Thèse doctorat : Chimie : Strasbourg 1 : 2006. Thèse doctorat : Chimie : Milano-Bicocca - Italie : 2006. / Thèse soutenue en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 12 p.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Génie des procédés et de l'environnement : Toulouse, INPT : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 179 réf.

Il est connu chez la levure Saccharomyces cerevisiae que la dégradation nucléaire est surtout impliquée dans les mécanismes de surveillance de la qualité des ARNs. Parmi les ribonucléases nucléaires, il existe l'endoribonucléase Rnt1p qui possède plusieurs fonctions notamment dans la maturation de l'ARN ribosomal. Cependant, sa délétion causait des défauts dans la progression du cycle cellulaire ainsi qu'une sensibilité à la température. Ces défauts ont été associés à deux gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire HSL1 et SW14. L'analyse des niveaux d'ARNm de ces deux gènes a montré que ces derniers étaient surexprimés en absence de RNT1 et que l'ajout de Rnt1p recombinant à des extraits d'ARNm provenant d'une souche rntl [delta] provoquait une diminution de l'ARNm mature. Le rôle de Rnt1p dans la régulation de ces deux gènes a également été confirmé par des expériences analysant les niveaux des protéines encodées par ces gènes. La protéine Hsl1p étant impliquée dans le contrôle de la morphogénèse et donc du cycle cellulaire, et étant donné que la localisation de Rnt1p est également dépendante de celui ci, nous avons voulu examiner la possibilité que Rnt1p régule Hsl1p de façon dépendante du cycle cellulaire. Pour cela, nous avons examiné l'impact de la délétion de Rnt1p sur l'expression de Hsl1p dans les différentes phases du cycle cellulaire. Par ailleurs, puisque Hsl1p possède deux fonctions à la fois dans le contrôle de la morphogénèse mais aussi dans la réponse au stress des parois, nous avons décidé d'étudier sa distribution dans le cycle cellulaire mais aussi l'impact de la régulation posttranscriptonnelle sur l'expression et la localisation de son ARNm dans les différentes phases du cycle cellulaire. Pour cela, nous avons testé l'impact de trois délétions de ribonucléases nucléaires (Rnt1p et Rrp6p) et cytoplasmique (Xrnlp) afin de comprendre quel niveau de régulation était le plus important dans l'expression de l'ARNm Hsll. Nous avons utilisé pour cela une technique très sensible appelée FISH (fluorescent in situ hybridization) qui permet de détecter des ARNm individuels au sein de la cellule et d'en calculer le nombre dans chaque phase du cycle et dans chaque compartiment cellulaire (noyau et cytoplasme). Nos résultats ont montré que Rnt1p jouait un rôle très important dans l'expression et la localisation cycle cellulaire-dépendante de l'ARNm Hsll avec un impact marqué au niveau de la phase G2/M, alors que les autres délétions n'avaient pas d'effet sur l'expression cyclique de l'ARNm Hsl1.

Thesis--Université de Genève. / Bibliography: p. 46-47.

La recombinaison méiotique n'est pas distribué de manière aléatoire le long des chromosomes, mais est caractérisée par des domaines froids et chauds qui limitent la diversité génétique transmise par les gamètes. Cependant, le profil de la recombinaison méiotique peut être modifiée, étant donné que la fusion de l’ endonucléase Spo11 au domaine de liaison à l'ADN de Gal4 est suffisante pour favoriser la formation des cassures double brin (CDB) et la recombinaison à proximité des sites de liaison de Gal4, dans la levure et dans les souris. Ici, dans la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons étudié l'effet de la fusion de Spo11 à 8 protéines de liaison à l'ADN lors de la méiose. Comme modules de ciblage, nous avons utilisé des facteurs de transcription de levure et des protéines artificiels de liaison à l'ADN (TALEs et ZFs), qui sont apparus comme des outils efficaces pour faire varier la position et / ou le nombre de sites ciblés. Lors de l'expression de chacun des fusions Spo11, nous avons examiné la progression de la méiose, la formation des CDB dans les sites naturels et ciblées ainsi que le niveau relatif de la recombinaison méiotique. Ce travail dans l’organisme modèle levure ouvre de nouvelles voies pour modifier la recombinaison méiotique chez d'autres organismes, tels que des mammifères et des plantes, pour augmenter la diversité génétique dans les sites d'intérêt et disséquer l'information génétique, en surmontant les limitations dues à la liaison génétique. / Meiotic recombination is not randomly distributed along the chromosomes, but is characterized by hot and cold domains that limit the genetic diversity transmitted by the gametes. However, the recombination profile can be modified, since the tethering of Spo11 endonuclease, upon fusion to the Gal4 DNA-binding domain, is sufficient to enhance DSB formation and recombination near several Gal4 consensus binding sites, in yeast and in mouse. Here, in the yeast Saccharomyces cerevisiae, we studied the effect of Spo11 fusions to 8 different DNA-binding proteins during meiosis. As targeting modules, we used yeast full-length transcription factors and artificial DNA-binding modules (TALEs and ZFs), which emerged to be efficient tools to vary the location and /or the number of targeted sites. Upon expression of each of the Spo11 fusions, we examined meiotic progression, DSB formation at natural and targeted sites as well as the relative level of meiotic recombination. This work in the yeast model opens new avenues to modify meiotic recombination in other organisms, such as mammals and plants, to boost genetic diversity at sites of interest and to dissect the genetic information, overcoming the restrictions due to the genetic linkage.

L’érythritol est un polyol aux propriétés édulcorantes utilisé comme substitut de sucre par l’industrie agroalimentaire. Le but principal du projet est l’amélioration du procédé de production d’érythritol par génie métabolique. L’idée est de construire des souches surexprimant les gènes liés à la voie de synthèse de l’érythritol. L’objectif principal est donc d’identifier les gènes clés permettant d’augmenter la synthèse d’érythritol et d’évaluer cette dernière en bioréacteur.Parallèlement à cela, un autre objectif est d’identifier les gènes liés au catabolisme de l’érythritol. En effet, Y. lipolytica est capable de produire de l’érythritol, mais aussi de le reconsommer en cas d’absence d’autre source de carbone. L’objectif est donc d’identifier les gènes liés au catabolisme de l’érythritol afin de les déléter, et ainsi obtenir une souche capable de produire de grandes quantités d’érythritol sans le reconsommer en fin de culture.Les résultats obtenus ont permis d’identifier les étapes clés de la voie de synthèse de l’érythritol et d’obtenir des souches à haut rendement et productivité par génie génétique. Par ailleurs, deux gènes de la voie de dégradation de l’érythritol ont pu être identifiés pour la première fois chez une levure. En combinant la surexpression de gènes liés à la synthèse de l’érythritol et la délétion de gènes liés à sa dégradation, une souche présentant une productivité 74% plus importante que la souche sauvage a pu être créée. Par ailleurs, une souche capable de convertir l’érythritol en érythrulose, un autre composé d’intérêt, a également pu être construite. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La chromatine est le support de l'information génétique tout le long du cycle cellulaire. Elle est soumise à des modifications diverses et rigoureusement coordonnées par les complexes CDK-Cyclines, sous le contrôle de mécanismes de surveillance. En mitose, la kinase Aurora est un acteur clé qui contrôle la ségrégation correcte des chromosomes. Aurora participe à la bi-orientation des centromères, à la condensation des chromosomes et à la cytocinèse. Le dysfonctionnement de cette kinase conduit alors à une instabilité chromosomique et à l'aneuploïdie, un phénotype observé dans la majorité des cancers solides. Les travaux réalisés au cours de cette thèse démontrent un nouveau rôle pour cette kinase dans la dispersion et la disjonction des télomères en mitose chez la levure S. Pombe. La dispersion des télomères s'accompagne en métaphase de la dissociation aux télomères des protéines Swi6/HP1 et cohésine Rad21. Tandis que la disjonction a lieu en anaphase après la phosphorylation de la sous-unité de condensine Cnd2. L'inhibition d'Aurora induit la formation de ponts chromosomiques anaphasiques qui révèle des défauts de séparation des télomères. La délétion d'une protéine spécifique aux télomères, Ccq1, protège la cellule de la formation de ces ponts chromosomiques en favorisant le chargement de la condensine en anaphase malgré l'inhibition d'Aurora. / Chromatin is the support of the genetic information throughout the cell cycle. It is subject to various modifications that occur with precise coordination. This coordination is led by CDK-cyclins under the control of cell cycle checkpoints. In mitosis, correct chromosome segregation is ensured by Aurora kinases. Aurora participates to centromere bi-orientation, chromosome condensation and cytokinesis. A dysfunction in the activity of this kinase leads to chromosomal instability and aneuploidy, phenotypes frequently observed in cancer. The results obtained during this thesis reveal a new function for fission yeast Aurora kinase during mitosis in telomere dispersion and disjunction. Telomere dispersion is triggered in metaphase by the dissociation of Swi6/HP1 and cohesion Rad21 from telomeres. Then, during anaphase, the phosphorylation of the condensin subunit Cnd2 is required for telomere disjunction. Aurora inhibition leads to anaphase chromosome bridges with unseparated telomeres. Deletion of a specific telomeric protein, Ccq1, prevents the formation of anaphase chromosome bridges by favoring condensin loading despite Aurora inhibition.

La dynamique mitochondriale est un processus qui correspond à un équilibre dynamique entre des forces de fusion et de fission qui s'exercent sur les membranes des mitochondries. Quand les forces de fission prédominent les mitochondries apparaissent fragmentées, à l'inverse quand les forces de fusion sont prépondérantes les mitochondries forment un réseau filamenteux et interconnecté. Les principaux acteurs qui contrôlent la dynamique mitochondriale sont de grandes GTPases conservées de la levure à l'homme. Dnm1p (DRP1) est impliquée dans la fission de la membrane externe. Fzo1p (MFN1-2) et Mgm1p/Msp1p (OPA1) sont impliquées dans la fusion respectivement de la membrane externe et interne. L'objet d'étude principal de mon équipe est la protéine Msp1p/OPA1. Mon équipe a montré que la perte de Msp1p chez la levure à fission S. pombe induit la fragmentation des mitochondries, la perte du génome mitochondrial (ADNmt) et conduit à la mort de cette levure petite négative qui ne peut tolérer l'absence d'ADNmt. Afin de mieux comprendre les différents rôles de Msp1p et leurs relations, j'ai recherché des suppresseurs génétiques et pharmacologiques de la létalité induite par la perte de Msp1p. Nous avons identifié des suppresseurs génétiques en supprimant le gène msp1+ par recombinaison homologue dans des levures de fonds génétiques différents. Dans toutes les souches utilisées, des mutations spontanées localisées dans un des 3 gènes codant des protéines de fission (dnm1+, fis1+, caf4+), ont été retrouvées. Ces mutations suppriment à la fois la fragmentation des mitochondries et la perte de l'ADNmt, suggérant que le rôle de Msp1p dans la stabilité de l'ADNmt est une conséquence de sa fonction fusogène. Grâce au criblage de chimiothèques, nous avons identifié 5 composés pharmacologiques capables de supprimer la létalité d'un mutant thermosensible de Msp1p. J'ai entrepris la caractérisation de deux d'entre eux. Le premier supprime à la fois la fragmentation et la perte d'ADNmt induites par l'inactivation de Msp1p et semble cibler la fission mitochondriale. Le second ne supprime que la perte de l'ADNmt, suggérant que la seule fonction essentielle de Msp1p est son rôle dans le maintien de l'ADNmt. Au cours de ces travaux je me suis également intéressé aux mécanismes moléculaires pouvant expliquer la petite négativité de S. pombe. En absence d'ADNmt, les levures petites positives sont viables car capables, contrairement aux levures petites négatives, de maintenir un potentiel de membrane mitochondrial. 6 allèles, nommés ptp et rzl, qui permettent à la levure S. pombe de vivre sans ADNmt ont été décrits il y a plus de 20 ans. Nous les avons identifiées par des approches gène candidat ou séquençage haut débit. Ces allèles correspondent à des versions mutées de gènes codant soit des sous-unités de l'ATP synthase soit des sous-unités du protéasome. Dans le premier cas, ceci nous permet d'impliquer un fonctionnement reverse de l'ATP synthase et du transporteur ADP/ATP dans la restauration du potentiel de membrane mitochondrial et donc dans l'acquisition de la petite positivité chez S. pombe. Dans le second cas, différents mécanismes potentiellement impliqués ont été proposés. L'identification des gènes ptp et rzl devrait permettre une meilleure compréhension du processus de petite positivité/négativité qui reste à ce jour assez obscur. Les suppresseurs génétiques et pharmacologiques capables de supprimer la perte d'ADNmt en supprimant ou non la fragmentation des mitochondries constituent d'excellents outils pour comprendre les mécanismes qui relient la dynamique mitochondriale à la perte de l'ADNmt. La mise en évidence de la conservation des effets des drogues identifiées chez la levure chez les mammifères pourrait avoir un intérêt thérapeutique. En effet, des mutations d'OPA1, l'homologue de Msp1p chez les mammifères, sont responsables d'une neuropathie optique. / Mitochondrial dynamics corresponds to a dynamic balance between two antagonistic forces of fusion and fission, which act on mitochondrial membranes. When fission prevails mitochondria appear fragmented, conversely when fusion predominates mitochondria form a filamentous and interconnected network. The main actors that control mitochondrial dynamics are large GTPases conserved from yeast to human. Dnm1p (DRP1) is involved in the fission of the outer membrane. Fzo1p (MFN1-2) and Mgm1p/Msp1p (OPA1) are involved in the fusion of the outer and inner membrane respectively. My team is interested in the protein Msp1p/OPA1 and showed a few years ago that loss of Msp1p in the fission yeast S. pombe induces mitochondrial fragmentation, mitochondrial genome (mtDNA) depletion and cell death. As a " petite negative ", S. pombe cannot tolerate the absence of mtDNA. To better understand the various role of Msp1p and their relationship, we searched for genetic and pharmacological suppressors of the lethality induced by Msp1p inactivation. We identified genetic suppressors by deleting the msp1+ gene by homologous recombination in various genetic backgrounds. In all strains, we found spontaneous mutations located in one of the 3 genes encoding mitochondrial fission proteins (dnm1+, fis1+, caf4+). These mutations suppress not only mitochondrial fragmentation but also mtDNA loss, suggesting that the role of Msp1p in mtDNA maintenance is a consequence of its fusogenic function. Thanks to chemical libraries screening, we identified 5 pharmacological compounds able to suppress the lethality induced by a Msp1p temperature-sensitive mutant, and characterized two of them. The first one suppresses both mitochondrial fragmentation and mtDNA loss and appears to target mitochondrial fission. The second one suppresses only mtDNA loss, suggesting that mtDNA maintenance is the only essential function of Msp1p. During this work I was also interested in the molecular mechanisms that could explain why S. pombe is " petite negative ". In the absence of mtDNA, the " petite positive " yeasts can survive because, unlike the " petite negative " yeasts, they are able to maintain mitochondrial membrane potential. Six alleles, named ptp and rzl, which allow S. pombe to live without mtDNA were previously described 20 years ago. We identified them by candidate gene and high-throughput sequencing approaches. These alleles correspond to mutated versions of genes encoding either subunits of ATP synthase or subunits of the proteasome. In the first case, this allows us to involve the reverse functioning of the ATP synthase and the ADP/ATP carrier in the restoration of the membrane potential thus converting S. pombe into a " petite positive " yeast. In the second case, various potentially involved mechanisms are proposed. The identification of ptp and rzl genes should allow a better understanding of the " petite positive/negative " properties that remain today rather unclear. Genetic and pharmacological suppressors able to suppress mtDNA loss with or without mitochondrial morphology recovery, represent interesting tools to understand the mechanisms that link mitochondrial dynamics to mtDNA loss. Furthermore, showing that the effects of the compound that we identified in yeast are conserved in mammals may have a therapeutic value. Indeed, mutations in OPA1, the Msp1p homologous in mammals, are responsible for an optic neuropathy.

Chez la levure à bourgeon, l’établissement de domaines silencieux pour la transcription nécessite le recrutement du complexe SIR (Silencing Information Regulator).Mon travail de thèse s’est attaché à étudier une nouvelle voie d’établissement de la répression transcriptionnelle par les SIRs. Des travaux récents ont montré que la répétition en tandem de protéines fortement liées à l’ADN favorise la mise en silence d’un gène rapporteur voisin (Dubarry et al. 2011).En combinant des approches génétiques et moléculaires, j’ai pu montrer qu’un locus composé de 120 répétitions du site opérateur de l'opéron lactose (lacO) liées par la protéine LacI génère un stress chromatinien local et représente une source d'instabilité génomique. Cette instabilité étant limitée par la recombinaison homologue.Dans la seconde partie de ma thèse, j'ai étudié la dynamique d’établissement de la répression par les complexes lacO/LacI et montré que la répression transcriptionnelle et le recrutement du complexe SIR s'établissent sur plusieurs cycles cellulaires. En outre, mes résultats montrent que le complexe SIR stabilise les nucléosomes au niveau des complexes ADN / protéines de forte affinité.Enfin, deux cribles génétiques m’ont permis d’identifier les complexes HIR et LSM comme des facteurs impliqués dans l’hétérochromatinisation induite par les répétitions lacO/LacI. Les connaissances actuelles de ces complexes étant restreintes à la régulation de la transcription et au post-traitement des ARN messagers, d'autres études seront nécessaires pour disséquer le lien entre ces complexes et l'inhibition transcriptionnelle déclenchée par les complexes lacO /lacI. / Silent domains in budding yeast are formed by the recruitment and spreading of the Silent Information Regulator (SIR) complex.Previous studies showed that an array of tight protein-DNA complexes has the ability to trigger SIR dependent silencing of an ectopically placed EADE2I reporter (Dubarry et al. 2011). It was proposed that replication stress arising due to difficulties to replicate the array of tight protein-DNA complexes is the source of this phenomenon. In my work I have demonstrated that an array of 120 lacO repeats tightly bound by a LacI protein is a source of genomic instability. Investigating the genetic requirements for this event, I have demonstrated that homologous recombination pathways maintain the stability of the locus. My work is consistent with previous reports in fission yeast demonstrating that lacO/LacI is a chromatin stress site (Sofueva et al. 2011). As a second part of my PhD project, using an inducible system that I have developed, I followed the dynamics of establishment of silencing of an ectopically placed reporter gene. My results demonstrate that transcriptional silencing in this system takes many cell cycles to be established. Additionally, I have identified a novel role of the SIR proteins in stabilizing nucleosomes. In an attempt to elucidate the functional link between lacO/LacI and EADE2I silencing, I have performed two SGA (synthetic genetic array) screens. I have identified the HIR and LSM complexes involved into transcriptional regulation and mRNA processing respectively, as potential candidates. Further studies will elucidate the role of these factors on lacO/LacI induced silencing.

Dans une première partie, je présente le travail que j’ai accompli sur la coévolution moléculaire. Je présente le contexte biologique et les différentes mesures qui permettent de détecter la conservation et la coévolution à l’échelle des acides aminés. Ensuite, je montre une application de ces mesures à la détection des résidus critiques dans la protéine P53 liée au cancer. Dans ce but, j’ai créé une évaluation des différentes méthodes de prédiction. J’utilise ensuite la même méthodologie sur une base de données de mutations liées à des maladies génétiques. Je montre également comment la coévolution au niveau des résidus permet de découvrir des interactions protéine-protéine sur le virus de l’hépatite C. Enfin, je présente l’algorithme PruneTree, qui permet de filtrer des ensembles de séquences utilisés comme entrée par les programmes de détection de coévolution.Dans une deuxième partie, je m’intéresse à l’étude de l’évolution à l’échelle du génome, en particulier aux mécanismes de recombinaison méiotique. Pour cela j’ai considéré le taux de recombinaison le long du génome et sa cause, les cassures double-brin de l’ADN. Je présente alors un modèle de la distribution de ces cassures et de la liaison des différentes protéines liées à la recombinaison. Je présente également une méthode de détection de périodicité le long du génome basée sur les transformées de Fourier.Enfin, dans la dernière partie, je présente un nouvel algorithme pour simuler l’évolution des génomes de façon à évaluer les outils de reconstruction, et le paquet R-CLAG permettant d’utiliser l’algorithme de classification CLAG depuis R. / In a first part, I show the work I have done on molecular evolution. I present the general biological background and the measures that allow us to detect both conservation and coevolution at the amino-acid level. Then, I present an application of these measures to the detection of critical residues in the cancer protein P53. To this end, I have made a benchmark of different prediction methods. I then use the same methodology on a large scale database of pathogenic mutations linked to genetic diseases. After that, I show how residue-level coevolution can help us discover protein-protein interactions in the hepatitis C virus. Finally, I present the PruneTree algorithm, which allows filtering sequence sets used as input for molecular coevolution detection methods. In a second part, I have studied evolution at the genome level, in particular the recombination mechanisms that occur during meiosis. I have looked at the recombination rates along the genomes and its primary cause, the double-strand breaks, but also at the density of other proteins involved in recombination. I also present a method based on Fourier transforms to analyze these genomic signals, and a model for the distribution along the genome of double-strand breaks and recombination proteins. Finally, I present the other tools I have developed. I describe a novel algorithm that can simulate the evolution of genomes in order to benchmark the phylogenetic reconstruction algorithm PhyChro. Finally, I present the R-CLAG package that allows for easy use of the clustering algorithm CLAG.