La levure du boulanger a une durée de vie réplicative limitée : chaque cellule mère produit un nombre fini de filles avant de mourir. Cette entrée en sénescence est supposée notamment résulter de l’accumulation d’agrégats de protéines endommagées au sein de la cellule mère. La rétention des agrégats au sein des mères permettrait de produire des filles rajeunies. Cependant, ce mécanisme de ségrégation asymétrique reste controversé, en partie car il est complexe de suivre la dynamique des agrégats protéiques in vivo. Nous avons développé une méthodologie pour suivre la formation des agrégats protéiques au cours d’un choc thermique au sein de cellules uniques. Associées à un modèle simple d’agrégation, nos données montrent que l’asymétrie peut être expliquée quantitativement par la croissance polarisée du bourgeon. De plus, des expériences de vieillissement réplicatif réalisées au sein d’une puce microfluidique suggérèrent que l’accumulation d’agrégats dans les mères pourrait induire la mort, mais seulement lorsque les cellules subissent un stress protéotoxique. Cette étude apporte donc un éclairage nouveau sur les mécanismes d’héritabilité des agrégats protéiques et leur contribution au vieillissement réplicatif chez la levure du boulanger. / Budding yeast cells have a limited replicative life span: a mother cell can produce a limited number of daughter cells before it dies. It has been proposed that the progressive accumulation of aggregates of damaged proteins within mother cells drives entry into senescence. The retention of such damages by mothers is thought to permit the daughter lineage rejuvenation. Yet the mechanism of their asymmetrical segregation is still controversial, in part because of difficulties inherent to the tracking of the dynamics of protein aggregates in vivo. In this context, we have developed a single cell methodology to track the formation of protein aggregates upon heat shock in single cells. In combination with a simple computational model of aggregation, our data reveal that the asymmetry can be explained quantitatively by the polarized growth of the bud. In addition, replicative aging experiments performed in a microfluidic device suggest that the accumulation and retention of protein aggregates in mothers may be responsible for cell death, but only under particular proteotoxic stress. Therefore, this study sheds new light on the mechanism of inheritance of protein aggregates and its contribution to replicative aging in budding yeast.

Le ribosome est un complexe cellulaire impliqué dans la catalyse et la coordination des différentes étapes de la traduction de l’information génétique, des ARN messagers aux protéines. Avec une masse moléculaire avoisinant 3.3 méga daltons, le ribosome eucaryote est 40% plus volumineux que son homologue bactérien. Le premier volet de la thèse présente la structure cristallographique du ribosome eucaryote 80S de levure à haute résolution. Cette structure constitue une base solide pour l’étude de la synthèse des protéines chez les eucaryotes ainsi que pour le développement de nouveaux composés thérapeutiques. Le deuxième volet est consacré aux structures cristallographiques de deux familles d’inhibiteurs spécifiques des eucaryotes, les glutarimides et les trichothecenes, en complexe avec le ribosome. Ces inhibiteurs constituent de nouveaux outils pour sonder les fonctions du ribosome et contribueront aux développements de composés par des approches de structure‐based drug design. / The ribosome is large cellular machinery that catalyzes and coordinates every step required to translate the genetic information encoded in messenger RNAs into proteins. With a molecular weight of 3.3 mega daltons, the eukaryotic ribosome is 40% larger compared to its bacterial counterpart. The fist axis of thesis presents the crystal structure of the complete eukaryotic 80S ribosome from yeast at high resolution. This structure constitutes a unique framework for future investigations of protein synthesis in eukaryotes and development of new therapeutic agents. The second axis of the thesis presents the crystal structures of two distinct families of eukaryote‐specific inhibitors, the glutarimides and the trichothecenes, bound the eukaryotic ribosome. These inhibitors constitute new tools to probe the ribosome functions and a starting point for future structure‐based drug design.

Un objectif central en biologie est de comprendre la relation entre le génotype et le phénotype. Afin de disséquer les bases génétiques de la diversité phénotypique, il est nécessaire de disposer d’une collection de données génomiques d’un grand nombre d’individus d’une même espèce. Dans ce but, mes travaux de thèse se basent sur l’étude des séquences génomiques ainsi que des données phénotypiques de 1011 isolats naturels de la levure Saccharomyces cerevisiae. Dans un premier temps, je me suis intéressé à la description de la variation génétique et phénotypique pour dresser un portrait précis de l’histoire évolutive de cette espèce. Les données de phénotypage nous ont permis de réaliser des études pangénomiques d’association génotype-phénotype avec une puissance jusque là inégalée chez Saccharomyces cerevisiae. Je me suis par la suite penché sur l’évaluation des paramètres influençant le pouvoir de détection d’une telle approche, d’en apprécier limites pour tenter de les contourner. / Elucidating the genetic origin of phenotypic diversity among individuals within the same species is essential to understand evolution. Using whole genome sequences of 1,011 Saccharomyces cerevisiae isolates, my work sought to describe intraspecific genetic variation and investigate of its phenotypic consequences. Doing so, I obtained a precise view of the evolutionary history of S. cerevisiae. Phenotypic characterization provided the opportunity to perform genotype-phenotype genome-wide association studies with unprecedented power. I then focused on the evaluation of the parameters influencing genome-wide association studies, the appreciation of the limits of such an approach, and ways to circumvent them.

L’accumulation de remaniements de la structure des chromosomes aussi appelés variations structurelles (SV) est un important contributeur à la transformation des cellules malignes et à la constitution d’une hétérogénéité intratumorale. Nous avons développé un outil bio-informatique qui permet désormais d’obtenir une image fine de ces SV qui se produisent dans le génome humain. Nous avons ainsi pu démontrer l’existence de SV présentes à de faibles fréquences dans différentes populations cellulaires supposées clonales montrant que les taux de formation des SV pourraient être grandement sous-estimés. Parallèlement, nous avons montré que le niveau d’instabilité des individus dépend de facteurs génétiques de prédisposition. Pour les identifier, nous avons développé des systèmes génétiques de mesure des taux de SV chez la levure qui vont nous permettre d'identifier les gènes contrôlant l'instabilité chromosomique par analyse de liaison à grande échelle. Ces régulateurs représenteront de nouveaux gènes candidats impliqués dans le développement du cancer chez l’homme, car les déterminants génétiques impliqués dans le métabolisme de l'ADN sont très conservés entre la levure et les mammifères. / The accumulation of chromosomal rearrangements also called Structural Variations (SV) is a major contributor to the transformation of tumoral cells and to the constitution of intratumoral heterogeneity. We have developed a bio-informatic tool that can now provide a sharp image of SV that occur in the human genome. We have demonstrated the existence of SV present in low proportions in different supposedly clonal cell populations showing that the rates of SV formation could be greatly underestimated. In parallel, we have shown that the level of instability of the genome depends on predisposition factors. To identify those, we have developed genetic assays to measure the rate of SV in yeast that will allow us to identify new genes controlling the stability of the genome using large scale linkage analysis. These regulators represent new gene-candidates involved in the development of cancer in human as the determinants involved in DNA metabolism are very conserved between yeast and mammals.

La Maladie d’Alzheimer (MA) est un des challenges sanitaires les plus importants du XXIème siècle. En effet, elle touche 35,6 millions de personnes en 2010, et en atteindra probablement quatre fois plus en 2050.Cependant, peu d’éléments sont à ce jour connus concernant les mécanismes de toxicité de cette maladie. Il semble néanmoins acquis que l’agrégation du peptide amyloïde Aβ est l’élément déclenchant une cascade d’événements cellulaires aboutissant à trois types de lésions : les dégénérescences neurofibrillaires, les plaques amyloïdes et une atrophie corticale, révélatrice d’une importante mort neuronale.Différents modèles transgéniques d’étude de la toxicité du peptide Aβ ont été créés au cours des vingt dernières années. Cependant, aucun modèle de levure n’a encore vu le jour, alors que cet organisme est utilisé depuis de nombreuses années pour l’étude des protéines amyloïdes.J’ai donc cherché à créer ce modèle de toxicité au cours de ma thèse. L’adressage d’une protéine de fusion Aβ-GFP à la voie de sécrétion permet de rendre son expression toxique chez la levure. J’ai démontré que le trafic intracellulaire était un élément important pour la génération d’espèces toxiques. Les orthologues de PICALM, facteur de prédisposition à la MA, sont impliqués dans la toxicité, montrant une conservation des mécanismes de toxicité avec l’Homme. Les constructions semblent avoir la capacité de traverser les membranes afin d’atteindre des cibles cellulaires comme la mitochondrie.Le modèle ainsi construit nous permettra de mettre en place une étude de la relation entre la structure et la toxicité du peptide Aβ et mieux comprendre les mécanismes cellulaires régissant la MA. / Alzheimer’s Disease (AD) is one of the most important sanitary challenges of the XXIst century. Indeed, 35.6 million people are affected in 2010, and there will be probably four times more in 2050. However, little is known about the mechanisms of toxicity of this disease. Nevertheless, it seems that aggregation of the Aβ peptide is the triggering factor of a cascade of cellular events that leads to three characteristic lesions: neurofibrillary tangles, amyloid plaques and a cortical atrophy, revealing an important neuronal death. Different transgenic models for the study of the Aβ peptide toxicity have been created during the past twenty years. However, no yeast model has yet seen the light of day, whereas this organism is used for several years to study amyloid proteins.Therefore I worked to create this model during my thesis. Addressing an Aβ-GFP fusion to the secretory pathway enable this construction to become toxic in yeast. I proved intracellular pathways are important for generation of toxic species. PICALM orthologs, an AD predisposing factor, are involved in toxicity, showing conservation in the mechanisms of toxicity between yeast and man. The constructions seem to be able to cross membranes and reach cytoplasmic targets as mitochondria.Thus, this model will allow us to set a study of the relationship between structure and toxicity of the Aβ peptide and better understand the cellular mechanisms governing AD

Cette investigation anthropologique touche aux types de relations qu'entretiennent les scientifiques, et plus particulièrement les biologistes, avec ceux que l'on a coutume de nommer leurs "objets de recherche". Partant du constat que l'usage de catégories comme la rationalité ou l'objectivité, ou encore les dichotomies sujet/objet et nature/culture ne peuvent que nuire à un rendu de l'expérience scientifique qui tienne compte de ce qui importe réellement aux chercheurs, cette thèse se déploie autour d'un laboratoire et de l'observation minutieuse des interactions entre les deux espèces dominantes qui le définissent : l'Homme et la levure Saccharomyces cerevisiae, et interroge ainsi sous un autre angle des notions comme le réductionnisme, l'objectivité ou encore l'universalité des connaissances produites par les sciences occidentales. / This anthropological investigation concerns the types of relationships between scientists, and more specifically biologists, with those actually called their “research object”. From the assessment that the use of categories such as rationality or objectivity, or the dichotomies subject/object and nature/culture can only be prejudicial to a rendition of the scientific experiment which considers what really matters to the researchers, this PhD takes place around a laboratory and around meticulous observation of the interactions between the two prevailing species which define it : the Man and the Saccharomyces cerevisiae yeast, and question therefore with a different perspective notions such as reductionism, objectivity or universality of knowledge made from western sciences.

Les bases moléculaires responsables des propriétés technologiques des levures œnologiques sont pas ou peu connues. Or, ces connaissances sont nécessaires pour mettre en œuvre des stratégies d'amélioration génétique des capacités fermentaires ou de l'impact organoleptique des levures par croisements et une meilleure exploitation de la biodiversité. Ces travaux de thèse ont visé à l'identification des bases génétiques de plusieurs propriétés d'intérêt, telles que la production de sulfites, la capacité fermentaire en milieu carencé en azote ou la formation d'esters. Une approche de recherche de QTL a été mise en œuvre en s'appuyant sur la création d'une population de ségrégants méiotiques issus du croisement de deux souches œnologiques aux caractéristiques contrastées. Une caractérisation des phénotypes des ségrégants associé à leur génotypage a permis d'identifier des QTL pour les différents traits étudiés. L'implication d'une région du génome dans le contrôle de la voie d'assimilation des sulfates a été démontrée. Ce locus est responsable de la variation phénotypique de plusieurs métabolites de cette voie et de métabolites indirectement connectés. D'autres QTL ont également pu être mis en évidence pour les capacités fermentaires sur un milieu carencé en azote et la production de différents composés volatils. Leur analyse a permis d'identifier plusieurs gènes candidats dont les fonctions sont liées directement ou indirectement aux phénotypes étudiés. / The molecular basis of technological properties of wine yeasts are not or poorly known. However, this knowledge is required for the improvement of the fermentation capacity and of the organoleptic impact of wine yeasts by breeding strategies and a better exploitation of the yeast biodiversity. This thesis aimed at identifying the genetic bases of several traits of interest such as: sulfite production, fermentation ability in low nitrogen medium or esters formation. A QTL mapping approach has been implemented from a population of meiotic segregants derived from the cross of two strains with contrasting oenological characteristics. Phenotyping of the a population of meiotic segregants was combined with a genotyping to identify QTL for these traits. The involvement of a region of the genome in the control of sulphate assimilation pathway has been demonstrated. This locus is responsible for the phenotypic variation of several metabolites of this pathway and indirectly connected metabolites. Other QTLs have also been demonstrated for the fermentation capacities on a nitrogen limiting medium and production of various volatile compounds. Their analysis revealed several candidate genes whose functions are related directly or indirectly to the studied phenotypes.

L’objectif de ce travail est l’étude de l’impact du dioxyde de carbone (CO2) sur la physiologie et le métabolisme de la levure Saccharomyces cerevisiae, en particulier son impact sur le catabolisme oxydatif du glucose et son rôle dans le déclenchement de la transition respiro-fermentaire. Le CO2 est au coeur des interactions entre phénomènes biologiques et phénomènes physiques de transfert existant au sein d’un réacteur biologique. La compréhension de son impact sur la physiologie de la levure nécessite la connaissance de sa concentration en phase liquide et donc la maitrise des phénomènes de transfert interphasiques.Le transfert liquide / gaz du CO2 en fermenteur a été étudié par une approche couplant modélisation et expérimentation avec un effort particulier sur l’analyse intégrée des phénomènes biologiques et de transfert. En comparaison avec les hypothèses de transfert généralement admises une sursaturation du moût en CO2 dissous dans le moût a été observée lors de cultures de S.cerevisiae et attribuée à l‘existence d’une distribution asymétrique de tailles de bulles de la phase dispersée. Il a été démontré que le transfert liquide / gaz du CO2 lors d’une culture microbienne intensive ne peut être décrit par analogie avec le transfert gaz / liquide de l’oxygène et que la connaissance de la concentration en CO2 dissous ne peut être réalisée que par sa mesure directe.L’impact du CO2 sur le métabolisme oxydatif de la levure a été investigué par le suivi de la réponse dynamique de la réponse à différents incréments mesurés de la concentration en CO2 dissous en culture continue. Cette réponse est constituée d’une réponse transitoire et intense et d’une réponse à long-terme plus modérée Elle se caractérise par l’impact du CO2 sur l’énergétique cellulaire en augmentant la génération et la dissipation d’énergie ce qui est traduit à court-terme par une augmentation transitoire de +24 à +37 % des vitesses spécifiques de respiration lors d’échelons de la concentration en CO2 dissous de +2.96 et +5.29 mM et à long-terme par une diminution de 18% YATP de % lorsque la concentration en CO2 dissous augmente de 1.6 mM à 17 mM. L’effet du CO2 sur la transition respiro-fermentaire a été étudié en culture de type accélérostat en présence d’une concentration élevée en CO2 dissous. Dans ces conditions, la bascule vers le métabolisme réductif est obtenue pour un taux de croissance (0.122 h-1) et des vitesses spécifiques de respiration (5.2 mmoleO2.gX-1.h-1) inférieurs aux valeurs obtenues avec un accélérostat sans apport exogène de CO2 (0.256h-1 et 8.65 mmoleO2.gX-1.h-1) respectivement. Cette modification du métabolisme n’a pu être corrélée directement à un déficit de potentiel énergétique oxydatif et semble probablement liée à une perte de flexibilité d’adaptation à la dynamique de variation de l’environnement. / The aim of this work was to evaluate the impact of carbon dioxide (CO2) on the physiology of the yeast Saccharomyces cerevisiae, more precisely on the oxidative metabolism and on the onset of alcoholic fermentation. CO2 is involved in the interactions between transfer phenomena and biological phenomena in fermenters. The knowledge of the dissolved CO2 concentration and then of the CO2 liquid / gas mass transfer phenomena is required to assess the impact of this compound on the yeast physiology.Investigation of CO2 liquid / gas in biological reactors has been carried out using simulations and experiments taking into consideration both biological and transfer phenomena. CO2 supersaturation was observed in an intensive fed-batch culture of S.cerevisiae and may be caused by an asymmetric bubble size distribution of the gas phase. We demonstrated that CO2 liquid / gas transfer cannot be described based on O2 gas / liquid transfer and that CO2 concentration must be estimated through direct measurement.The impact of CO2 on the oxidative metabolism of S.cerevisiae was investigated using chemostat cultures submitted to different step-increases of the dissolved CO2 concentrations with direct measurement of the dissolved CO2 concentration. The yeast culture showed a transient response with an increase of the specific respiration rates ranging from with a +24 to +37 % during + 2.96 mM and+5.29 mM dissolved CO2 step-increases. This transient response was followed by a long-term response characterized by a decrease of the YATP value with increasing dissolved CO2 concentrations (down to -18% when the CO2 concentration increased from 1.6 mM to 17 mM).The impact of CO2 on the onset of the Crabtree effect in S.cerevisiae was investigated using the accelerostat technique with and without CO2 enrichment. The onset of alcoholic fermentation occurred at a much lower specific growth rate (0.122 h-1) and specific oxygen consumption rate (5.2 mmoleO2.gX-1.h-1) in CO2 enriched conditions than without CO2 enrichment (0.256h-1 and 8.65 mmoleO2.gX-1.h-1 respectively). These modifications may be linked with a decreased cellular adaptability to changing environment

Lorsque la levure Saccharomyces cerevisiae pousse en aérobiose, la respiration est immédiatement réprimée après l’addition de glucose au milieu de culture. Ce phénomène est appellé ”l’effet Crabtree”. Il a été rapporté que l’inhibition du flux respiratoire est concomitant avec l’accumulation cytoplasmique des hexoses phosphates provenant de la glycolyse. Dans ce travail, la levure Saccharomyces cerevisiae a été utilisée pour chercher à identifier les événements regulatoires à court terme qui sont associés à l’effet Crabtree ainsi que le possible rôle des hexoses phosphates dans l’inhibition de la respiration. En utilisant des mitochondries isolées il a été trouvé que le glucose 6-phosphate et le fructose 6-phosphate stimulent le flux respiratoire. Cet effet est compensé par des niveaux physiologiques de fructose 1,6-biphosphate, lequel inhibe la respiration en absence des autres hexoses phosphates. Cet effet est aussi observé in situ puisqu’il est obtenu en utiisant des sphéroplastes perméabilisés de levure. La répression du flux respiratoire induite par le fructose 1,6-biphosphate est due à une inhibition de l’activité des complexes respiratoires III et IV. Les résultats suggérent que le fructose 1,6-biphosphate pourrait être un des inducteurs de l’effet Crabtree chez la levure. Il est également possible que aussi chez les cellules mammifières cet hexose phosphate puisse réguler le metabolisme des tumeurs, où l’effet Crabtree a aussi été observé. / When the yeast Saccharomyces cerevisiae grows aerobically, its respiration is immediately repressed when adding glucose to the culture media. This phenomenon has been termed ”the Crabtree effect”. It has been reported that the respiratory flux inhibition is concomitant with the cytoplasmic accumulation of the glycolysis-derived hexoses phosphates. In this work, S. cerevisiae was used to investigate the short-term regulatory events associated to the Crabtree effect and the role of the hexoses phosphates during the respiratory inhibition. Using yeast isolated mitochondria it was found that glucose 6-phosphate and fructose 6-phosphate stimulate the respiratory flux. This was counteracted by physiological concentrations of fructose 1,6-biphosphate, which also inhibits respiration in the absence of the other two hexoses phosphate. This occurs in situ, as the effect mediated by the fructose biphosphate was also observed in yeast permeabilized spheroplasts. The respiratory flux repression mediated by fructose 1,6-biphosphate is due to an inhibition of the activity of respiratory complexes III and IV. The results suggest that fructose 1,6-biphosphate could be one of the Crabtree effect inducers in yeast. In mammals, this hexose phosphate might regulate as well tumour cell metabolism, where the Crabtree effect has also been observed.

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques protégeant l’extrémité des chromosomes de la dégradation et assurant la réplication de l’ADN terminal. En effet, de nombreuses protéines de réplication sont impliquées dans le maintien de ces structures, comme le complexe RPA (Replication Protein A). Ce complexe très conservé chez les eucaryotes se fixe à l’ADN simple brin et est impliqué dans la réplication, les mécanismes de recombinaison et la réparation de l’ADN. Chez S.pombe, la mutation ponctuelle de la sous-unité RPA1 (Rpa1-D223Y) provoque le raccourcissement des télomères. Dans cette étude, nous montrons que cette mutation provoque l’accumulation de structures aberrantes de haut poids moléculaire aux télomères corrélant avec une présence persistante de Polα aux télomères suggérant une accumulation de structures sur le brin riche en G. Nous avons pu mettre en évidence que la surexpression d’hélicases de la famille Pif1 incluant S.cerevisiae Pif1 et PIF1 humain ainsi que Pfh1 (S.pombe) sont capable de restaurer une longueur de télomères sauvage dans mutant rpa1-D223Y. Ces résultats suggèrent que RPA pourrait empêcher l’accumulation de G4 au niveau du brin retardé télomérique afin de faciliter l’élongation des télomères par la télomérase. De plus, des expériences in vitro ont montré que la mutation correspondante de RPA1 humain réduisait spécifiquement l’affinité de RPA pour le simple brin télomérique humain dans les conditions ou il forme des G4.Enfin l’étude de la stabilité de séquences répétées formant des G4 (minisatellite CEB25), chez S.pombe, a permis de renforcer l’hypothèse selon laquelle RPA pourrait empêcher la formation ou aiderait à la résolution de G4. / Telomeres are nucleoprotein structures that protect chromosome ends from degradation and ensure replication of the terminal DNA. In fact, many of replication proteins are involved in telomere maintenance, like RPA (Replication Protein A). RPA is a highly conserved heterotrimeric single-stranded DNA-binding protein involved in DNA replication, recombination and repair. In S. pombe a mutation in the largest RPA subunit (Rpa1-D223Y) leads to substantial telomere shortening. In this study, we found that the D223Y mutation leads to the accumulation of aberrant secondary structures at telomeres. The presence of these secondary DNA structures correlates with a high association of Polα with telomeres suggesting that this mutation impairs lagging strand (G-rich) telomere replication. Strikingly, heterologous expression of the budding yeast Pif1 known to efficiently unwind G-quadruplex, human PIF1 and Phf1 (homolog of Pif1 in S.pombe) rescue the telomeric length defects of the D223Y cells. Furthermore, in vitro data show that the identical D to Y mutation in human RPA specifically affects its ability to bind G-quadruplex. We propose that RPA prevents the formation of G-quadruplex structures at lagging strand telomeres to facilitate telomerase action at telomeres. Furthermore, the study, in S.pombe, of the stability of G-rich repeat sequences (minisatellite CEB25) as known to form G4 enforce the hypothesis that RPA can prevents the formation of G4 or helps to solve this structure.