed a lower lymphocyte proliferarion and apoptosis rates of CD5+ cells, strengthen by a higher B cells (CD21+) counts and also by a significant augment of CD5+ and CD11b+ positive cells that are often co-expressed by the infected cells. Although, no significant difference was observed in T cells counts. Moreover, the phagocytosis rates and the intracellular hydrogen peroxide production by the polymorphonuclear leukocytes are not altered in BLV infected dairy cows.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_clarissa_castro.pdf: 569054 bytes, checksum: b9876922c1664dec56ef9c9d4ff5cb3a (MD5) Previous issue date: 2011-03-31 / The enzootic bovine leukosis is an illness caused by the bovine leukosis virus (BLV) which provokes a persistent infection in cattle and is responsible for significant economical losses to the bovines, mainly dairy cattle. It is widely spread in Brazilian cattle and it can come up in three forms: asymptomatic infection, persistent lymphocytosis and lymphosarcoma. The animals that have antibodies against the BLV must be eliminated or separated from the rest of the cattle, because they are carriers and disseminators of the virus during all their lifetimes. The diagnosis of this disease is essential for control and eradication strategies based on the segregation of infected animals in order to avoid or attenuate the transmission of the virus, and consequently, minimize the economical losses caused by the disease. During the BLV infection antibodies are produced against the main viral proteins, gp 51, gp 30 (envelope glicoproteins) and p24 (capsid protein). The agar gel immunodiffusion (AGID) and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tests are the most used for diagnosis. In this report the immunoperoxidase technique (peroxidase linked assay - PLA) was evaluated in order to detect antibodies against the BLV. The results obtained in the PLA were compared with the AGID test and the specificity of the positive ones was confirmed by the Western blotting (WB) technique. Two hundred and one bovine serum samples of cattle coming from the city of Pelotas were tested: 59% (119) were positive in PLA and 26% (53) were positive in AGID. All the AGID positive samples were also PLA positive. From the 32,8% (66) of the conflicting serum results just eight were confirmed as positive in WB, indicating that the rest of the results were false-positive and showing that AGID failed in identifying 4% of the BLV positive animals. The PLA technique for the diagnosis of the BLV infection demonstrated to be very useful to use in control programs because it was more sensitive when compared to the AGID technique. However, the occurrence of false-positive results by the PLA makes its use unviable in eradication programs that involve the sacrifice of seropositive animals. / A leucose enzoótica dos bovinos (EBL) é uma enfermidade causada pelo vírus da leucose bovina (BLV), que ocasiona uma infecção persistente em bovinos, e é responsável por perdas econômicas significativas à pecuária, principalmente a leiteira. Amplamente disseminada no rebanho brasileiro, pode ser manifestada de três formas: aleucêmica, linfocitose persistente e linfossarcoma. Os animais com anticorpos contra o BLV deverão ser eliminados ou separados do restante do rebanho, pois significa que são portadores e disseminadores do vírus por toda a vida. O diagnóstico desta doença é essencial para estratégias de controle e erradicação baseadas na segregação de animais infectados no intuito de evitar ou amenizar a transmissão do vírus e, consequentemente, minimizar as perdas econômicas causadas pela doença. Durante a infecção pelo BLV são produzidos anticorpos contra as principais proteínas virais, gp51, gp30 (glicoproteínas do envelope) e p24 (proteína do capsídeo). O teste de imunodifusão em gel de ágar (agar gel immunodiffusion AGID) e o ensaio imunoenzimático (enzyme-linked immunosorbent assay ELISA) são os mais utilizados para diagnóstico. No presente trabalho foi avaliada a técnica de imunoperoxidase (peroxidase linked assay PLA) na detecção de anticorpos contra o BLV. Os resultados obtidos na PLA foram comparados com o teste de AGID e a especificidade dos positivos confirmada pela técnica de Western blotting (WB). Foram testadas 201 amostras de soro de bovinos provenientes de propriedades localizadas no município de Pelotas: 59% (119) foram positivos por PLA e 26% (53) positivos por AGID. Todas as amostras positivas na AGID foram também positivas na PLA. Dos 32,8% (66) dos soros com resultados conflitantes apenas oito foram confirmados como positivos no WB, indicando serem falso-positivos os demais resultados e constatando que a AGID falhou em identificar 4% de animais positivos para EBL. A técnica de PLA para diagnóstico de infecção pelo BLV se mostrou muito útil para uso em programas de controle devido à maior sensibilidade da técnica quando comparada com o teste de AGID. Contudo, a ocorrência de resultados falso-positivos pela PLA inviabiliza o seu uso em programas de erradicação que envolva o sacrifício do animal soropositivo.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The epidemiological, clinical and pathological aspects of 128 cases of bovine lymphoma are retrospectively described in this study (1965-2014).Out of the cases were the gender was informed (n=111), 84.7% of affected animals were females and 15.3% were males. Out of the cases were breed was informed (n=108), 63% of affected animals were Holstein cows. The age of affected cows (n=107) varied from 1 to 14 years, with most animals being adults (80.4%) with 5 to 8 years of age (57.9%). The most common clinical sign (n=89) was lymphadenomegaly (74.1%). Gross findings (n=125) included enlargement of lymph nodes in 71.2% of the cases; this finding was classified as localized in 89.6% of the cases and generalized in 10.3% of the cases. A retrospective study of 86 cases of bovine lymphoma classified as with diffuse pattern of distribution and verified by phenotypic (histology) and immunophenotypic (immunohistochemistry [IHC]) is presented. Based on these results, the lymphoma cases were classified by the Working Formulation (WF) of Non-Hodgkin s Lymphomas for Clinical Usage as: diffuse large non-cleaved cell (46.5%), diffuse large cleaved cell (33.7%), diffuse mixed small and large cell (4.6%), diffuse small cell plasmacytoid (7%), immunoblastic (3.5%), diffuse small cell intermediate (2.3%), diffuse small non-cleaved cell (1.2%), and diffuse small non-cleaved cell Burkitt s (1.2%). According to the IHC, 27 out of 86 (31.4%) lymphomas were positive to monoclonal antibody CD79αcy, used to detect B cells, and none were positive for polyclonal antibody CD3, used to detect T cells. Based on this, the B-cell type lymphomas were distributed as follows: diffuse large B-cell lymphoma (81.5%), large cell immunoblastic lymphoma (11.1%), and lymphoplasmacytoid lymphoma (7.4%), according the Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL). The results of this retrospective study, similar to what has been described in other parts of the world, allow us to conclude that bovine lymphomas are basically diffuse and predominantly made of intermediate-grade, large cells, with cleaved or non-cleaved nuclei. These lymphomas are due to neoplastic proliferation of B cells and correspond to almost all (92.6%) to what is currently classified as diffuse large B-cell lymphoma by REAL. / Foi realizado um estudo retrospectivo dos arquivos do Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) com base nos casos de necropsia e materiais de necropsia de bovinos dos últimos 50 anos (1965-2014). Foram incluídos nesse estudo somente os laudos que possuíam o diagnóstico de linfoma (n=128). Dos laudos que informavam o sexo (n=111), 84,7% correspondiam a fêmeas e 15,3% a machos. Dos laudos em que constava a raça (n=108), a mais prevalente foi a holandesa (63%). Em relação à idade (n=107), houve uma variação entre um e 14 anos. A maioria dos bovinos era adulta (80,4%) e a maior concentração dos casos ocorreu entre 5-8 anos (57,9%). Clinicamente (n=89), linfadenomegalia foi o achado mais frequentemente observado (74,1%). Na necropsia (n=125), 71,2% dos bovinos apresentavam aumento de volume dos linfonodos; essa linfadenomegalia foi classificada como localizada em 89,6% dos casos e generalizada em 10,3% dos casos. Realizou-se também a avaliação fenotípica (histologia) e imunofenotípica (imuno-histoquímica [IHQ]) de 86 casos de linfoma bovino. Com base nestes resultados, os linfomas foram assim distribuídos utilizando-se a classificação proposta pela Working Formulation (WF) of Non-Hodgkin s Lymphomas for Clinical Usage: difuso de grandes células não clivadas (46,5%), difuso de grandes células clivadas (33,7%), difuso de pequenas e grandes células (4,6%), difuso de pequenas células tipo plasmocitoide (7%), imunoblástico (3,5%), difuso de pequenas células tipo intermediário (2,3%), difuso de pequenas células não clivadas (1,2%) e difuso de pequenas células não clivadas tipo Burkitt (1,2%). Na IHQ, 27 dos 86 (31,4%) linfomas foram positivos para o anticorpo monoclonal CD79αcy, utilizado para detecção de linfócitos B, e nenhum caso foi positivo para o anticorpo policlonal CD3, utilizado para detecção de linfócitos T. Com base nestes resultados, os linfomas B foram assim distribuídos utilizando-se a Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL): linfoma difuso de grandes células B (81,5%), linfomas imunoblásticos de grandes células (11,1%) e linfomas linfoplasmocíticos (7,4%). Os resultados aqui apresentados permitem concluir que à semelhança do que vem sendo descrito em outras partes do mundo, os linfomas bovinos são basicamente difusos e predominantemente de grau intermediário, de grandes células, com núcleos clivados ou não clivados. Esses linfomas são decorrentes da proliferação neoplásica de linfócitos B e correspondem, em sua quase totalidade (92,6%), ao que atualmente é incluído na REAL como linfoma difuso de grandes células B.